标准品、试剂对血清蛋白标准化测定影响的探讨

为了提高血清蛋白测定的准确性 ,在实验方法标准化的前提下〔1〕,分别用国内外五个厂家的蛋白标准品定标 ,以溴甲酚绿法和双缩脲法对其余四个厂家的蛋白标准品和质控血清进行平行对比测定 ,拟筛选出一个较好的标准品及试剂 ,测定结果经统计学分析显示 :以自配试剂 ,上海生物制品研究所的蛋白标准品定标 ,用于临床检测血清总蛋白 (平均 VIS68.2 )和白蛋白 (平均 VIS37.2 )准确、经济、实用。     

动力学法在酶联免疫吸附试验定量检测中的应用

目的研究动力学法在酶联免疫吸附试验（ELISA）定量检测中的应用。方法对甲胎蛋白（AFP）标准品随时间变化的吸光度值进行连续监测,并分别用动力学法及终点法建立AFP定量标准曲线。结果 AFP不同浓度标准品在5min内的吸光度值与显色时间呈正比。动力学法的标准曲线中标准品浓度与吸光度值变化率呈直线关系。结论在ELISA定量检测过程中,动力学法与传统终点法相比存在明显优势。     

血浆蛋白质的检测和临床价值研究进展

血浆为各种蛋白质、有机和无机离子、水等组合起来的复杂混合物，其中血浆蛋白至少有200余种，分离出纯品已有100余种，较重要者有50余种。本文仅就近年来发展最快和临床最受重视的几种血浆蛋白介绍于后，供参考。 1 各主要血浆蛋白质检测方法 血浆蛋白的检测方法进展极快，这里只能择其重要而常用者作简略介绍，详细方法还得参阅专论。 1．1 琼脂内免疫单扩散技术 这是目前应用最广的定量方法，国内用此技术大量检测Ig、补体等，近来一些新的球蛋白如铜兰、转铁等，亦应用本法，单扩散技术简单、实用，缺点是灵敏度不够，时间也较长，受检…     

神经元蛋白含量测定方法的比较研究

目的为培养的小鼠神经元蛋白质含量测定选择最佳方案。方法采用四种较为常用的蛋白质含量测定方法:考马斯亮蓝法(Bradford)、酚试剂法(Lowry)、二喹啉甲酸(BCA)和Bio-Rad DC法分别对培养的小鼠神经元全细胞蛋白质提取样品进行测定,并对结果进行比较。结果蛋白质含量测定及重复性实验对比分析可见,用Bradford、BCA和Bio-Rad DC法测定神经元蛋白质样品,结果均较稳定;而Lowry法不稳定。结论确定神经元蛋白含量的最佳测定方法为Bio-Rad DC法。     

应用定量蛋白质组学技术对IgA肾病肾组织蛋白的鉴定和定量分析

目的应用相对和绝对定量的同位素标记(iTRAQ)结合液相色谱和质谱技术,对IgA肾病肾组织蛋白质进行鉴定和定量分析。方法利用iTRAQ技术分析IgA肾病肾组织及正常对照肾组织中的蛋白质组信息,寻找显著差异表达蛋白质。结果共鉴定1 860个蛋白,其中287个蛋白在IgA肾病肾组织中显著上调表达,287个蛋白显著下调表达,最终筛选出9个明显上调蛋白和8个明显下调蛋白。结论定量蛋白质组学技术可有效地用于组织蛋白鉴定和相对定量,利于更好地了解蛋白质与IgA肾病发病机制的关系。     

Stathmin和CrkL蛋白在耐阿霉素的K562白血病细胞中表达上调

本研究应用蛋白质组学方法比较白血病K562细胞及其耐阿霉素的K562/A02细胞中蛋白质表达谱的差异,筛选新的耐药相关蛋白。利用荧光差异双向电泳（2D-DIGE）技术分离K562细胞及K562/A02细胞的总蛋白,用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/MS）对差异表达蛋白质点进行鉴定,搜索蛋白质数据库,获得差异蛋白质的信息,并用蛋白免疫印迹法和实时荧光定量PCR法在蛋白质水平和mRNA水平对差异蛋白质进行验证。结果显示,经过DIGE技术和质谱分析,鉴定出8个蛋白质在耐阿霉素的K562细胞中表达有差异,其中2个表达下调,6个表达上调,它们分别参与细胞能量代谢、细胞增殖、细胞凋亡、细胞信号转导和基因转录等。在表达上调的蛋白中挑选Stathmin和CrkL蛋白,在K562及其耐药细胞株中进行了蛋白免疫印迹实验,结果与双向电泳结果一致;实时荧光定量PCR显示,CrkL在mRNA水平变化与在蛋白质水平变化一致,而Stathmin在mRNA水平变化与蛋白质水平变化不完全一致。结论：白血病K562细胞及其耐阿霉素K562/A02细胞蛋白质表达谱有差异,Stathmin和CrkL蛋白可能与耐药有关,值得进一步探讨。     

ALT、AST测定

酶是由活细胞产生的具有催化作用的一类特殊蛋白质。酶浓度的测定方法分为相对定量法和绝对定量法两大类。绝对定量法是测定酶蛋白含量或酶分子浓度的，如酶的免疫化学测定法和活性中心滴定法。     

血清白喉和破伤风抗体检测方法的建立及应用

目的建立定量检测抗白喉抗体、抗破伤风抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法。方法分别用纯化的白喉类毒素、破伤风类毒素作为包被抗原,白喉、破伤风人源血清抗体标准品作为标准品,对供试品和标准品的剂量反应曲线进行拟合,以平行线法建立定量检测抗白喉抗体(Anti-DT)、抗破伤风抗体(Anti-TT)的ELISA方法。并进行方法学验证和应用研究。结果两种定量检测ELISA方法的验证结果均符合规定。定量检测Anti-DT的ELISA方法的定量限为0.084 mU/mL,回收率为97.6%,批内变异系数(CV)≤3.40%,批间CV≤5.05%;检测Anti-TT方法的定量限为0.175mU/mL,回收率为97.5%,批内CV≤2.42%,批间CV≤5.58%。应用上述两种ELISA方法,对白喉破伤风疫苗用于婴儿基础免疫后的免疫原性进行了检测分析和评价。结论所建立的白喉、破伤风血清抗体ELISA检测方法,准确度高,重复性好,适合于一般实验室开展工作,可用于白喉破伤风疫苗免疫接种后的血清学效果评价和白喉破伤风疾病的流行病学研究。     

血浆特种蛋白的组合检测及其临床意义

血浆蛋白是由担负不同生理功能的多种蛋白质所组成,已知血浆蛋白有近300种,分离为纯品达100多种,它们来源于组织细胞,执行着许多功能。 血浆蛋白的检测包括盐析法、指示剂法、电泳法、免疫电泳法和免疫化学法,特种蛋白是指用免疫学或其他特种手段测定的血清蛋白质成分。 美国Beckman公司推出的新一代全自动特定蛋白分析系统(Array360)和开发的高纯度单克隆试剂,使用速率散射比浊法进行全自动操作,有较高特异性和灵敏度,且能快速、简便为疾病诊断和治疗监测提供信息。现将常用的检测组合临床意义概述如     

荧光定量PCR检测梅毒螺旋体方法的建立及初步应用

目的采用二聚体蝎型探针技术建立一种高敏感性和特异性的检测梅毒螺旋体(TP)的荧光定量聚合酶链反应(PCR)方法。方法根据TP特异性外膜蛋白Gpd的基因序列设计引物和荧光探针,采用基因工程技术构建可用于TP定量的标准品,优化荧光定量PCR的反应体系和反应条件,建立检测TP的二聚体蝎型探针定量PCR。采用本研究建立方法和商品化荧光定量PCR试剂盒检测40例临床标本,对比分析检测结果的统计学差异。结果成功构建了TP重组质粒标准品和TP的二聚体蝎型探针定量PCR,该方法线性范围为101~108 copy/mL,灵敏度为10copy/mL,特异性和敏感性均为100.0%;二聚体蝎型探针定量PCR对疑似梅毒病例阳性检出率显著高于目前商品化Taqman荧光定量PCR试剂盒(82.5%vs 62.5%,P0.05)。结论成功建立了二聚体蝎型探针荧光定量PCR快速检测TP的方法,为临床上TP的早期诊断和防控奠定了基础。     

控制微流控芯片电泳中的蛋白质吸附

目的探讨抑制微流控芯片电泳中蛋白质的吸附,以提高芯片电泳蛋白质的分离效率及重现性。方法以蛋白质标准品、临床尿液标本为实验对象,通过提高缓冲液的pH值、在缓冲液中加入适当的添加剂等方法,进行芯片蛋白电泳,并与常规琼脂糖电泳结果进行比较。结果使用pH值10.5硼酸缓冲液,转铁蛋白连续进样出峰时间的变异系数(CV)为5.22%;在pH值10.5硼酸缓冲液中加入1%的乙胺,能提高芯片电泳检测尿液蛋白的分离度、重现性,电泳结果与REP全自动电泳仪结果一致。结论使用该方法可有效地抑制芯片泳道壁对蛋白质的吸附,分离效率大为提高。     

人免疫球蛋白类制品甲肝抗体效价检测方法的探讨

目的了解我国人免疫球蛋白制品中甲肝抗体水平,以及国外免疫球蛋白类制品甲肝抗体效价情况,为《中国药典》三部2010年版增订免疫球蛋白类制品成品甲肝抗体效价测定提供依据。方法采用不同实验组显著性差异分析方法,采用不同的标准品,对酶联法(ELISA)和放免法(R IA)检测甲肝抗体进行比较。对人免疫球蛋白类制品中的甲肝抗体效价进行分析评价。结果在相同标准品前提下,酶标法(ELISA)的检测结果与放免法(R IA)的检测结果有显著差异,ELISA法测得结果明显高于R IA法。甲肝抗体的稳定性较好,生产过程对其效价影响较小。结论放免法(R IA)和酶标法(ELISA)检测甲肝抗体效价都具有可行性,但检测血浆应采用血浆标准品、检测制品应采用人免疫球蛋白标准品。甲肝抗体与蛋白质含量呈正相关。     

建立检测产气肠杆菌的TaqMan荧光定量PCR和普通PCR方法

目的 建立敏感、特异的普通聚合酶链反应(PCR)方法和TaqMan 荧光定量PCR方法对产气肠杆菌进行快速检测。方法 以产气肠杆菌组氨酸脱氢酶基因(hdc)为靶基因设计引物以及TaqMan FAM探针,建立对产气肠杆菌进行检测的普通PCR方法和TaqMan 荧光定量PCR方法,并评价该方法的特异性、灵敏性和稳定性。结果 普通PCR和TaqMan 荧光定量PCR方法均能对产气肠杆菌进行特异检测;普通PCR方法对质粒标准品和粪便模拟标本的检测下限分别为 100 copies/l和1.0105 cfu/g,TaqMan 荧光定量PCR方法对质粒标准品和粪便模拟标本的检测下限分别为33 copies/l和1.0104 cfu/g;TaqMan 荧光定量PCR方法对质粒标准品和粪便模拟标本检测的扩增曲线良好;在稳定性评价试验中,普通PCR方法的重复性良好,TaqMan 荧光定量PCR方法对质粒标准品检测Ct值的组内差异为0.15%~0.98%,组间差异为0.55%~1.63%。结论 本研究建立的检测产气肠杆菌的普通PCR方法和TaqMan 荧光PCR方法特异性好、灵敏度高,能够用于产气肠杆菌的快速检测。     

新型二聚体突变荧光引物定量检测沙眼衣原体

目的 以二聚体突变荧光引物技术为基础建立对沙眼衣原体进行定量检测的新方法.方法 以沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)基因构建重组质粒作为DNA标准品,设计二聚体突变荧光引物,优化定量PCR体系并进行性能评价;同时对148例临床生殖道标本进行检测.结果 建立的二聚体突变荧光引物的定量PCR方法,其线性范围为101～109...     

iTRAQ技术鉴定小鼠睾丸发育差异表达蛋白的研究

目的 用同量异位素标记的相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技术结合液相色谱质谱技术构建3周龄小鼠与成年小鼠睾丸蛋白差异表达谱系。 方法 分别抽提3周龄小鼠与成年小鼠睾丸总蛋白质,iTRAQ标记,液相色谱（LC）分离蛋白质,LTQ Orbitrap^{TM质谱仪进行蛋白质鉴定。 结果 鉴定出20个差异表达蛋白质,其中18个为3周龄小鼠睾丸高表达蛋白质,2个为成年睾丸高表达蛋白质。差异表达蛋白质主要参与细胞的有丝分裂、减数分裂、细胞增殖、分化、凋亡及精子发生等重要细胞事件。 结论 用目前最新的定量蛋白质组技术,构建的3周龄小鼠睾丸与成年睾丸差异表达蛋白谱系对研究睾丸功能、精子发生有一定理论价值,为定量蛋白组学技术在雄性生殖领域的应用奠定了基础。}     

Bradford比色法简便,快速测定微量蛋白

本文应用自制的Ｂｒａｄｆｏｒｄ蛋白定量试剂进行微量蛋白测定。根据Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染料能与蛋白质定量结合的特点，通过比色测知蛋白浓度。蛋白含量在１０￣１００ｍｇ／Ｌ范围内。该法的实测值与吸光度间呈良好线性关系，敏感性可达１ｍｇ／Ｌ以下，稳定性、重复性均好，批内与批间试验无明显差异（ＣＶ〈６．５）。与经典的Ｌｏｗｒｙ蛋白测定法相比，Ｂｒａｄｆｏｒｄ比色法的敏感度和重复性均优于前者，两种方法的相关系数     

定量蛋白质组学技术筛选前列腺癌患者尿液中差异表达蛋白价值

目的探讨同位素标记相对和绝对定量蛋白质组学技术在含有前列腺液的尿液样本中筛选前列腺癌差异表达蛋白质的价值。方法良性前列腺增生患者10例(良性增生组)、高级别前列腺上皮内瘤变患者10例(上皮内瘤变组)、前列腺癌患者10例(前列腺癌组),取3组患者前列腺按摩后的前段尿液标本,并将3组患者尿液样本进行等体积混合,应用同位素标记相对和绝对定量技术联合液相串联质谱分析技术进行蛋白质鉴定和相对定量;检索Gene Ontology Database(GO数据库),对筛查得到的蛋白质所参与生物学过程及分子功能进行生物信息学分析。结果含有3组前列腺液的尿液混合样本中共鉴定到蛋白质2 370种;相对于良性增生组,前列腺癌组患者表达差异倍数在2倍以上的蛋白质共52个,其中表达上调蛋白20个,表达下调蛋白32个;相对于良性增生组,上皮内瘤变组患者表达差异蛋白质共60个,其中表达上调蛋白22个,表达下调蛋白38个;鉴定蛋白质主要参与细胞过程、单器官过程和生物功能调节等生物功能,及结合功能、催化活性、酶调节活性等分子功能。结论定量蛋白质组学技术有助于鉴定前列腺癌相关的尿液差异表达蛋白质。     

蛋白质印迹法检测GIRK4在SD大鼠肾脏组织的表达

目的探讨GIRK4基因在健康SD大鼠肾脏组织的表达水平。方法采用蛋白质印迹法(Western-blot-ting)对健康SD大鼠肾脏组织GIRK4蛋白表达进行定量分析。结果 GIRK4基因蛋白在健康SD大鼠肾脏组织相对表达量为3.37±0.68。结论从蛋白质水平对GIRK4基因在健康SD大鼠肾脏组织表达的定量研究,将为探索GIRK4基因与肾脏生理功能及其相关临床疾病的关系奠定基础。     

荧光定量RT-PCR检测沙门氏菌方法的建立

目的建立沙门氏菌实时荧光定量PCR的快速检测方法 ,探讨该方法的可行性和应用价值。方法根据沙门氏菌fimY基因序列设计引物和探针,采用基因重组技术构建用于沙门氏菌检测的定量标准品,建立实时荧光定量PCR检测沙门氏菌的方法。结果成功构建了沙门氏菌重组质粒标准品和沙门氏菌实时荧光定量PCR方法 ;通过特异性、敏感性、稳定性和重复性验证,结果表明具有较好的特异性、敏感性、稳定性和重复性;对模拟标本与分离培养对比,二者符合率为100%。结论沙门氏菌实时荧光定量PCR检测方法的建立,为食源性沙门氏菌污染的快速检测提供依据,可应用于食品卫生监管、商品检验检疫以及临床诊断等。     

ELISA法检测抗病毒IgM抗体的方法及问题

ELISA法是目前病毒性疾病诊断的最常用方法。它是一项定位、定性和定量的综合性技术，具有特异、快速、敏感、方便等优点，便于基层使用。IgM抗体是蛋白质抗原反应中首先产生的抗体，可用来进行病人的早期诊断，也是病毒近期感染的重要感染指标。