酸性木聚糖酶产生菌XYW5的筛选及酶学性质

【目的】选育优良的产酸性木聚糖酶的微生物,考察酸性木聚糖酶的酶学性质(尤其是pH值为4.0),为实现纤维素乙醇低成本清洁生产打下基础。【方法】从广西大学农场采集土壤,富集后经产酸性木聚糖酶的培养,比较酸性木聚糖酶酶活力,选育酸性木聚糖酶高产菌株,鉴定菌种,分析酶学性质。【结果】筛选出产酸性木聚糖酶酶活力较高的菌株XYW5。扩增菌株XYW5的ITS rDNA序列,经测序分析比对,将其初步鉴定为日本曲霉Aspergillus japonicus XYW5。菌株XYW5产酸性木聚糖酶和酸性木糖苷酶的酶活力最高分别达(26. 26±0. 97)U/mL和(0.63±0.02) U/mL,比活力分别为(85.50±0.63) U/mg和(1.80±0.01) U/mg;其酸性木聚糖酶最适温度和最适pH值分别为65℃和6.5,酸性木糖苷酶最适温度和最适pH值分别为70℃和4.5;酸性木聚糖酶兼有酸性CMCase酶活力,达到8.54 U/mL。【结论】菌株XYW5所产的酸性木聚糖酶具有开发成为优良工业酸性木聚糖酶的潜力。     

调控pH值提高木聚糖酶活力的研究

通过控制产酶过程ｐＨ 值能有效提高里氏木霉木聚糖酶活力。结果表明,当控制产酶ｐＨ 为４ ．０ 时,有利于提高木聚糖酶活力,且此ｐＨ 对提高β－ 木糖苷酶活力的影响更大。ｐＨ 调控时间不宜过长,一般应以控制１ ～２ ｄ 后让其自由发展为宜。     

产纤维素酶新菌株的筛选及其产酶特性研究

【目的】筛选分离新的纤维素酶产酶菌株,并对其生长特性和产酶特性进行研究。【方法】从堆肥样品中分离得到一株产纤维素酶菌株,定名为CP1,利用16SrRNA序列对比和Biolog微生物鉴定系统进行鉴定。通过测定菌株生长速率确定其最适生长条件。采用CMC发酵培养基进行纤维素酶的研究,确定其产酶曲线。测定粗酶液最适作用温度和pH值,热稳定性和金属离子对其影响。【结果】经鉴定该菌株为梭形芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis),其最适生长温度为30℃,最适生长pH值为6。在含CMC-Na的培养基培养,该菌株的生长与产酶同步进行,培养48h菌株生长量达到最大,培养液的CMC酶活力同时达到最大值,为0.46U/mL。该菌株所产的纤维素酶既有酸性CMC酶活力,又有碱性CMC酶活力,并以碱性CMC酶为主,酸性CMC酶的活力只有碱性CMC酶的71.4%。其酸性CMC酶的最适作用pH值为6.0,碱性CMC酶的最适作用pH值为8.0。另外,该菌株所产碱性CMC酶活的最适作用温度为40~50℃,而且0.5%的Cu2+使其酶活降低45%。【结论】菌株CP1为首次报道的梭形芽孢杆菌产纤维素酶新菌株,具有独特的酸碱性环境下的纤维素酶活力。     

酸性环境中木聚糖酶高产菌株的筛选及鉴定

从pH 5.0的酸性土壤中筛选出一株木聚糖酶高产菌株A4,菌体固态发酵产酶条件优化表明,最佳发酵培养基配方为：麸皮37.79％,玉米芯9.10％,NH4NO3 0.51％,MnSO4 1.60％,水50％,接种量2.0％,最适发酵温度28～32 ℃,发酵培养48～52 h,木聚糖酶活力最高达到750 U/g（碳源）.该菌株所产木聚糖酶的最适pH为4.8,比野生黑曲霉的pH值低.通过生长形态和分子生物学方法相结合的鉴定该菌株为黄曲霉.     

纤维微菌XM-8木聚糖酶基因克隆及酶学性质

【目的】为获得可应用于木聚糖水解的酶资源,希望通过筛选分离得到能够水解木聚糖的木聚糖酶产生菌,克隆表达木聚糖酶基因并研究其酶学性质。【方法】从环境中筛选分离出可水解木聚糖的菌株,利用16SrDNA对其进行分子鉴定。扩增其木聚糖酶基因,以pET22b(+)为表达载体,构建共表达重组质粒,转化Escherichia coli BL21(DE3)进行异源表达,并对重组酶进行酶学性质研究。【结果】经16SrDNA鉴定该菌株为纤维微菌。通过PCR成功克隆到该菌的木聚糖酶基因(xyn-8a),并构建共表达质粒pET22b-xyn-8a,实现木聚糖酶Xyn-8a的活性表达。酶学性质研究表明Xyn-8a最适反应温度为60℃,最适反应pH值为6.0,只对木聚糖底物有活性;HPLC分析其水解产物以木二糖为主,还有少量的木糖和木三糖。【结论】XYN-8A在pH值为6的条件下具有较高活力,且可以催化水解反应,在生产低聚木糖方面具有一定的应用价值。     

木霉No.183菌株木聚糖酶的研究

 筛选到一株木聚糖酶高产木霉菌株(No.183),研究了该菌株产木聚糖酶的液态发酵和粗酶液的酶学性质.结果表明,以麸皮和木聚糖为主要碳源,28℃,190r/min摇瓶培养时,木霉No.183菌株在接种后84h酶活最高,达到298.47U/mL.该木聚糖酶的最适反应温度为50℃,最适pH为该木聚糖酶在pH5～7和40℃以下时相对稳定.Ca²⁺,Zn²⁺和Cu²⁺对该木聚糖酶有较强的促进作用,Fe³⁺和Hg²⁺对该酶有较强的抑制作用.     

木聚糖酶液体发酵条件的试验

研究了利用黑曲霉C3486液体发酵生产木聚糖酶的最佳条件:3%玉米芯木聚糖为碳源,3%的蛋白胨为氮源,培养基起始pH值为7.0,250mL三角瓶中装培养基50mL,培养时间为72h,温度为35℃。在上述最适条件下木聚糖酶的最高产量为14240U/mL,平均为14230U/mL。     

生物制备功能性木低聚糖

以里氏木霉(Trichoderma reesei Rut C30)为菌种,采用改进的Mandels配方能合成酶活力高达25.5IU/mL的木聚糖酶,产酶周期3d.在酶用量1%,温度50℃的条件下,酶解35g/L的纯木聚糖4～10h,可获得74.08%～87.89%的低聚糖,此时低聚糖与木糖之比为16.76～12.30.当用55cm×7.5cm的凝胶柱在进样量60mL,洗脱速度800mL/h,柱温为50℃的分离条件下,能较好地将聚糖与木低聚糖分开,总分离时间仅需3h.     

康氏木霉固体发酵生产纤维素酶条件的研究

为利用康氏木霉(Trichoderma.koningii)降解稻草提供工艺参数,以康氏木霉(T.koningii)N18为菌株,进行了固体发酵产纤维素酶条件的优化。确定了康氏木霉(T.koningii)的最佳固体发酵培养条件:稻草:麸皮的最佳比例为6:2,最佳氮源为(NH)SO,碳氮比为6:1,含水量为200%,最适产酶pH为6.0,最佳产酶温度为28℃,最佳产酶时间为7d,康氏木霉(T.koningii)所产纤维素酶各组分酶活力分别为:羧甲基纤维素酶活力为321.64U.mL,滤纸分解酶活力为59.58U.mL。4 2 4-1-1     

里氏木霉木聚糖酶的分离纯化及其性质

使用硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-25凝胶色谱脱盐、DEAE-Sephadex A-50和SP-SephadexC-50离子交换色谱等分离纯化技术，从里氏木霉（Trichoderma reesei）RutC-30培养液中分离出木聚糖酶组分，再经SephadexG-100凝胶过滤色谱进一步分离纯化，得到2个纯木聚糖酶组分A组和组分B。经SDS-PAGE鉴定两组分为单带，相对分子质量分别为20300和13500。组分A的最适反应条件为45℃、pH3.0-5.5很稳定，酶解产物主要是低聚木糖，只含少量木糖；组分B的最适反应条件为55℃、pH5.5，酶解产物全部是低聚木糖。     

液态混合菌发酵优化纤维素酶组分

在里氏木霉和黑曲霉液态混合条件下培养纤维素酶,分析两个菌种的接种比和延迟黑曲霉的接种时间对产酶的影响,探讨两个菌种发挥协同作用的最佳条件。结果表明:黑曲霉延迟接种48 h及里氏木霉与黑曲霉接种质量比1∶1时,所产纤维素酶的滤纸酶活为1.163μmol/(min.mL);β-葡萄糖苷酶活为0.606μmol/(min.mL),β-葡萄糖苷酶活与滤纸酶活比值为0.521,比单一里氏木霉产纤维素酶的酶活高,并在后续的酶解效果对比中表现最佳。48 h时的酶解得率为65.61%,高于里氏木霉单一培养时所产纤维素酶的得率53.91%和商品纤维素酶的得率49.64%。说明通过混合发酵,纤维素酶的组分得到了优化。     

纤维素酶液中β-葡萄糖苷酶的分离纯化

通过(NH4)2SO4分级沉淀、HiPrep 26/10 Desalting脱盐柱、Source15Q阴离子交换柱、Source 15 S阳离子交换柱、HiTrap 16/60 Sephacryl S 200 HR凝胶过滤等技术,分离纯化3种来源里氏木霉、黑曲霉、里氏木霉与黑曲霉混合纤维素酶液中的β-葡萄糖苷酶。结果表明,经SDS PAGE电泳鉴定均为电泳纯,测得黑氏木霉、黑曲霉单独培养β-葡萄糖苷酶相对分子质量分别为68、129 ku,而混合菌培养分离得到两种β-葡萄糖苷酶分子质量大小分别为66.2、134 ku。与单独培养的β-葡萄糖苷酶相似。3种来源的β-葡萄糖苷酶经多步分离纯化后的纯化倍数分别为37.25、40.21、30.12,酶活回收率分别为20.1 2%、23.21 %、28.56 %。     

里氏木霉液体发酵选择性合成果胶酶

在摇瓶液体发酵的条件下研究了碳源、氮源、酵母汁和营养盐等因素对里氏木霉选择性合成果胶酶的影响规律,并测定了酶学性质。结果表明:从经济角度考虑宜选用脱汁橘皮粉制备果胶酶;在Mandels营养盐中添加1.0 g/L蛋白胨适合于里氏木霉产果胶酶;以25 g/L脱汁橘皮粉液体发酵48 h,果胶酶活力最高值达到32.6μmol/(min.mL),其中纤维素酶和木聚糖酶的活力被分别控制在0.18、0.63μmol/(min.mL)。该果胶酶的最适pH为6.0,最适温度为50℃,以16μmol/(min.g)的果胶酶振荡水解10 g/L商品果胶粉50 h,酶解得率达80.3%。高效液相离子色谱的分析结果显示果胶酶的主要水解产物为单体半乳糖醛酸,含量达总水解产物的82.5%以上。     

黑曲霉S13液体发酵产木聚糖酶的研究

从 2 0株细菌和霉菌中筛选出一株木聚糖酶高产菌株黑曲霉 S1 3.它的最适产酶培养基为 :半纤维素 1 % ,NH4NO3 0 .3% ,微量元素液 0 .0 0 5 % ,吐温 0 .2 % ,Vogel's母液 4% ,麸皮 0 .2 5 % ,起始 p H为 6.0 .种龄 36h,接种量 5 % ,装液量 60 m L( 2 5 0 m L三角瓶 ) ,摇床转速 1 2 0 r/min,发酵温度 2 8℃ ,发酵时间 48h,液体酶活可达 40 0 .0 IU/m L.     

微生物降解稻草制取多种糖的研究

采用固态发酵的方式利用黑曲霉、康宁木霉、里氏木霉、绿色木霉、宇佐美曲霉5种真菌对稻草进行降解，利用高效液相色谱对降解产物中多种糖的种类与数量进行测定，为这些糖的继续利用提供参考价值。研究表明，稻草的降解产物中含有葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖和纤维二糖，其中葡萄糖占总糖的比例最大。     

里氏木霉产酶菌株的选育研究

采用紫外线和亚硝酸联合诱变技术,得到产纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶的高产的菌株里氏木霉Y07.试验表明,诱变后菌株的木聚糖酶活由325 U/g,提高到28 500 U/g,相对于出发菌株提高了88倍;纤维素酶活由560 U/g,提高到2600 U/g,相对于出发菌株提高了4.6倍;β-葡聚糖酶活由480 U/g,提高到5500 U/g,相对于出发菌株提高了11.5倍.     

信号肽对木聚糖酶在马克斯克鲁维酵母中分泌表达的影响

马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)是一种新型的非常规酵母,具有生长快、分泌能力强、安全性高等优势.在酵母表达系统中,分泌信号肽不仅介导了外源蛋白沿着正确途径分泌到胞外,也在蛋白质翻译后加工等方面发挥了重要作用.本文分别研究了酿酒酵母α-Factor信号肽和克鲁维酵母菊粉酶信号肽对耐热木聚糖酶在马克斯克鲁维酵母中的分泌表达影响.工程菌摇瓶发酵72h后,在含有菊粉酶信号肽和α-Factor信号肽的工程菌株的发酵上清中,木聚糖酶酶活分别为318.91U/mL和117.90U/mL,表明马克斯克鲁维酵母表达木聚糖酶时,菊粉酶信号肽介导的蛋白分泌表达效果优于α-Factor信号肽.重组表达木聚糖酶最适反应条件是pH5.5和65℃,在75℃处理1h后,该酶的剩余酶活保留73%以上.在5L发酵罐中,重组菌高密度发酵72h,木聚糖酶酶活高达157 757U/mL,结果表明,马克斯克鲁维酵母表达系统在工业酶领域中应用具有非常广阔的前景.     

疏水层析在分离纯化里氏木霉重组t-PA中的应用

疏水层析是一种有效的分离纯化手段,本文采用Octyl Sepharose和Butyl Sepharose两种疏水层析填料对里氏木霉表达的t-PA的提纯操作条件进行了初步研究。结果表明,选用Butyl Sepharose FF填料,上样量10mL（蛋白含量4．1mg／mL),用15％(NH4)2SO4的PBS以2mL／min的流速进行洗脱时,回收的酶的比活性较大,为2959．54U／mg,纯化倍数为5．16,回收率为7．12％。     

嗜碱芽孢杆菌耐热耐碱内切木聚糖酶基因的密码子优化及在毕赤酵母中的表达

【目的】研究极端耐热耐碱的木聚糖酶,使其能够满足造纸行业中碱性高温的苛刻环境。【方法】将一种来源于嗜碱芽孢杆菌S7的耐热耐碱内切木聚糖酶基因(xyn10A)密码子进行优化,基因合成后克隆至pHBM905BDM载体上,并转化毕赤酵母GS115菌株。【结果】木聚糖酶基因(xyn10A)优化后与原始序列比对相似性为76.70%。基因合成后克隆到pHBM905BDM载体上,并成功转化毕赤酵母GS115菌株。通过交联木聚糖底物平板水解圈法初筛及摇瓶复筛得到一株产酶量较高的菌株,且其在摇瓶发酵第10天达到最高酶活力,为495U/mL。另外,糖基化分析表明该酶在毕赤酵母中表达时被糖基化修饰。【结论】密码子优化后的极端耐热耐碱木聚糖酶基因在毕赤酵母中成功表达。     

黑曲霉C71分批发酵动力学模型的构建

以黑曲霉C71为出发菌株,分批发酵生产木聚糖酶,在发酵过程中每隔8h取样,测定菌体细胞浓度、总糖与还原糖含量和木聚糖酶活力,探讨了发酵过程中菌体生长、产物合成及基质消耗的特性.基于Logistic和Luedeking-Piret方程,建立了描述黑曲霉C71分批发酵过程的菌体生长动力学模型、产物合成动力学模型、基质消耗动力学模型.结果表明,模型计算值与实验数据拟合良好,基本反映了黑曲霉C71分批发酵过程的动力学特征.黑曲霉C71分批发酵过程中菌体生长与产物合成属于部分生长偶联型.