小鼠金属硫蛋白 Ⅰ cDNA编码序列的克隆及其在昆虫细胞中的表达

将质粒ｐＢＸ－ＭＴ上的小鼠ＭＴ－ⅠｃＤＮＡ片段切下作为模板,通过ＰＣＲ方法删除该片段的非编码序列,将编码序列克隆到质粒ｐＢＳ－ＳＫ中,经ＤＮＡ序列测定后证明其克隆序列正确．再将ＭＴ－ⅠｃＤＮＡ编码序列插入到转移载体ｐＢａｃＰＡＫ８的ＢａｍＨⅠ和ＥｃｏＲⅠ位点之间,通过磷酸钙／ＤＮＡ共转染方法将其导入昆虫细胞Ｓｆ９中,以Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和ＤｏｔＥＩＡ方法对表达产物进行了检测,表达量为１ｍｇ／Ｌ     

用PCR扩增和克隆马立克氏病病毒糖蛋白D基因

用ＰＣＲ技术,从ＧＡ株马立克氏病病毒（ＭＤＶ）感染的成纤维细胞（ＧＥＦ）基因组ＤＮＡ中扩增出ＭＤＶ糖蛋白Ｄ（ｇＤ）抗原基因片段的约１３００ｂｐ编码序列,将该ｐｃＲ扩增的产物于ＥｃｏＲＩ和Ｋｐｎｌ位点克隆到ｐＵＣ１８质粒载体中,在以ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（ｄｉｇ）标记的ｇＤＰＣＲ产物作为探针,进行原位杂交初步筛选到阳性重组质粒克隆,再根据酶切分析筛选到含ＭＤＶｇＤ基因的重组质粒ｐ１８ＭｇＤ。将ｐ１８ＭｇＤ质粒ＤＮＡ用ｄｉｇ标记后,在Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ中,该探针能识别ＭＤＶ基因组ＤＮＡ的ＢａｍＨＩ－Ａ克隆中的Ａ片段ＤＮＡ。酶切位点分析表明,该ｇＤ克隆也和已发表的ＭＤＶ的ＲＢＩＢ株ｇＤ一样,不含有ＥｃｏＲⅠ、ＨｉｎｄⅢ、ＰｓｔⅠ、ＳｍａⅠ、ｐｖｕⅡ等酶切位点。证明该重组质粒是ＭＤＶｇＤ克隆。     

hBMP—2cDNA在COS细胞和小鼠肌肉中的表达

研究了骨形态发生蛋白ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ在ＣＯＳ细胞和小鼠肌肉中的表达的情况,从ｐＳＰＳ６５ＢＭＰ－２质粒中回收ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ,删除５端的非翻译序列,插入ｐＳＶＬ载体中,构建了含有ＢＭＰ－２全长编码序列的重组表达质粒ｐＳＶＬＢＭＰ－２将表达质粒导入ＣＯＳ－７细胞中,细胞ＲＮＡ点杂交结果表明,转染ＢＭＰ－２基因的细胞内ＢＭＰ－２的ｍＲＮＡ水平明显升高,细胞培养上清的ＥＬＩＳＡ显示,转染ＢＭＰ－２ｃ     

hBMP－2cDNA在COS细胞和小鼠肌肉中的表达

研究了骨形态发生蛋白ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ在ＣＯＳ细胞和小鼠肌肉中的表达的情况,从ｐＳＰＳ６５ＢＭＰ－２质粒中回收ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ,删除５＇端的非翻译序列,插入ｐＳＶＬ载体中,构建了含有ＢＭＰ－２全长编码序列的重组表达质粒ｐＳＶＬＢＭＰ－２。将表达质粒导入ＣＯＳ－７细胞中,细胞ＲＮＡ点杂交结果表明,转染ＢＭＰ－２基因的细胞内ＢＭＰ－２的ｍＲＮＡ水平明显升高;细胞培养上清的ＥＬＩＳＡ显示,转染ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ后,细胞分泌产生的ＢＭＰ－２显著增加。小鼠实验发现,在肌肉内用注射法导入ＢＭＰ－２重组质粒后,局部组织内ＢＭＰ－２的ｍＲＮＡ转录水平也明显提高。     

重组FAS分子的表达、纯化及抗体制备

用ＰＣＲ法扩增出编码人ＦＡＳ分子胞外区的ｃＤＮＡ片段,直接克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体上,经ＤＮＡ序列测定后,再插入到谷胱甘肽转硫酶（ＧＳＴ）融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－ＫＧ的ＥｃｏＲⅠ和ＳａｌⅠ位点之间,构成重组质粒ｐＫＧ－ｈＦＡＳ,将此质粒导入大肠杆菌,经ＩＰＴＧ诱导后获得ＧＳＴ－ｈＦＡＳ重组融合蛋白的表达,用谷胱甘肽偶联的Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ经亲合层析获得纯化的ＧＳＴ－ｈＦＡＳ蛋白,经凝血酶酶切和二次亲合层析去除ＧＳＴ部分,得到纯化的ＦＡＳ蛋白．用纯化的ＦＡＳ抗原免疫家兔制备了抗ＦＡＳ抗体,经检测发现抗ＦＡＳ抗体能诱导Ｕ９３７细胞发生细胞凋亡     

日本血吸虫(中国大陆株)谷胱甘肽转移酶编码区基因的体外扩增、克隆及在原核细胞的高效表达

为表达、获取日本血吸早谷胱甘肽转移酶（ＳｊＧＳＴ）基因工程重组蛋白,以日本血吸虫（中国大陆株）ｃＤＮＡ为模板,设计、合成特定寡核苷酸引物,ＲＴ－ＰＣＲ法扩增ＧＳＴ编码基因序列,将扩增产物连接ｐＧＥＭ－Ｔ克隆载体,再亚克隆到真、原核表达质粒ｐＢＫ－ＣＭＶ中,转染大肠杆菌ＸＬ１－ｂｌｕｅ,经ＩＰＴＧ诱导后用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表达效果。结果 ＲＴ－ＰＣＲ法特异性扩增出日本血吸虫ＧＳＴ编码区基因片段,其     

粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子／白细胞介素—3融合蛋白的表达研究

利用ＰＣＲ扩增得到粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、白细胞介素－３（ＩＬ－３）完整基因片段,将其分别克隆ｐＧＥＭ－Ｔ构建成ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ－３融合蛋白基因,ＤＮＡ序列与设计预期一致。将得到的融合蛋白基因克隆对７２ＲＮＡ聚合酶表达载体ｐＴ７ｚｚ,得到表达质粒ｐＦｕ,经转化至表达宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）,在ＩＰＴＧ诱导下获得融合蛋白目的产物的直接表达。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳鉴     

大肠杆菌cai DE的基因克隆与表达

从Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＣ４１００菌体的染色体ＤＮＡ中利用鸟枪法克隆含编码肉碱消旋酶及相关因子的ｃａｉＤＥ基因片段,并经序列分析验证,由重组质粒ｐｌＸ３９３亚克隆得到ｐＤＳＷ２重组表达质粒,后者转入Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株中是丙基硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导,在聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）上分子量为３０ｋＤ和２４ｋＤ附近可见明显的表达蛋白带。     

抑瘤素M cDNA的克隆及表达研究

抑瘤素Ｍ是一种我功能的细胞生长调节因子,从ＰＭＡ刺激后的Ｕ９３７细胞系提取总ＲＮＡ,采用逆转录－ＰＣＲ方法分离到了抑瘤素Ｍ的ＣＤＮＡ;将抑瘤素Ｍ的ＣＤＮＡ克隆到质粒ＰＵＣ１９中,筛选三个阳性克隆进行序列分析,与国外报导序列完全一致;将抑瘤素Ｍ的ＣＤＮＡ克隆到质粒ＰＢＶ２２０后再转化ＤＨ５α进行模拟表达,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明有ＯＳＭ表达,表达量约占细菌总蛋白５％,经过初步纯化的ＯＳＭ能明显抑制Ａ     

苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)大立方形多角体突变株的分子生物学研究

利用空斑技术,从既能形成多角体又含ＴＫ酶基因的苜蓿丫纹夜蛾重组核型多角体病毒ＡｃＭＮＰＶ－ＴＫ中,纯化了一株形成大立方形多角体的病毒突变株ＡｃＭＮＰＶ－ＴＫｍｔ５１３。用ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔⅠ、ＢｇｌⅡ及ＫｐｎⅠ等限制性内切酶对它做了酶切分析,并克隆了多角体蛋白全基因及其侧翼部分的片段。对所克隆的部分全序列测定结果,发现在多角体蛋白基因读码框内只出现了一个碱基的突变,导致了第２５位的氨基酸密码子由ＧＧＴ变为ＧＡＴ,该位氨基酸由甘氨酸（Ｇｌｙ）变为天冬氨酸（Ａｓｐｑ）还利用ＰＣＲ技术扩增出突变了的多角体蛋白基因部分片段,并将它克隆入转移载体质粒ｐＥＶ５５,与不形成多角体的重组病毒ＴｎＮＰＶ－ＨＢｓＤ４ＤＮＡ共转染Ｓｆ９细胞,结果产生同样的大立方形多角体病毒。     

恒河猴Fas基因的克隆

目的研究猴艾滋病发病机制中细胞凋亡的作用,克隆凋亡相关基因Ｆａｓ的ｃＤＮＡ序列。方法从恒河猴腹股沟淋巴结中提取总ＲＮＡ,根据人的Ｆａｓ ｃＤＮＡ序列设计上、下游引物,通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增出目的ｃＤＮＡ片段,将这一片段克隆到ｐＧＦＭ－Ｔ Ｅａｓｙ载体中,筛选阳性克隆并进行序列测定。结果首次克隆了恒河猴Ｆａｓ基因,编码序列为１００５ ｂｐ,将其序列提交ＧｅｎＢａｎｋ,收录号为ＡＹ００７５７２。结论克隆的新序列与ＧｅｎＢａｎｋ已收录的人和食蟹猴的Ｆａｓ基因在编码序列的长度上稍有区别,人的编码序列为１００８ｂｐ,食蟹猴的为９９６ ｂｐ。     

酵母豆蔻酰辅酶A：蛋白质N端转酰基酶基因的克隆与表达

利用ＰＣＲ技术,从酵母染色体中扩增得到酵母豆蔻酰－ＣｏＡ：蛋白质Ｎ端转酰基酶（ＹＳＣＮＭＴ）基因,并克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋载体中。由ＤＮＡ全序测定表明,获得了ＹＳＣＮＭＴ编码基因。进一步构建了Ｔ７Ｐｒｏｍｏｔｅｒ控制下的含上述完整ＹＳＣＮＭＴ编码基因的表达质粒ｐＭＦＴ７－５－ＮＭＴ,转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,进行ＩＰＴＧ诱导表达研究。通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,观察到一与理论分子量一致的诱导条带（约５３ｋＤ）,占全菌蛋白的３９％左右,且可溶性部分约占上清液中全部蛋白的３４％。经一步Ｐ１１磷酸纤维素阳离子交换柱层析,将其纯化到纯度达９７％以上．纯化的表达产物经Ｎ端氨基酸序列分析,所测定的Ｎ端５个氨基酸的序列,与从克隆的ＹＳＣＮＭＴ基因推出的氨基酸序列完全一致（不含Ｎ端Ｍｅｔ）。对所得的ＹＳＣＮＭＴ进行酶活力鉴定,观察到了明显的活力。     

人TIMP—3cDNA的克隆,表达及其抗血管生成作用

从人新鲜的胎盘组织中提取总ＲＮＡ,以ＲＴ－ＰＣＲ法获取了人组织金属蛋白酶抑制－３成熟蛋白的ｃＤＮＡ。序列分析表明,ＴＩＭＰ－３成熟蛋白含有１８８个氨基酸残基,其中１２个半胱氨酸残基在ＴＩＭＰ家族中高度保守。将人ＴＩＭＰ－３ｃＤＮＡ插入含７启动子的质粒ｐＥＴ－２４构建表达质粒ｐＥＴ－ＴＩＭＰ３,转化大肠杆菌ＢＬ２１,筛选表达菌株ＢＬＴＩＭＰ３。     

利用突变的绿化荧光蛋白基因为标记构建新型克隆载体

将三位点替换突变的绿色荧光蛋白（ＧＦＰ－Ｓ６５Ｔ、Ｖ６８Ｌ、Ｓ７２Ａ）基因插入到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）的ＸｂａⅠ和ＳａｃⅠ之间,构建为新型的克隆载体ｐＧｒｅｅｎＬＤ。此质粒载体在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达后使菌落在日光下呈现黄绿色,而在长波紫外光照射下呈现亮绿荧光,当外源ＤＮＡ片段插入该载体的多克隆位点使ｇｆｐ基因表达受阻时,转化的Ｅ．ｃｏｌｉ菌落为白色。因此可以用Ｅ．ｃｏｌｉ菌落黄绿色／绿色     

日本血吸虫26kD抗原基因在BCG中的表达

研究了外源基因日本血吸虫２６ｋＤ抗原（Ｓｊ２６ＧＳＴ）在卡介苗（ｂａｃｉｌｕｓＣａｌｍｅｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ,ＢＣＧ）、耻垢分枝杆菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）和大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中的表达．运用重组ＤＮＡ和聚合酶链反应（ＰＣＲ）等分子生物学技术,以表达Ｓｊ２６ＧＳＴ的Ｅ．ｃｏｌｉｐＧＥＸ衍生质粒为模板,经ＰＣＲ得到编码Ｓｊ２６ＧＳＴ的全长ｃＤＮＡ片段．将其按正确的阅读框顺序,克隆到人结核杆菌热休克蛋白（ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ,ＨＳＰ）７０的启动子下游,再将ＨＳＰ７０启动子和Ｓｊ２６ＧＳＴ基因一起亚克隆到Ｅ．ｃｏｌｉ－分枝杆菌穿梭质粒ｐＢＣＧ－２０００中,得到Ｅ．ｃｏｌｉ－分枝杆菌穿梭表达质粒ｐＢＣＧ－Ｓｊ２６．ｐＢＣＧ－Ｓｊ２６电转化入ＢＣＧ和Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓｍｃ２１５５中表达Ｓｊ２６ＧＳＴ抗原,所表达的天然重组Ｓｊ２６ＧＳＴ（ｒＳｊ２６ＧＳＴ）为可溶性蛋白,在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上分子量为２６ｋＤ处可见明显的表达蛋白带．其表达量分别占ＢＣＧ和Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ菌体总蛋白的１５％和１０％．可见,Ｓｊ２６ＧＳＴ基因能在ＢＣＧ中高效表达．     

对TMV不同抗性番茄品种叶绿体DNA限制性差异片段的克隆

对ＴＭＶ不同抗性番茄品种ｃｔ－ＤＮＡ经限制性内酶切后,将所获得的差异片段Ｂａｍ６克隆到质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＳＫ中,经筛选、菌落原位杂交、斑点杂交及电泳鉴定,证明重组体为抗性品种Ｂａｍ６差异片段克隆,对探讨番茄ｃｔ－ＤＮＡ与抗ＴＭＶ的关系有重要意义。     

外源TGF—β1基因在小鼠ES细胞中的表达及其对细胞分化的影响

本文利用逆转录病毒载体Ｄｏｌ,在其ＢａｍＨＩ酶切位点插入猪ＴＧＦ－β１ １．７ｋｂｃＫＮＡ,构建成表达质粒,并用磷酸钙沉淀法将该质粒ＤＮＡ转染到小鼠ＥＳ－５细胞,经Ｇ４１８筛选获得抗Ｇ４１８的ＥＳ－５细胞克隆（ＥＳ－Ｔ）,经ＲＮＡ点杂交,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交证明有６个细胞克隆能表达外源猪ＴＧＦ－β１的ｍＲＮＡ,其中两个杂交信号较强的克隆进一步用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交,也证明猪ＴＧＦ－μ     

利用突变的绿色荧光蛋白基因为标记构建新型克隆载体

将三位点替换突变的绿色荧光蛋白（ＧＦＰ＿Ｓ６５Ｔ、Ｖ６８Ｌ、Ｓ７２Ａ）基因插入到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）的ＸｂａⅠ和ＳａｃⅠ之间,构建为新型的克隆载体ｐＧｒｅｅｎＬＤ。此质粒载体在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达后使菌落在日光下呈现黄绿色,而在长波紫外光照射下呈现亮绿荧光,当外源ＤＮＡ片段插入该载体的多克隆位点使ｇｆｐ基因表达受阻时,转化的Ｅ．ｃｏｌｉ菌落为白色。因此可以用Ｅ．ｃｏｌｉ菌落黄绿色／绿色荧光的消失作为检测指标来筛选含有重组质粒的克隆。     

抗真菌蛋白Rs—AFPs基因在大肠杆菌中的表达

将抗真菌蛋白Ｒｓ－ＡＦＰ１和Ｒｓ－ＡＦＰ２全长ｃＤＮＡ插入表达质粒ｐＥＴ－２２ｂ／ＮｃｏＩ＋ＳａｃＩ位点,构建成融合蛋白表达载体ｐＲＡＦ１和ｐＲＡＦ２．将不含信号肽编码序列的Ｒｓ－ＡＦＰ１和Ｒｓ－ＡＦＰ２ｃＤＮＡ分别插入ｐＥＴ－２２ｂ／Ｎｃｏｌ＋Ｓａｃｌ和ｐＥＴ－２２ｂ／Ｎｄｅｌ＋ＳａｃＩ位点,构建成不含信号肽序列的融合蛋白表达载体ｐＲＡＦ３、ｐＲＡＦ４和非融合蛋白表达载体ｐＲＡＦ５和ｐＲＡＦ６．将构建的上述各种表达载体转化Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１,挑菌落培养,ＩＰＴＧ诱导,使Ｒｓ－ＡＦＰｓ基因得到表达,并用体外抑菌试验检测表达产物的活性,结果表明,各种表达载体的表达产物均具有不同程度的抑菌活性,其中,ｐＲＡＦ３和ｐＲＡＦ４表达产物的抑菌活性较明显．     

蓝舌病病毒Z1株VP7基因的克隆及序列分析

用ＲＴ－ＰＣＲ扩增我国蓝舌病毒Ｚ１株的ＶＰ７基因,直接将其克隆至ｐＧＥＭ－Ｔ载体中,用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ分析经蓝／白斑筛选和ＰＣＲ鉴定的重组质粒,用ＤＩＧ标记克隆片段制成探针与病毒基因组进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ杂交,证明插入片段为ＢＴＶ ＶＰ７基因特异性片段。采用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧终止法测定ｃＤＮＡ片段的核苷酸序列,将这一序列与国外已发表的９株蓝舌病毒及相关的环状病毒的ＶＰ７基因进行了比