突变型DNA聚合酶β真核表达载体的构建及其表达

目的构建含食管癌突变型DNA聚合酶β基因(DNA polymeraseβ,polβ)的真核表达载体pcDNA4-C-polβ,使其在polβ基因敲除的EC9706细胞中表达。方法根据食管癌突变型polβ基因序列,设计并合成一对特异性引物(引物1、引物2),通过PCR扩增获得含BamHⅠ和ApaⅠ的基因序列,将其克隆入T载体,PCR及测序鉴定无误后,将其插入真核表达载体pcD-NA4-C,从而构建了含突变型polβ基因的真核表达载体pcDNA4-C-polβ。将重组质粒以脂质体包裹的方式转染入polβ基因敲除的EC 9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株。结果经过PCR筛选及DNA测序鉴定,证实真核表达载体pcDNA4-C-polβ构建成功。筛选后的EC 9706细胞经HislinkTM蛋白纯化试剂盒纯化,仅在39kD位置有一条带,证明蛋白表达及纯化成功。结论成功构建了食管癌突变型polβ基因的真核表达载体pcDNA4-C-polβ,并纯化出polβ蛋白,为进一步研究polβ的功能奠定坚实的基础。     

野生型DNA聚合酶β重组绿色荧光蛋白表达载体的构建

目的：构建携带野生型DNA聚合酶β基因(wtDNA polβ)的重组真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP—C3——polβ。方法：运用PCR方法，从质粑pcDNA3．1-polβ中扩增出wtDNA polβ的开放阅读框序列，T-A克隆至pGEM—T载体，再定向克隆至pEGFP—C3，重组质粒pEGFP—C3—polβ用限制性内切酶酶切鉴定，通用鉴定引物PCR扩增鉴定，并进行DNA序列分析。结果与结论：多种鉴定方法让实了重组载体pEGFP—C3—polβ中的wtDNA polβ序列与GenBank中已知的序列相符。携带wtDNA polβ的重组增强型绿色荧光蛋白表达载体pEGFP—C3—polβ构建成功。     

重组野生型DNA聚合酶β表达载体VRl012—polβ的构建

目的：构建含有野生型DNA聚合酶β基因的重组表达载体VRl012-polβ。方法：提取胎儿食管上皮组织的总RNA,反转录成cDNA,经PCR扩增、酶切后克隆入表达载体VRl012,重组子以小量质粒提取后酶切、PCR、测序鉴定。结果：插人片段与GenBank报道一致,并且插入方向正确。结论：重组野生型DNA聚合酶B表达载体VRl012-polβ的构建成功,为深入研究提供了工具。     

腺病毒载体介导的大鼠DNA多聚酶β重组体的构建及其在PC12细胞中的表达

【目的】为探讨DNA多聚酶β在神经细胞损伤中的作用与机制，构建其重组腺病毒载体，并在PC12细胞中表达。【方法】RT—PCR获取大鼠DNA多聚酶β（POLβ）的编码序列，TA克隆测序，酶切POLβ基因并连人穿梭质粒pAdTrack—CMV，电转至含腺病毒pAdeasy骨架质粒的大肠杆菌BJ5183。重组腺病毒质粒（pAd—polp）和Lipofectamine2000转染293细胞，用重组腺病毒感染PC12细胞。【结果】10个TA克隆中有3个克隆的序列与GENE BANK中大鼠POLβ cDNA序列完全一致，同源重组检测时30个克隆中有8个含目标条带。DNA序列正确的POLβ重组腺病毒质粒转染293细胞后，感染Ad—polβ的293及PC12细胞荧光显微镜下可见绿色荧光，重组腺病毒Ad—polβPCR鉴定含目标条带，Ad—polβ感染PC12细胞Western Blot检测到POLβ蛋白表达。【结论】成功构建了大鼠DNA多聚酶β的腺病毒重组体并在PC12细胞中表达     

人载脂蛋白M野生型和突变型表达载体的构建及鉴定

目的: 构建人载脂蛋白M (APoM)野生型和突变型原核表达载体PGEX-KG-APoM及真核表达载体PcDNA3.1(+)-APoM。方法: Trizol法抽提HePG2细胞总RNA,RT-PCR扩增APoM全长基因,将基因片断重组到PMD18-T质粒中构建PMD18-T-APoM重组质粒载体,转化到大肠埃希菌JM109后筛选阳性克隆,提取质粒酶切和测序鉴定。采用Sited-directedMutagenesis定点诱变试剂盒对APoM基因进行体外定点诱变,DNA测序鉴定定点诱变成功与否。用双酶切方法分别将APoM野生型和突变型基因定向连接到原核表达载体PGEX-KG和真核表达载体PcDNA3.1(+)中,构建野生型和突变型PGEX-KGAPoM重组体和PcDNA3.1(+)-APoM重组体,分别转化到大肠埃希菌DH5α内,提取质粒酶切鉴定和测序鉴定。结果: 成功克隆了APoM并构建了野生型和突变型原核表达载体和真核表达载体。结论: 通过RT-PCR,定点诱变及基因重组技术成功构建野生型和突变型重组表达质粒PGEX-KG-APoM和PcDNA3.1(+)-APoM,为进一步研究APoM的功能奠定了基础。     

含人DNA聚合酶β基因启动子萤光素酶报告载体的构建

目的:构建含人DNA聚合酶B(DNA polymerase beta,polβ)基因启动子的萤光素酶报告基因表达载体pGL3polβ/promoter.方法:利用PCR技术扩增人类polβ基因启动子的核心片段,克隆至含新霉素抗性的萤光素酶表达载体pGL3-Neo-enhancer,构建含DNA polβ启动子的萤光素酶表达载体pGLpolβ/promoter,重组子经双酶切、PCR及测序鉴定.将构建的载体用脂质体转染体外培养的食管癌EC-1细胞株,应用萤光素酶测定系统检测萤光素酶的表达活性.结果:测序结果表明,克隆获得的polβ基因启动子序列与GenBank报道的一致,且插入方向正确.pGL3polβ/promoter组萤光素酶的表达活性(2 207 348.000±71 626.763)与空白组(451.670±23.347)和pGL3.Neo-enhancer组(4 884.330±1 623.047)相比,差异有统计学意义(F=5 681.596,P<0.05).结论:成功构建了含人DNA polβ基因启动子的萤光素酶报告基因表达载体pGL3polβ/promoter.     

重组野生型DNA聚合酶β表达载体VR1012-polβ的构建

目的:构建含有野生型 DNA聚合酶β基因的重组表达载体VR1012-polβ.方法:提取胎儿食管上皮组织的总RNA,反转录成cDNA,经PCR扩增、酶切后克隆入表达载体VR1012,重组子以小量质粒提取后酶切、PCR、测序鉴定.结果:插入片段与GenBank报道一致,并且插入方向正确.结论:重组野生型DNA聚合酶β表达载体VR1012-polβ的构建成功,为深入研究提供了工具.     

VR1012-TCRγV1真核表达载体的构建

目的：构建含TCRγV1基因的重组表达载体。方法：从人淋巴瘤Jurkat细胞中提取总RNA,反转录合成cDNA克隆人VR1012质粒;转化感受态细菌E．Coli DH5α,以通用引物PCR扩增筛选阳性克隆．并双酶切鉴定;小量提取质粒进行测序。结果：测序结果证实重组载体叶1的外源片段序列与GenBank中TCRγV1序列完全相符。结论：成功构建了含TCRγV1基因的重组表达载体。     

DNA聚合酶β靶向siRNA真核表达载体的构建和鉴定

目的：构建DNA聚合酶β（polβ）靶向的小干扰RNA（siRNA）真核表达载体。方法：根据GenBank中人DNApolβ基因（M13140）的全长序列,利用设计分析软件设计2个DNApolβ靶向发卡样siRNA结构,退火后形成双链,克隆入表达载体pslience2.0-GFP,得到重组质粒pslience2.0-GFP-sipolβ1和pslience2.0-GFP-sipolβ2。通过限制性核酸内切酶酶切和DNA序列测定对重组质粒进行鉴定。结果：经酶切鉴定寡核苷酸已成功插入表达载体pslience2.0-GFP,DNA序列分析表明插入片段序列与合成的siRNA序列相同。结论：成功构建了靶向DNApolβsiRNA真核表达载体。     

人DNA聚合酶β全长cDNA的克隆、鉴定及真核表达载体的构建

目的 克隆人类DNA聚合酶（pol-β)基因全长cDNA，构建该基因的真核高铲表达载体。方法 抽提人胚肺纤维细胞HLF总RNA进行RT－PCR扩增，用pGEM-T载体经T／A克隆，DNA测序确定后，用双酶切将pol-β全长cDNA定向克隆到绿色荧光蛋白表达载体EGFP-Cl，转染大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆，双酶切鉴定重组质粒。结果 经RT－PCR获得1.03kb的产物，经DNA顺序，确定所扩增片段为人类pol-β基因全长cDNA，进而成功筛选出真核表达载体pEGFP-Cl-β。结论 成功构建人pol-β基因全长cDNA真核表达载体，为进一步建立该基因的高表达细胞株提供基础。     

稳定表达缺失型DNA聚合酶β的CHO细胞系的建立

目的：建立稳定表达缺失型DNA聚合酶β（polβ）的细胞系。方法：将已构建的缺失型polβ的真核表达载体pcDNA3．1-polβ用脂质体法转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO），经G418筛选后得到稳定转染的细胞株，用RT—PCR方法鉴定细胞缺失型polβmRNA的表达。结果与结论：成功转染和筛选出表达缺失型polβ细胞株CHO—polβ，建立了稳定表达缺失型polβ的CHO细胞株。     

ZAK-β蛋白激酶基因真核表达载体的构建

目的 将人源ZAK-β基因定向克隆入MSCV-IRES-GFP质粒,构建真核表达载体pMSCV-IRES-GFP-ZAK-β.方法 以肺癌A549细胞的cDNA为模板,通过PCR得到ZAK-β特异性基因产物,克隆入真核表达载体pMSCV-IRES-GFP中,获得重组真核表达载体pMSCV-IRES-GFP-ZAK-β,测序验证.结果 扩增了ZAK-β基因,经双酶切、测序鉴定证实目的基因克隆到真核表达载体pMSCV-IRES-GFP中,测序结果与预测完全一致.结论 成功构建了ZAK-β逆转录病毒表达载体,为进一步研究ZAK蛋白激酶的功能奠定了基础.     

人DNA聚合酶β全长cDNA的克隆、鉴定及真核表达载体的构建

【目的】克隆人类DNA聚合酶 (pol β)基因全长cDNA ,构建该基因的真核高效表达载体。【方法】抽提人胚肺纤维细胞HLF总RNA进行RT PCR扩增 ,用pGEM T载体经T/A克隆、DNA测序确定后 ,用双酶切将 pol β全长cDNA定向克隆到绿色荧光蛋白表达载体 pEGFP C1,转染大肠杆菌DH5α ,筛选阳性克隆 ,双酶切鉴定重组质粒。【结果】经RT PCR获得 1 0 3kb的产物 ,经DNA测序 ,确定所扩增片段为人类 pol β基因全长cDNA ,进而成功筛选出真核表达载体 pEGFP C1 β。【结论】成功构建人 pol β基因全长cDNA真核表达载体 ,为进一步建立该基因的高表达细胞株提供基础     

hERβ全长基因真核表达载体pEGFP-C1-hERβ的构建及其在PC-3M细胞中的表达

目的：构建人雌激素受体β（hERβ）全长基因的真核表达载体pEGFP-C1-hERβ,并转染激素非依赖性前列腺癌细胞株PC-3M。方法：采用RT-PCR法从卵巢囊肿患者切除的部分正常卵巢组织中钓取hERβ全长基因（1 593 bp）,与pMD18-T载体连接做全自动序列测定。将测序正确的克隆质粒pMD18-T-hERβ和表达载体pEGFP-C1分别用Hind Ⅲ和BamHⅠ进行双酶切,应用基因重组技术构建hERβ全长基因真核表达载体pEGFP-C1-hERβ。质粒经Hind Ⅲ和BamHⅠ双酶切和PCR电泳鉴定后,采用脂质体转染法转染PC-3M细胞。结果：重组质粒经限制性酶切鉴定得到与hERβ全长基因长度一致（1 612 bp）的酶切产物;测序分析证实,PCR产物与GenBank上登录的hERβ基因（NM_001437）序列完全一致,表明成功地完成了hERβ的扩增和表达载体的构建;荧光显微镜下可见转染的PC-3M细胞有绿色荧光蛋白的表达;PCR测定分析,转染细胞hERβ的表达增加。结论：构建完成真核表达载体pEGFP-C1-hERβ,hERβ基因在PC-3M细胞内成功表达。     

人TβRⅡ-IgG1Fc融合基因重组腺病毒载体的构建

目的 构建含有人TGF-β1Ⅱ型受体胞外区及IBG1Fc段融合基因的腺病毒载体,并进行初步的功能活性鉴定.方法 RT-PCR扩增人TGF-β1Ⅱ型受体胞外区及IgG1Fc段基冈,通过Overlap PCR融合为目的 基因hTβRⅡ-IgG1Fc;克隆至pAdTrack-CMV穿梭质粒,线性化后转染含骨架质粒的BJ 5183菌,同源重组构建腺病毒质粒;将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞,并扩增、纯化、RT-PCR鉴定;ELISA初步检测重组腺病毒的功能活性.结果 目的 基因经酶切分析、测序鉴定正确;RT-PCR及ELISA表明重组腺病毒能表达hTβRⅡ-IgG1Fc,中和HLF分泌的TGF-β1.结论 成功构建了含融合基因hTβRⅡ-IgG1Fc的腺病毒载体,体外实验证实表达的蛋白具有中和TGF-β1的作用.为进一步研究放射性肺纤维化的基因治疗提供实验依据.     

TCR Vβ8/pcDNA3.1重组质粒的构建

目的：构建重组质粒TCRVβ8／pcDNA3．1。方法：从人淋巴瘤Jurkat细胞中提取mRNA，经RT－PCR法获取TCRVβ基因；将表达质粒pcDNA3．1和TCRβ基因行BamHI和HindⅢ双酶切、低熔点胶纯化、连接酶切产物、转化DH5a感受态细菌、筛选菌落和测序鉴定。结果：电泳获得523bp的TCRVβ8预期条带，测序证实为正确的TCRVβ目的基因序列。结论：测是构建TCRVβ8／pcDNA3．1重组质粒的重要步骤。     

人TβRⅡ-ⅠgG1Fc融合基因重组腺病毒载体的构建

目的构建含有人TGF-βRⅡ型受体胞外区及ⅠgG1Fc段融合基因的腺病毒载体，并进行初步的功能活性鉴定。方法RT-PCR扩增人TGF-β1Ⅱ型受体胞外区及IgG1Fc段基因。通过Overlap PCR融合为目的基因hTTβRⅡ-ⅠgG1Fc；克隆至pAdTrack-CMV穿梭质粒．线性化后转染含骨架质粒的BJ5183菌．同源重组构建腺病毒质粒；将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞，并扩增、纯化、RT-PCR鉴定；ELISA初步检测重组腺病毒的功能活性。结果目的基因经酶切分析、测序鉴定正确；RT—PCR及ELISA表明重组腺病毒能表达hTβRⅡ-ⅠgG1Fc，中和HLF分泌的TGF-β1。结论成功构建了含融合基因hTβRⅡ-ⅠgG1Fc的腺病毒载体，体外实验证实表达的蛋白具有中和TGF-β1的作用，为进一步研究放射性肺纤维化的基因治疗提供实验依据。     

TGF-β1基因重组慢病毒载体的构建和鉴定

目的构建携带TGF-β1的重组慢病毒表达载体,为TGF-β1基因转染骨髓间充质细胞(BMSCs)的研究奠定基础。方法利用基因克隆技术将TGF-β1基因定向克隆至慢病毒载体,构建TGF-β1基因重组质粒,并进行PCR、酶切和测序鉴定,并通过脂质体LP2000的介导慢病毒293T细胞。结果采用基因克隆技术构建的TGF-β1重组慢病毒经PCR、酶切及测序鉴定完全正确,转染293T细胞能够正确表达。结论基因克隆技术能成功构建TGF-β1重组慢病毒载体,转染293T细胞后能够正确表达,为TGF-β1基因转染骨髓间充质细胞(BMSCs)诱导免疫移植耐受的研究奠定基础。     

缺陷型TGFβ1Ⅱ型受体真核表达质粒载体的构建

目的：本实验旨在通过构建大鼠缺陷型TGFβ1Ⅱ型受体的真核表达质粒载体,为研究大鼠肝组织因TGFβ1Ⅱ型受体缺陷而阻断TGFβ1的作用后,对人工免疫性大鼠的肝组织及其他组织的影响提供实验材料.方法：根据大鼠肝组织TGFβ1Ⅱ型受体的基因序列,设计在特异的位置添加终止密码,在此序列两端加入特异的限制性内切酶的酶切位点,从而构建大鼠的缺陷型TGFβ1Ⅱ型受体基因序列,再利用基因重组技术,将其连接在真核表达质粒载体中,对此质粒载体进行酶切电泳鉴定和DNA测序加以验证.结果：运用分子生物学技术,成功获取突变体TGFβ1Ⅱ型受体真核表达质粒载体,经过DNA测序鉴定,确认为实验预期所需.结论：TGFβ1Ⅱ型受体真核表达质粒载体构建成功,其关键涉及基因片段及载体的选择.     

重组质粒pLMP1-p53mt的构建与表达

目的构建含突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的双基因真核表达质粒,为研究突变型p53基因和EB病毒LMP1基因在鼻咽癌发生中的相互作用奠定基础.方法通过分子克隆技术,构建含突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的真核表达载体pLMP1-p53mt;培养HeLa细胞,采用脂质体lipofectAMINETM 2000将该质粒转入HeLa细胞中,转染后48h,利用免疫细胞化学法研究突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的表达情况.结果重组质粒限制性内切酶酶切及PCR鉴定结果与预期一致;观察到转染细胞中突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的高效表达.结论成功构建了含突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的双基因真核表达质粒.