黄芪、脉络宁注射液载入修饰胶原对鸡胚尿囊膜血管新生的协同促进作用

背景:课题组先期研究发现黄芪载入修饰后胶原可以促进血管新生,与生长因子载入疗效相当,运用中医理论中具有协同作用的中药合用是否能进一步提高疗效尚不清楚.目的:探查黄芪、脉络宁载入修饰后胶原促鸡胚尿囊膜血管新生及长入胶原的疗效,并证明黄芪与脉络宁是否有协同作用.方法:实验分空白组、控制组(单纯胶原)、黄芪组(黄芪注射液1 mL载入胶原)、脉络宁组(脉络宁注射液1 mL载入胶原)、黄芪+脉络宁组(黄芪注射液及脉络宁注射液各0.5 mL载入胶原),各组植入鸡胚尿囊膜孵化7 d后取出,测定鸡胚尿囊膜内微血管数、各组胶原内微血管数、血红蛋白含量、rhVEGF165阳性细胞数.结果与结论:各实验组鸡胚尿囊膜内血管呈轮辐状生长及鸡胚尿囊膜包裹标本率高于空白组与控制组,鸡胚尿囊膜内微血管数、胶原内微血管数、血红蛋白含量、rhVEGF165阳性细胞数均高于控制组,差异有显著性意义(P < 0.01);其中黄芪+脉络宁组又高于黄芪组与脉络宁组,差异有显著性意义(P < 0.05).提示黄芪、脉络宁载入胶原后可以促进鸡胚尿囊膜内血管新生并刺激血管长入胶原内,黄芪与脉络宁合用具有协同作用,机制之一为刺激血管内皮细胞血管内皮生长因子的表达.     

骨髓液促进鸡胚绒毛尿囊膜血管的生成

背景:生长因子能促进侧支血管的发育,且多种因子协同效果更为明显,骨髓液中富含多种生长因子.目的:观察血管内膜损伤后的骨髓液对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的作用.方法:受精蛋70枚在(37.5±0.5) ℃条件下孵育,第7天开窗,第8天将存活鸡胚随机分为生理盐水组、正常血清组、正常骨髓液组、损伤血清组、损伤骨髓液组以及血管内皮生成因子组,每组10枚,分别滴加5 μL兔正常血清、5 μL兔骨髓液、5 μL兔血管内膜损害血清、5 μL兔血管内膜损害骨髓液、5 μL生理盐水及0.3 μg 血管内皮生长因子进鸡胚绒毛尿囊膜中,连续3 d.数码相机拍照后平铺于载玻片上,计数鸡胚绒毛尿囊膜新生的血管数目.结果与结论:与正常血清组相比,正常骨髓液组、血管内膜损害血清组鸡胚绒毛尿囊膜新生的血管总数明显增多,大中血管明显增生;且血管内膜损害血清组大、中血管数更为明显增加.提示正常骨髓液具有明显的促进鸡胚绒毛尿囊膜模型血管生成的作用,其强度优于血管内皮生长因子;血管内膜损伤第7天的血清和骨髓液能够明显的促进鸡胚绒毛尿囊膜上的血管生成,其强度优于血管内皮生长因子组.     

骨髓液促进鸡胚绒毛尿囊膜血管的生成

背景：生长因子能促进侧支血管的发育,且多种因子协同效果更为明显,骨髓液中富含多种生长因子。目的：观察血管内膜损伤后的骨髓液对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的作用。方法：受精蛋70枚在（37.5±0.5）℃条件下孵育,第7天开窗,第8天将存活鸡胚随机分为生理盐水组、正常血清组、正常骨髓液组、损伤血清组、损伤骨髓液组以及血管内皮生成因子组,每组10枚,分别滴加5μL兔正常血清、5μL兔骨髓液、5μL兔血管内膜损害血清、5μL兔血管内膜损害骨髓液、5μL生理盐水及0.3μg血管内皮生长因子进鸡胚绒毛尿囊膜中,连续3d。数码相机拍照后平铺于载玻片上,计数鸡胚绒毛尿囊膜新生的血管数目。结果与结论：与正常血清组相比,正常骨髓液组、血管内膜损害血清组鸡胚绒毛尿囊膜新生的血管总数明显增多,大中血管明显增生;且血管内膜损害血清组大、中血管数更为明显增加。提示正常骨髓液具有明显的促进鸡胚绒毛尿囊膜模型血管生成的作用,其强度优于血管内皮生长因子;血管内膜损伤第7天的血清和骨髓液能够明显的促进鸡胚绒毛尿囊膜上的血管生成,其强度优于血管内皮生长因子组。     

乐脉颗粒促进鸡胚绒毛尿囊膜血管的生成

目的:乐脉颗粒在缺血性心脑血管病的治疗中具有较好的效果,其是否通过促进血管生成而发挥作用还不清楚。观察乐脉颗粒对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的影响。方法:实验于2005-03/08在江西省重点实验室南昌大学第二附属医院分子中心完成。①实验材料:新西兰大白兔8只,体质量2～2.5kg;新鲜白皮种蛋70只,质量50～60g。②实验方法:种蛋在(37.5±0.5)℃条件下孵育,种蛋受精率90%以上。第7天开窗暴露鸡胚绒毛尿囊膜建立鸡胚绒毛尿囊膜模型。将60枚存活鸡胚随机分为生理盐水组、正常血清组、乐脉血清组、内膜损伤血清组、内膜损伤乐脉治疗组以及血管内皮生长因子(20mg/L)组,每组10枚鸡胚。新西兰大白兔腹主动脉用球囊导管损伤建立血管内膜损伤模型,乐脉血清组及内膜损伤乐脉治疗组给予乐脉颗粒25mg/(kg·d)喂饲,各组7d后取血清。第8天,在鸡胚绒毛尿囊膜上放一直径为5mm的滤膜作为载体,分别加样5μL,1次/d,连续3d,③实验评估:第11天取鸡胚绒毛尿囊膜,数码相机拍照后平铺于载玻片上,计数载体周围血管数目及滤膜周围0.5cm范围内的血管分支点数并进行比较。结果:纳入大白兔8只,存活鸡胚60枚,均进入结果分析,无脱落。与正常血清组相比较,乐脉血清组鸡胚绒毛尿囊膜周围血管总数明显增多,血管以载体为中心呈辐辏状生长,差异具有显著性意义(P<0.05);与正常血清组相比较,内膜损伤血清组血清载体周围血管数量明显增多,差异具有极显著性意义(P<0.01);与内膜损伤乐脉治疗组相比较,血管总数差异无显著性。结论:①兔乐脉颗粒血清能够明显促进鸡胚绒毛尿囊膜上血管生成。②血管内膜损伤7d后的血清能够促进鸡胚绒毛尿囊膜上血管生成。     

Ad-Ang-1转基因成纤维细胞修饰的再生丝素膜诱导血管形成效应及其分子机制研究

目的研究经腺病毒介导的人血管生成素-1（Ad-Ang-1）转基因细胞修饰的再生丝素膜诱导血管形成活性及其分子机制。方法将Ad-Ang-1腺病毒病毒子感染再生丝素膜上培养的wI-38人胚肺成纤维细胞,通过ELISA法检测再生丝素膜对成纤维细胞目的基因表达的影响,将Ad—Ang-1转基因WI-38细胞修饰的丝素材料进行鸡胚尿囊膜血管形成实验（CAM）和兔角膜层间植入诱导角膜新生血管试验,并用ELISA法检测其对血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（FGF2）、血小板衍化生长因子（PDGF）表达的影响。结果Ad—Ang-1可感染再生丝素膜上培养的成纤维细胞,ELISA法检测结果表明sF组Ad．Ang．1转基因W1．38细胞可以成功表达目的基因（P〈0．05）。CAM实验表明Ad-Ang-l转基因wI-38细胞修饰的再生丝素膜具有促进CAM血管生成的活性,并通过兔角膜层间植入实验进一步证明Ad-Ang-1转基因细胞修饰的丝素材料具有诱导角膜组织血管生成的作用．其机制可能与再生丝素膜对Ad-Ang-l转基因的WI-38成纤维细胞中不仅可以成功表达目的Ang-1,而且还可使与血管生成和组织损伤修复相关的VEGF、FGF2、PDGF基因表达水平明显提高有关。结论Ad-Ang-I转基因细胞修饰的丝素材料具有诱导血管生成的作用,为今后进一步采用转基因技术对生物材料进行修饰或改性、研制出具诱导性的医用生物膜材料创造了条件。     

黄芪植入可控降解胶原支架控释促血管生成的效应

目的：将中药黄芪载入胶原支架内,通过对胶原支架进行修饰,观察黄芪能否代替生长因子起到促进血管生成疗效,并了解黄芪与生长因子是否有协同作用. 方法：实验于2004-07-01/2006-07-01在德国亚琛工业大学生化研究所及江苏省中医院中心实验室进行.首先通过不同的EDC/NHS与肝素钠比例来交链修饰Ⅰ型胶原（EDC与NHS质量比固定为1∶0.6,EDC与肝素钠比例为0.2～4）,然后将1 mL黄芪注射液（相当于3 mg生药黄芪）载入修饰后的胶原内.体外通过甲苯胺蓝法测定修饰后胶原内肝素含量,胶原酶降解法测量胶原体外降解率,同时对胶原的亲水性及自由氨基团进行测定.体内通过鸡胚绒毛尿囊膜模型进行血管计数及血红蛋白测定. 结果：①体外实验结果：通过对胶原的修饰程度,可以控制胶原内的肝素含量、体外降解率、自由氨基团含量、亲水性大小.②体内实验结果：黄芪注射液1 mL载入修饰后的胶原较载入未修饰的胶原,可以明显促进鸡胚绒毛尿囊膜内微血管生成,提高胶原内血红蛋白含量（P＜0.01）,其疗效与重组人体血管内皮生长因子载入修饰后的胶原内相当,且与血管内皮生长因子有协同作用的趋势. 结论：通过对胶原的修饰来控制胶原的体外降解,载入黄芪后,使黄芪促血管生成疗效增强,达到与血管内皮生长因子载入后的疗效相当,其作用机制有待进一步研究.     

缺氧对人胶质瘤细胞U251血管生成反应的影响

目的:探讨缺氧对人胶质瘤细胞株U251缺氧诱导因子-1α和血管内皮生长因子表达及血管生成反应的影响及机制。方法:以氯化钴模拟缺氧,采用RT-PCR、免疫细胞化学方法分别检测缺氧诱导因子-1α和血管内皮生长因子mRNA和蛋白的表达,鸡胚绒毛尿囊膜模型检测缺氧时胶质瘤细胞血管生成情况.结果:低氧处理后人胶质瘤U251细胞缺氧诱导因子-1α和血管内皮生长因子mRNA表达明显高于未处理之细胞,并在免疫组化上得到了进一步证实。氯化钴缺氧处理的胶质瘤细胞在鸡胚绒毛尿囊膜上血管数目明显增加。结论:缺氧可使胶质瘤细胞缺氧诱导因子-1α和血管内皮生长因子表达上调,缺氧能刺激胶质瘤细胞血管生成反应增加。     

吸湿链霉菌A-125对肿瘤血管生长因子抑制作用的研究

目的 :探讨吸湿链霉菌A 1 2 5发酵提取物对肿瘤血管生长因子抑制作用的研究。方法 :采用发酵方法从吸湿链霉菌A 1 2 5中提取肿瘤血管生长因子抑制剂 ,点样于接种肿瘤血管生长因子的鸡胚绒毛尿囊膜上 ,分为 1 0 0 μg、2 0 0 μg、40 0 μg及对照组 ,置 37℃CO2 培养箱中 ,48h后观察结果。结果 :吸湿链霉菌A 1 2 5发酵提取物在 2 70nm紫外有最大吸收 ,它溶于有机溶剂 ,不溶于水。鸡胚绒毛尿囊膜实验显示 :低剂量 1 0 0 μg组使肿瘤血管生长略有抑制 ,中剂量 2 0 0 μg组肿瘤血管生长受到明显抑制 ,高剂量 40 0 μg组肿瘤血管出现坏死。结论 :吸湿链霉菌A 1 2 5发酵提取物能显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜中的肿瘤血管生长 ,并随剂量增加对肿瘤血管生长因子的抑制作用而增强 ,直至肿瘤血管坏死。且具有很强的抗血管生成活性 ,故吸湿链霉菌A 1 2 5发酵提取物将是很好的肿瘤血管生长因子抑制剂。     

鸡胚绒毛尿囊膜数字图像血管定量分析

目的:以生物医学工程的角度,研究基于数字图像处理技术的鸡胚绒毛尿囊膜图像血管自动分析方法,设计和研制专用实验检测系统. 方法:实验于2005-06/2007-06分别在上海理工大学医疗器械与食品学院中心实验室和上海中医药大学进行.根据鸡胚绒毛尿囊膜血管图像的特点,研究和开发了包括鸡胚绒毛尿囊膜血管数字图像背景褪色、血管增强、背景和血管定标、标尺校准、血管测量区域划分、血管面积及面积比参数测量等主要分析软件,以及相应的测量分析系统.通过实验检验分析方法和测量参数,并对分析系统进行改进.结果:建立了有效的鸡胚绒毛尿囊膜数字图像血管自动分析的方法和步骤,研制了专用的实验分析系统.通过药物实验对鸡胚绒毛尿囊膜血管图像进行了参数检测,获取了多组实验数据,并进行了统计分析.统计分析结果显示试验药物有抑制血管生长作用,且作用大小呈剂量依赖关系.结论:经实验证明基于数字图像处理技术的鸡胚绒毛尿囊膜图像血管自动分析方法能提供可靠的鸡胚绒毛尿囊膜模型定量分析数据,并且在分析速度、测量精度、数据重复性等方面均优于常规人工目测血管计数方法.     

复方苦参注射液联合热疗抗血管生成作用的实验研究

目的探讨复方苦参注射液联合热疗对体内外血管生成的抑制作用。方法采用MTT法观察复方苦参注射液联合热疗对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、人结肠癌LOVO细胞增殖的影响;采用transwell板,观察复方苦参注射液对HUVEC迁移的影响;采用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型,观察复方苦参注射液对鸡胚绒毛尿囊膜新生血管的抑制作用。结果复方苦参注射液在6.25~200μL/mL时具有抑制HUVEC增殖的作用(细胞存活率82.2%~32.5%),与浓度呈负相关(相关系数r及P值分别为-0.972、0.001),此浓度范围内对人结肠癌LOVO细胞增殖的抑制明显低于对HUVEC的抑制,具有明显的抗血管生成作用。12.5μL/mL和25μL/mL复方苦参注射液联合热疗在体外具有抗血管生成的协同效应,6.25μL/mL、50μL/mL、100μL/mL和200μL/mL复方苦参注射液联合热疗在体外具有抗血管生成的次加效应。复方苦参注射液在3.125~25μL/mL时具有抑制HUVEC迁移的作用,在12.5~50μL/mL时对鸡胚绒毛尿囊膜新生血管具有明显的抑制作用。结论小剂量复方苦参注射液在体内外具有抑制血管生成作用,联合热疗具有协同或次加效应。     

VEGF165基因重组腺病毒载体的构建及其促血管形成作用

目的构建携带人血管内皮细胞生长因子165（VEGF165）基因的腺病毒表达载体（Ad—VEGF165）,并观察其感染QBI．293A靶细胞后目的基因的表达及促进血管形成的作用。方法以含有VEGF165基因片段的pSV-K3-VEGF165质粒为模板,PCR扩增获得的VEGF165目的片段（XhoI、EcoRV）亚克隆至GFP标记的pAdTrack—CMV载体中构建重组转移质粒pAdTrack．CMV．VEGF165,行PCR、双酶切和DNA测序鉴定。将测序正确的pAdTrack—CMV．VEGFl65质粒经PmeI线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy．1共转化BJ5183细菌,获得同源重组腺病毒质粒pAdEasy-1．pAdTrack-CMV．VEGF165（pAd．VEGF165）,再经PacI线性化后用脂质体转染QBI．293A包装细胞,通过多轮扩增和氯化铯密度梯度离心纯化获得Ad．VEGFl65重组腺病毒。RT．PCR和ELISA检测腺病毒介导的外源性VEGFl65基因在QB｜．293A细胞中的转录和表达。将孵育8d的生长状态良好的鸡胚随机分成Ad空载体腺病毒组、Ad—VEGFI65重组腺病毒组、NS组。采用鸡胚尿囊膜（CAM）法检测VEGF165重组腺病毒促进尿囊膜血管形成活性。结果PCR、双酶切和测序鉴定结果证实成功构建了pAdTrack．CMV—VEGF165重组转移质粒,并获得了高滴度的Ad．VEGF165重组腺病毒,其病毒效价可达2×10^10pfu／mL。Ad-VEGFl65感染后,QBI．293A细胞中的VEGF165含量较QBI．293A细胞对照组和Ad空病毒感染组均明显升高（P〈0．05）。Ad-VEGF165组与Ad．空载体组和NS组比较,CAM三级分支血管生长更旺盛,毛细血管更丰富（P〈0．05）。结论成功获得了携带人VEGF165基因的腺病毒表达载体,具有明显的促CAM血管形成活性,为进一步开展VEGF165基因修饰干细胞的应用研究奠定了实验基础。     

Antiangiogenic action of heparin plus cortisone is associated with decreased collagenous protein synthesis in the chick chorioallantoic membrane system

In the chick chorioallantoic membrane system heparin plus cortisone caused a marked depression in the rate of collagenous protein biosynthesis in vivo during inhibition of angiogenesis. This suggests that monitoring the rate of collagenous protein biosynthesis in the chick chorioallantoic membrane system can be used as a quantitative method for evaluating angiogenesis inhibitors.     

脑源性神经营养因子(BDNF)在多发性骨髓瘤患者血浆中表达增高及其意义的初步研究

为了研究多发性骨髓瘤 (MM)患者血浆中脑源性神经营养因子 (BDNF)、血管内皮细胞生长因子 (VEGF)的表达情况和BDNF与血管新生的关系 ,初步探讨BDNF在MM的发生与发展中的潜在作用 ,用酶联免疫吸附试验 (ELISA)测定MM患者与健康体检者血浆BDNF和VEGF的浓度 ;采用MTT法观察BDNF对脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的作用 ;用改良的Boyden小室法和体外小管形成实验等体外血管新生模型观察BDNF对HUVEC迁移和形成血管通道的影响 ;采用鸡胚尿囊膜血管生成实验和小鼠matrigelplug方法观察BDNF对体内血管新生的影响。结果表明 :患者血浆BDNF浓度为 (4.2 2± 0 .6 4 )ng ml,与健康体检者 (2 .0 3± 0 .38)ng ml相比 ,差异有显著性意义 (P =0 .0 10 ) ;患者血浆VEGF浓度为 (79.35± 13.2 5 ) pg ml,与健康体检者 (34.4 1± 1.78)pg ml相比 ,差异有显著性意义 (P =0 .0 0 6 )。BDNF与VEGF水平间存在着相关性 (r =0 .4 30 ,P =0 .0 2 5 )。BDNF对HUVEC的增殖没有显著作用 ,但可明显促进HUVEC的迁移和管状结构形成 ;同时可促进鸡胚尿囊膜血管生成和matrigelplug中血管新生。结论 :MM患者血浆BDNF和VEGF显著增高 ,BDNF在体内外均具有明显的促血管新生效应 ,在MM的血管新生中可能起着重要作用。     

血管生成素在COS-7细胞中的表达及其生物活性研究

本研究旨在实现血管生成素（ANG）在真核细胞中的表达并探讨其生物学功能。通过RT—PCR获得ang基因，构建真核表达载体pcDNA3．1-ang，在转染COS-7细胞后进行瞬时表达，通过Western blot对表达产物进行鉴定。利用MTT法分析表达上清对ECV304细胞的促增殖作用，同时利用鸡胚分析表达上清的促血管生成作用。结果表明：瞬时转染后细胞培养上清中有重组ANG的表达，并能与抗-ANG单克隆抗体发生特异性反应。与转染空载体的对照相比．转染pcDNA3．1-ang的细胞培养上清具有促进ECV304细胞增殖的作用，并能显著促进鸡胚尿囊膜血管生长。结论：ang可在COS-7细胞中瞬时表达，其表达产物具有显著的促细胞增殖和促进血管生成的作用。     

重组人内皮抑制素抑制肺黑色素瘤转移

目的 研究rhEndostatin的抗肿瘤活性。 方法：鸡胚绒毛尿囊膜实验观察rhEndostatin的体内抗血管生成活性；将B16-BL6黑色素瘤细胞尾静脉注射入C57BL/6小鼠体内构建肺转移瘤模型，评价rhEndostatin的抗肿瘤活性。结果：rhEndostatin可以明显抑制血管的生成。与盐水对照组相比，高、中、低剂量rhEndostatin明显减少肺转移瘤数目，并对由于黑色素瘤体积的增长而引起的肺重的增加也有抑制趋势。结论：rhEndostatin通过抑制血管生成可以抑制肺黑色素瘤的转移。     

血小板衍生膜微粒对鸡胚绒毛尿囊膜血管新生的影响

本研究探讨血小板衍生膜微粒(platelet-derived membrane microparticles,PMP)对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)新生血管形成的影响。用凝血酶激活血小板释放出PMP,再经高速离心分离出PMP,用流式细胞仪检定PMP,并用BCA法测定PMP的含量。将PMP接种于鸡胚绒毛尿囊膜上,观察PMP对CAM血管生成的影响。结果显示:当PMP的浓度为80μg/ml时,孵育72小时后混合纤维素滤膜周围可见到放射状密集生长的血管网,血管分支数为112.5±11.31,血管面积为(6.19±1.29)(,而在对照组无特异性密集血管生成,血管分支数为82.6±8.05,血管面积为1.78±0.33,二组比较有显著性差异(P<0.05);而与VEGF组比较,后者的血管分支数为128.4±10.02,血管面积为7.44±1.36,二组比较差异无显著性。结论:PMP对CAM新生血管的生成有促进作用。     

Ta1722, an anti-angiogenesis inhibitor targeted on VEGFR-2 against human hepatoma

In order to investigate the anti-angiogenesis potential and related mechanisms of Ta1722 (a novel taspine derivative compound), a series of experiments in vivo and in vitro were carried out. The proliferation on human cell lines of SMMC-7721, A549, MCF-7, Lovo, and ECV304 was examined by MTT. Angiogenesis inhibition was examined by chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) angiogenesis and tube formation assays. Related angiogenesis proteins and their mRNA expression were determined by western blotting and RT-PCR. In addition, the SMMC-7721 nude mouse xenotransplant model was used to evaluate the inhibition of tumor growth. The results showed that Ta1722 inhibited cell proliferation, angiogenesis of CAM and tube formation, and downregulated related positive angiogenesis proteins. The above indicated Ta1722 could serve as a promising candidate of angiogenesis inhibitors by interrupting the VEGF/VEGFR-2 pathway.