升降散在建立流感病毒树鼩模型中的作用初探

目的 通过使用药物一“升降散”对流感病毒的树鼩模型进行验证，证明树鼩对流感病毒的易感性，同时检验“升降散”在控制动物体温变化方面的能力。方法 先用甲3型流感病毒攻击成年树鼩造模，再通过“升降散”控制其体温，并对接种前后树鼩的鼻腔排毒情况及体温变化结果进行比较，综合分析。结果 病毒攻击前，树鼩体温在38．5℃～40．4℃之间浮动，病毒攻击后第3天，树鼩体温出现了一个大的波动，最高达到了42．5℃，升降散组的体温变化幅度明显较大，且体温变化值的最高峰要高于病毒唑。病理切片表明：流感病毒感染树鼩，导致了其肺部的炎症反应。鼻洗液检测表明，树鼩鼻腔接种流感病毒后，在其鼻洗液中能分离出病毒，说明流感病毒已感染了树鼩。结论 树鼩可能是用来研究流感病毒的较好的动物模型。     

PB2 E627K对A/H6N1亚型禽流感病毒的致病性的影响分析

目的 本研究利用A/H6N1亚型禽流感病毒的反向遗传平台,评估PB2 E627K对A/H6N1亚型禽流感病毒的致病性,探究A/H6N1流感病毒的致病性分子基础。方法 通过A/H6N1亚型禽流感病毒A/Mallard/SanJiang/275/2007株反向遗传操作系统和点突变技术拯救病毒rA/H6N1和PB2 E627K位点发生突变的 rA/H6N1-627,两株拯救病毒分别以101EID50~106EID50的攻毒剂量人工感染BALB/c小鼠,通过体重变化、死亡率、病毒滴定等方面进行致病性分析。结果 成功构建A/H6N1亚型禽流感病毒的反向遗传平台,rA/H6N1的8个基因片段完全源于A/H6N1的基因组,核苷酸序列及生物学特性与A/H6N1完全一致。rA/H6N1能够人工感染BALB/c小鼠,但不致死,对BALB/c小鼠呈现低致病性(MLD50>106.5EID50),病毒在小鼠体内的分布情况及各个脏器中的病毒滴度与A/H6N1保持一致; rA/H6N1-627能感染小鼠,引起小鼠体重下降,但不能引起所有106EID50组小鼠死亡,病毒能在小鼠的肺脏和脑部进行增殖。结论 实验结果表明,在H5N1禽流感中发挥重要作用的PB2-E627K位点并非A/H6N1流感病毒的毒力决定因子。A/H6N1流感病毒致病性的分子基础还有待继续研究,该反向遗传操作系统和点突变技术的建立为研究该亚型流感病毒致病机制、传播机制及病毒基因功能奠定了基础,同时也为A/H6N1亚型禽流感病毒新型疫苗的研制开辟了新途径。     

树鼩原代细胞的分离及感染甲型流感病毒模型的构建

目的建立甲型流感病毒PR8株(A/PR/8/34,H1N1)对树鼩原代气管内皮细胞、树鼩原代肺细胞及树鼩原代肾细胞的体外感染模型。方法胶原酶蛋白消化法获得树鼩原代气管内皮细胞、树鼩原代肺细胞及树鼩原代肾细胞,用流感病毒PR8株感染树鼩原代细胞,测定24、48和72 h培养上清病毒载量,并观察细胞感染流感病毒后的形态变化,以确定流感病毒PR8株体外对树鼩原代气管内皮细胞、树鼩原代肺细胞及树鼩原代肾细胞的感染性。结果分离到的树鼩原代细胞经传代培养纯化和形态鉴别,对树鼩原代气管内皮细胞、原代肺细胞、原代肾细胞和犬肾传代细胞(MDCK)进行流感病毒易感性比较,培养48 h时显微镜下均能观察到明显的细胞病变(CPE);培养72h时病毒滴度可分别达到2.40×10~5 TCID_(50)/mL、1.20×10~3 TCID_(50)/mL、1.74×10~4 TCID_(50)/mL和1.79×10~7 TCID_(50)/mL。结论流感病毒可有效感染树鼩原代气管内皮细胞、原代肺细胞、原代肾细胞并有效增殖,且流感病毒对树鼩原代气管内皮细胞感染性最强,与流感病毒易感细胞MDCK相比具有统计学意义。确立了树鼩原代细胞的分离与培养方法,初步建立了流感病毒感染树鼩原代细胞的体外模型。     

甲型H1N1流感病毒在季流病毒、禽流感病毒共感染时变异可能性的验证

目的 甲型H1N1流感病毒A/California/7/2009分别与A/Brisbane/10/07和A/ShenZhen/406H/06共感染小型香猪,预测甲流病毒在与季流H3N2病毒/甲流病毒与禽流感病毒共感染时是否会发生变异.方法 分别将A/California/7/2009(CA7)与A/Brisbane/10/07(H3N2),A/California/7/2009与A/Shenzhen/406H/06(H5N1)对5～6月龄小型猪共感染,小型猪经复方氯胺酮0.1 mL/kg麻醉后进行滴鼻感染,感染后第5天安乐死动物,取动物肺组织作病毒测序分析.结果 A/California/7/2009(CA7)与A/Brisbane/10/07(H3N2)共感染后,A/California/7/2009病毒PB1基因993位G→A突变,PA基因1659位G→A突变,没有氨基酸的变异.A/California/7/2009与A/Shenzhen/406H/06(H5N1)共感染后A/California/7/2009病毒PB2基因1711位T→C突变.碱基的突变未引起氨基酸的变异.结论 A/California/7/2009(CA7)与A/Brisbane/10/07(H3N2),A/California/7/2009与A/Shenzhen/406H/06(H5N1)共感染后在猪的体内没有发生病毒重组、变异.     

奥司他韦治疗甲型H1N1流感的疗效及不良事件观察

目的评价奥司他韦治疗甲型H1N1流感的疗效及安全性。方法回顾性分析口服奥司他韦治疗甲型H1N1流感患者的咽拭子病毒核酸阴转时间、退热时间、热程及发生的不良事件与奥司他韦的关系。结果口服奥司他韦后72h内咽拭子甲型H1N1流感病毒核酸阴转;55例患者发热后的第1～6d使用奥司他韦治疗,退热时间无明显差异,但越早使用热程越短;重症病例使用奥司他韦后热程较未使用者平均缩短1.17d（P〈0.05）;使用奥司他韦抗病毒治疗患者中,5例发生不良事件,其中3例为不良反应,2例与奥司他韦无关。结论口服奥司他韦治疗甲型H1N1流感相对安全有效,宜早期使用。     

甲型H3N2流感病毒截短型PB1-F2蛋白与宿主蛋白的相互作用的初步研究

目的利用酵母双杂交技术研究甲型H3N2流感病毒截短型PB1-F2蛋白与人类宿主蛋白的相互作用,为该病毒蛋白的功能研究和致病机制提供理论依据。方法以本实验室分离和鉴定的甲型H3N2流感病毒A/Guangdong/7028/2010为模版,构建pGBKT7-PB1-F2重组载体,利用Y2HGold酵母双杂交系统,从人类通用cDNA文库中筛选与其相互作用的蛋白。结果成功构建含诱饵蛋白基因的pGBKT7-PB1-F2重组载体,转化酵母自激活和毒性实验显示为阴性;酵母双杂交实验显示Y2HGold和Y187酵母的结合率为5.22%,符合实验要求;经筛选和验证后,得到3个与截短型PB1-F2蛋白有相互作用的阳性克隆,分别为钾/钠ATP酶β1亚基、热休克蛋白40和白介素-2受体γ亚基。结论初步推断截短型H3N2流感病毒PB1-F2蛋白可能影响流感病毒在宿主细胞中的复制功能和凋亡调控。     

板蓝根颗粒对甲型流感病毒小鼠的作用

目的测定板蓝根颗粒抗流感病毒的药效作用。方法 A/California/7/2009(CA7)病毒滴鼻感染BALB/c小鼠观察14d,观察板蓝根对甲型H1N1流感病毒感染小鼠的保护作用,计算小鼠存活率、存活天数以及延长生命率。感染的小鼠第5天每组小鼠处死一半,取肺组织,观察板蓝根对甲型H1N1流感病毒感染小鼠肺组织的保护作用。结果板蓝根可明显延长甲型H1N1流感病毒感染小鼠的存活天数并提高存活率,病理结果显示板蓝根对甲型H1N1流感病毒感染的小鼠的肺组织有一定程度的保护作用,与模型组比较差异显著(P0.05)。结论板蓝根颗粒对甲型H1N1流感病毒感染的小鼠有较好的保护作用。     

金刚烷胺和奥司他韦体外抗H5N1亚型禽流感病毒的作用

【目的】 观察体外单用金刚烷胺?奥司他韦及两药联合使用对两株H5N1亚型的禽流感病毒分离株(AIV127?AIV174)的抑制作用,了解广东地区分离的不同H5N1毒株之间药物敏感性的差异,为临床合理应用抗病毒药物提供科学依据?【方法】 建立体外H5N1感染模型,根据药物与病毒?细胞的不同作用,通过3种给药方式,使用细胞病变(CPE)?组织培养半数感染量(TCID50)评估抗病毒药物对H5N1的体外抑制作用? 【结果】 三种给药方式金刚烷胺联合奥司他韦,均比单用金刚烷胺体外抑制AIV127及AIV174效果明显(P < 0.01);而仅在治疗给药方式,两者联合比单用奥司他韦效果明显(P < 0.01)?三种给药方式金刚烷胺?奥司他韦及联合用药对同一亚型H5N1 AIV127比AIV174毒株均较敏感(P < 0.01)? 【结论】 抗病毒药物对不同的禽流感病毒毒株之间敏感性存在差异,应根据不同毒株给予相应的抗病毒治疗     

不同品系小鼠感染甲型流感病毒肺小血管内血栓形成

目的本实验旨在观察不同品系小鼠感染甲型流感病毒后肺组织内血栓形成的情况。方法使用H1N1病毒A/California/7/2009(CA7)株和H3N2病毒A/Brisbane/10/07株,对BALB/C小鼠、Scid小鼠、NOD/LTJ小鼠、BALB/C-nu小鼠、NOD-Scid小鼠和icosl-KO小鼠经乙醚麻醉后进行滴鼻攻毒。检测小鼠感染后肺组织病毒拷贝数并观察肺组织病理学改变。结果 H1N1和H3N2滴鼻攻毒的各组小鼠均染毒,病理表现为程度略有差异的间质性肺炎。13只H1N1病毒感染小鼠和6只H3N2感染小鼠在肺组织中观察到多个小血管内有血栓形成,血栓成分主要为纤维素和血小板。结论各品系小鼠感染H1N1和H3N2流感病毒后均可能出现肺组织内血栓形成。     

禽流感专题讲座(下)人禽流感诊疗方案(2005版)(下)

治疗对疑似和确诊患者进行隔离治疗。对症治疗应用解热药、缓解鼻黏膜充血药、止咳祛痰药等。儿童忌用阿司匹林或含阿司匹林以及其他水杨酸制剂的药物,避免引起儿童Reye综合征。应在发病48小时内试用抗流感病毒药物。①神经氨酸酶抑制剂奥司他韦(Oseltamivir,达菲)为新型抗流感病毒药物,实验室研究表明对禽流感病毒H5N1和H9N2有抑制作用,成人剂量每日150mg,儿童剂量每日3mg/kg,分2次口服,疗程5天。②离子通道M2阻滞剂金刚烷胺(Amantadine)和金刚乙(Rimantadine)可抑制禽流感病毒株的复制,早期应用可能有助于阻止病情发展、减轻病情、改…     

禽流感出现耐药

据越南、日本、美国的研究人员报告,H5N1型禽流感病毒有可能出现了耐药现象,人们要提高警惕,时刻准备应对可能出现的流感大流行(Le et al.Nature.2005;437:1108)。他们从一名十几岁的越南女童体内分离出了禽流感病毒用于研究。该女童在治疗初期使用了预防剂量的奥司他韦(oseltamivir),随后用药剂量有所增加,病情痊愈。奥司他韦是一种神经氨酸酶抑制剂,目前用于防治流感,其中包括 H5N1型禽流感。现已证实,奥司他韦能有效抵御多种流感病毒,为此当前许多国家大量储备该药。但是,既往曾有人发现,在日本采用奥司他韦治疗非 H5N1型流感患儿时,病毒出现了耐药现象。研究人员指出,尽管我们有必要作进     

禽流感病毒H5N1基因突变对神经氨酸酶抑制剂敏感性和神经氨酸酶活性的影响

目的 研究感染人的禽流感病毒H5N1神经氨酸酶突变I117V,I314V,I117V+I314V对神经氨酸酶抑制剂(NAIs)敏感性和神经氨酸酶(NA)活性的影响.方法 定点突变技术将变异位点引入禽流感病毒株A/Vietnam/1203/04(H5N1)(VN1203)的NA基因中,以A/WSN/33(H1N1)为背景,通过反向遗传学方法构建重组流感病毒,鸡胚传代增殖病毒,荧光定量评估病毒对NAIs的敏感性和NA活性(IC50值和Km,Ki值).结果 与野生株VN1203相比,I117V使NA对奥司他韦敏感性降低(IC50值升高了17倍,Ki值升高了20倍),对扎那米韦敏感性无明显影响(IC50值升高了2倍,Ki值升高了3倍),NA活性降低(Km值升高了23倍).I314V对NAIs敏感性和NA活性均无明显影响.结论 初步结果认为NA突变I117V和I314V对感染人的禽流感病毒H5N1并不产生NAIs耐药,临床上仍然可以用奥司他韦或扎那米韦抗病毒治疗.     

甲型H1N1流感病毒单克隆抗体的制备及其功能研究

目的获得分泌特异性抗H1N1亚型（A/California/04/2009）猪流感病毒单克隆抗体（mAb）的杂交瘤细胞并探索其分泌抗体的功能。方法以表达血凝素蛋白H1（A/California/04/2009）的DNA疫苗为免疫原,免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠,取其脾细胞与NS1骨髓瘤细胞进行细胞融合,通过间接ELISA筛选分泌抗H1N1亚型（A/California/04/2009）抗体的杂交瘤细胞,进一步亚克隆筛选单一、稳定分泌其抗体的细胞株。结果获得能稳定分泌抗流感病毒血凝素H1亚型的单克隆抗体杂交瘤4株,分别命名为41H2、68E5、41E7和26D11。其中68E5、41E7和26D11为IgG1（K）,41H2为IgG2a（K）。运用Lenti-pseudovirus方法测试显示,26D11可识别结构性位点,具有H1N1（A/California/04/2009）专一性较强的中和能力,是中和性抗体。Western blot检测显示,41H2和41E7为阳性,识别线性位点。特异性实验表明,26D11只与H1（A/California/04/2009）亚型流感病毒发生特异性反应,而不与其他16个HA亚型流感病毒发生交叉反应,显示出良好的特异性。结论用单克隆抗体杂交瘤技术成功制备了甲型H1N1流感病毒的单克隆抗体。     

奥司他韦、利巴韦林和盐酸金刚乙胺对甲型H1N1流感病毒的抑制作用

目的 细胞水平测试奥司他韦、利巴韦林和盐酸金刚乙胺对甲型流感H1N1病毒的抑制或杀伤作用.方法 通过在MDCK细胞系和甲型H1N1病毒株间建立药物剂量-效应关系确定导致细胞死亡的效力与抑制病毒复制的效力的比值(治疗指数),测试药物的抗病毒效果.结果 奥司他韦、利巴韦林和盐酸金刚乙胺对MDCK细胞的半数中毒浓度分别为(1134.7±186.8)μg/mL、(742.0±76.9)μg/mL、(94.6±1.9)μg/mL,对甲型H1N1病毒的治疗指数(TI)分别为71.19、24.9和3.12.结论 奥司他韦对甲型H1N1病毒抑制作用最强,利巴韦林其次,盐酸金刚乙胺对甲型H1N1病毒抑制效果较弱.     

甲型H1N1流感病毒感染小鼠的发病机制

目的 甲型H1N1 流感病毒A/California/7/2009感染BALB/c小鼠,研究甲型H1N1流感病毒病毒性肺炎发病机制.方法 4～6 周龄雌性BALB/c 小鼠60只,随机分为2组,实验组和对照组,每组30只.CA7 流感病毒滴鼻制备甲流病毒感染小鼠模型.攻毒后第5天解剖实验和对照组小鼠,取肺组织,测定肺组织中IL-2,IL-6,TNF-α含量.结果 结果实验组肺组织中IL-6,TNF-α,水平明显高于对照组,IL-2水平明显低于对照组,差异均有显著性(P<0.05).结论 IL-6、TNF-α、IL-2这3种细胞因子在感染甲流病毒后的显著性变化与病毒感染后的肺组织病理损伤有密切的关系.     

季节性流感疫苗免疫血清与H7N9禽流感病毒交叉反应

目的分析接种季节性流感疫苗人群是否具有对新发H7N9流感病毒具有交叉保护,并反向检测了雪貂产生H7N9抗血清与H1/H3/H5不同亚型流感病毒的免疫反应。方法利用血凝抑制试验和微量中和实验检测疫苗免疫后人群转阳血清对A/Anhui/1(H7N9)病毒中和作用及雪貂H7N9抗血清与A/California/07/2009(H1N1)、A/PR/8/34(H1N1)、A/Brisbane/59/2007(H1N1)、A/Brisbane/10/2007(H3N2)、A/Shenzhen/406H/2006(H5N1)和A/Vietnam/1203/2004(H5N1)等不同亚型病毒的中和作用。结果季节性流感疫苗受众者转阳血清与H7N9病毒反应HI及中和抗体反应均为阴性,雪貂H7N9抗血清与H1/H3/H5不同亚型流感病毒反应HI及中和抗体反应均为阴性。结论季节性流感疫苗接种人群不具有对新发H7N9流感病毒交叉保护,并且反向验证了H7N9病毒抗血清与H1/H3/H5亚型流感病毒亦无交叉免疫反应。     

宁夏2011-2012年甲型H1N1流感病毒NAI耐药性研究

目的调查宁夏流行甲型H1N1流感病毒对神经氨酸酶抑制剂类药物的耐药情况,为抗病毒治疗提供一定参考。方法选取2011-2012年宁夏流感监测分离到的40株甲型H1N1流感病毒,通过NA基因测序分析其重要氨基酸位点变异情况,同时选取9株毒株使用化学发光法进行奥司他韦和扎那米韦两种药物的敏感性测定,分析其耐药情况。结果基因耐药结果表明,40株甲型H1N1流感病毒NA基因发生变异的氨基酸位点分别为M19I、T60N/T、V106I、V241I、N248D、N369K、N386S和D451G,未发现第275、294、152和119位氨基酸发生变异;生物耐药结果表明,奥司他韦和扎那米韦两种药物对选择的9株毒株为正常抑制。结论神经氨酸酶抑制剂类药物对宁夏流行甲型H1N1病毒均敏感,可以继续用以临床治疗,但随着抗病毒治疗病人的增加和病毒的自身变异,应加强耐药性监测以提供及时准确的耐药信息。     

甲型肝炎病毒感染树鼩的初步研究

国产树鼩口服5％甲肝病毒阳性病人新鲜大便滤波0.5ml,感染后 3～13天的动物粪便中可测出甲肝抗原,排毒持续 15～21天;用此抗原滴定5例甲肝病人双份血清有4倍以上的抗体升高,前者并能被甲肝病人恢复期血清中和;部分树鼩感染后15～45天出现转氨酶升高,食欲减退;感染2～16周的树鼩血清中可测出甲肝病毒抗体,滴度1:40～1:640,抗体阳转率78％,从感染树鼩粪便中分离的抗原为27nm的病毒颗粒,能被甲肝病毒抗体凝集;感染树鼩肝出现充血、水肿,颗粒和脂肪性变,枯否氏细胞增生。     

奥司他韦治疗甲型H1N1流感的疗效研究

目的评估奥司他韦在甲型H1N1流感病例救治中的临床疗效。方法 325例甲型H1N1流感病例被分成4组纳入研究,A组95例单服奥司他韦、B组97例口服奥司他韦和莲花清瘟胶囊、C组90例口服奥司他韦和板蓝根颗粒、D组43例单服莲花清瘟胶囊,评价第3天和第5天疗程时的临床症状和病毒学疗效。结果含有奥司他韦治疗组患者在体温复常率、临床症状消失率、咽拭子病毒阴转率方面均明显优于未含奥司他韦治疗组（P〈0.05）。单用奥司他韦治疗组与奥司他韦联合板蓝根颗粒、莲花清瘟胶囊两个联合治疗组相比,体温复常率、临床症状消失率及咽拭子病毒阴转率方面的差异无统计学意义（P〉0.05）。奥司他韦联合莲花清瘟胶囊治疗组在第3天、5天时的体温复常率和临床症状消失率均位居4个治疗组之首,但无统计学意义（P〉0.05）。结论早期服用含奥司他韦的治疗方案可显著提高咽部甲型H1N1流感病毒清除率,缩短流感病程;联用莲花清瘟胶囊治疗可能有利于改善流感症状;板蓝根颗粒对疗效无影响。     

磷酸奥司他韦联合利巴韦林对甲型H1N1流感患儿流感病毒转阴率及不良反应的影响

目的:探讨磷酸奥司他韦联合利巴韦林对甲型H1N1流感患儿流感病毒转阴率及不良反应的影响。方法:选择2018年3月—2019年3月我院收治的98例甲型H1N1流感患儿作为观察对象,随机分为对照组和观察组,各49例。对照组采用利巴韦林行静脉滴注治疗,观察组在对照组基础上采用磷酸奥司他韦口服治疗,比较两组患儿治疗效果、流感病毒转阴率及不良反应。结果:与对照组相比,观察组治疗后3d、6d的流感病毒转阴率均较高,治疗总有效率较高,差异有统计学意义(P <0.05);两组不良反应发生率对比,差异无统计学意义(P> 0.05)。结论:在甲型H1N1流感患儿中应用磷酸奥司他韦联合利巴韦林疗效显著,可提高流感病毒转阴率,安全性较高,利于患儿转归。