HPV16 E7“自杀性”DNA疫苗的构建及其体外表达特性研究

目的构建人乳头瘤病毒16型（HPV16）E7基因的“自杀性”DNA疫苗，并研究其体外表达能力及诱导细胞凋亡作用。方法以pET32／E7质粒为模板，用PCR方法扩增HPV16 E7基因，构建真核表达重组质粒pSCA／E7，经PCR、酶切和测序鉴定正确后，将重组质粒转染BHK-21细胞，然后用免疫荧光技术检测HPV16 E7在细胞中的表达，用dUTP缺口末端标记技术（TUNEL）进行染色检测其诱导细胞凋亡作用。结果PCR扩增得到约400bp的目的基因片段，测序结果与GenBank中的东亚型HPV16 E7基因序列100％同源。免疫荧光技术检测证实，pSCA／E7重组质粒能在BHK-21细胞中表达目的基因。TUNEL检测证实，pSCA／E7重组质粒能诱导被转染的BHK-21细胞发生凋亡。结论成功构建HPV16 E7基因的重组质粒pSCA／E7，该重组质粒可在BHK-21细胞中表达，并能诱导被转染的细胞发生凋亡。     

HPV16 E5蛋白原核表达、鉴定及真核表达稳定株的筛选

目的研究HPV16 E5蛋白的生物学特性及其细胞转化机制,对HPV16 E5蛋白原核和真核表达质粒进行构建、表达和鉴定。方法以临床确诊的HPVl6感染患者子宫颈细胞DNA为模板,采用PCR方法扩增HPV16 E5基因,经BamHⅠ和HindIⅡ双酶切后插入相同酶切的pET32a（＋）载体,转染JMl09感受态细胞,并进行阳性克隆筛选。经IPTG对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS-PAGE和Wlescem blotting检测目标蛋白表达情况。将BamHⅠ和XhoⅠ双酶切pET32（＋）,E5质粒后取得的E5全基因片段转入pcDNA3．1（＋）空质粒,构建pcDNA3．1（＋）m5真核表达质粒并对NIH3T3细胞进行转染,最后用G418进行稳定表达株的筛选,并采用RT．PCR鉴定细胞内HPV16 E5基因表达情况。结果成功构建了原核表达质粒pET32/E5,在1mmol／LPTG、28℃诱导条件下BL21（DE3）菌体中HPVl6E5．TRX融合蛋白占菌体总蛋白的10％左右。真核表达质粒pcDNA3．1（＋）／E5在成功转染NIH3T3细胞后于250μg/mlG418浓度时筛选21d得到了E5基因稳定表达株,RT-PCR产物测序得到了HPV16 E5基因全序列。结论成功构建了pET32／E5原核和pcDNA3．1（＋）／E5真核表达质粒,HPV16 E5蛋白在大肠杆菌和NIH3T3细胞中的稳定表达．这些结果为进一步深入研究HPV16 E5蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用奠定了坚实基础。     

HPV18E7重组质粒的构建及在大肠杆菌中的表达优化

目的构建HPV18E7基因重组质粒,并探索其在大肠杆菌中的最佳表达条件。方法以提取的HeLa细胞株中的DNA为模板PCR扩增HPV18E7基因;将HPV18E7基因与载体pET-32a(+)连接为重组质粒pET-32a(+)-HPV18E7;将该重组质粒转入大肠杆菌BL21-DE3-pLysS细胞中,探索优化表达的条件,以获得大量HPV18E7致癌蛋白。结果 PCR扩增的目标基因大小序列与HeLa细胞中的HPV18E7基因的大小序列一致。用LB培养基,IPTG和乳糖诱导表达显示不同浓度、不同温度、不同诱导起始量等表达量均不高,尝试用ZYM-5052自动诱导培养基诱导,HPV18E7融合蛋白的表达量远远高于用异丙基-β-D-硫代吡唃半乳糖苷(IPTG)和乳糖诱导表达的表达量。结论测序正确的HPV18E7重组质粒在自动诱导培养基ZYM-5052中获得远远高于用异丙基-β-D-硫代吡唃半乳糖苷(IPTG)和乳糖诱导表达的HPV18E7融合蛋白。     

人乳头瘤病毒18型L_1基因果蝇表达系统的构建和鉴定

目的:利用基因重组技术,构建人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1基因果蝇表达质粒。方法:以pUC18-HPV18为模板,运用PCR方法扩增不含核定位序列的HPV18L1DNA片段;PCR产物连接至PGEM-TEasy质粒,并测序鉴定;将测序正确的HPV18L1DNA片段亚克隆到果蝇表达载体pMT/BiP/V5-HisA中;利用酶切及PCR方法鉴定重组质粒。结果:经双酶切及PCR鉴定,证实成功构建重组果蝇表达质粒pMT/BiP/V5-HPV18L1。结论:pMT/BiP/V5-HPV18L1重组果蝇表达质粒为下一步转染果蝇S2细胞及制备HPV18VLPs奠定了基础。     

pIRES2-HPV18E2-EGFP质粒重组及其在HeLa细胞中的表达

目的构建人乳头瘤病毒18型E2基因片段(HPV18E2)重组表达质粒并予以表达,为进一步研制HPV18相关疾病提供材料.方法以重组质粒(pBR322-HPV18)为模板,PCR方法扩增HPV18E2DNA片段,将HPV18E2DNA与加强绿色荧光质粒(pIRES2-EGFP)重组构建重组质粒(pIRES2-HPV18E2- EGFP).用酶切电泳及测序检查质粒重组后序列正确性.重组质粒转染Hela细胞.RT-PCR鉴定转染细胞中E2基因.结果 PCR扩增DNA片段约为1 kb,与预期结果相同.克隆重组质粒pIRES2-HPV18E2- EGFP酶切后显示的酶切图谱与预期相同,而且测序验证插入片段全序列无改变.转染并用G418筛选后,在荧光显微镜下可见绿色荧光细胞的表达.转染细胞RT-PCR出现特异性条带.结论成功构建表达HPV18 E2蛋白的靶细胞模型.     

HPV16 E6E7与C3d3 融合基因真核表达质粒的构建及表达

目的构建可作为DNA疫苗的包含人乳头瘤病毒16型(HPV16)E6E7与C3d3融合基因真核表达质粒,并在体外进行表达和鉴定。方法采用PCR技术扩增HPV16 E6E7片段,将该片段插入到pMDT-18载体中后,亚克隆至真核表达载体pSG.SS.C3d3.YL和pSG.SS.YL,构建E6E7与C3d3融合基因及E6E7表达质粒pSG.SS.E6E7.C3d3.YL和pSG.SS.E6E7.YL。经限制性酶切鉴定和DNA序列测定后,将重组质粒pSG.SS.E6E7.C3d3.YL、pSG.SS.E6E7.YL转染COS-7细胞,用Western blot及免疫细胞化学技术检测其表达。结果经酶切、DNA测序及转染真核细胞后表达产物的鉴定结果显示,重组质粒构建成功。结论构建的质粒可在真核细胞内正确表达,为其作为DNA疫苗诱导免疫效应的动物实验打下了基础。     

pET21b-HPV16E4重组质粒的构建及鉴定

目的 构建HPV16 E4重组表达质粒,以获得HPV16 E4活性蛋白,为进一步研究打基础.方法 从宫颈癌组织中提取DNA,用PCR方法扩增HPV16E4 DNA片段,定向克隆到原核表达载体pET21b质粒中,利用菌液PCR方法筛选重组阳性菌株.提取重组质粒,利用酶切图谱分析方法和核酸序列测定验证重组质粒pET21b-HPV16E4构建的正确性.结果 用PCR方法从宫颈癌组织中扩增出HPV16 E4片段,大小为0.3kb.从PCR筛选的重组菌株中提取重组质粒pET21b-HPV16E4,经单酶切得到5.7kb的片断,HindⅢ和BamHⅠ双酶切得到5.4kb和0.3kb两个片段,并且测序结果与已知序列相符,证实了重组质粒构建的正确性.结论 pET21b-HPV16E4重组质粒构建成功.     

人β防御素2（HBD2）与人乳头瘤病毒HPVl6E6羧基端编码基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的构建人β防御素与人乳头瘤病毒HPV16E6羧基端基因的真核表达质粒，并检测其在真核细胞中的表达情况，探讨其作为DNA疫苗治疗宫颈癌的可行性。方法利用分子克隆技术，将HBD2基因片段与HPV16E6羧基端基因片段连接，插入真核表达质粒pcDNA3．1，经测序鉴定后，用阳离子脂质体法转染真核细胞COS7，RT—PCR及免疫组化法检测其表达。结果重组质粒pcDNA3．1／HBD2～HPV16E6C转染COS7细胞48小时后，RT—PCR扩增出插入的HBD2--HPV16E6C片段，免疫组化染色呈棕黄色阳性反应。结论人β防御素与人乳头瘤病毒HPV16E6羧基端融合基因能在真核细胞中有效表达，为今后进行整体动物DNA免疫试验奠定了基础。     

HPV16-E7H2P融合钙网蛋白基因重组腺病毒载体疫苗的构建与免疫学鉴定

目的 构建表达钙网蛋白(CRT)与乳头瘤病毒16型E7基因H2P突变型(HPV16-E7H2P)融合蛋白重组腺病毒载体(Ad-CRT/HPV16-E7 H2P),为研发新型乳头瘤病毒治疗性疫苗奠定基础.方法 首先利用RT-PCR的方法扩增CRT基因,并进一步构建CRT与HPV16-E7H2P基因融合重组的pJW4303表达载体,将目的基因加上特定的CACC接头后克隆入载体pENTR/D-TOPO以获得入门克隆.经过入门克隆与表达载体(pAd-CMV/V5-DEST)间的重组反应获得表达克隆Ad-CRT/HPV16-E7 H2P.表达克隆线性化后转染HEK293A包装细胞,得到重组腺病毒.结果 构建的Ad-CRT/HPV16-E7H2P经PCR和测序鉴定构建正确;转染HEK293A细胞并扩增后获得的病毒滴度为1.95 × 1011 pfu/mL,该重组病毒载体能正确表达CRT/HPV16-E7H2P融合蛋白.结论 成功构建了Ad-CRT/HPV16-E7H2P,为HPV慢性感染以及宫颈癌的防治奠定了基础     

肺炎衣原体0308基因真核表达载体构建及表达检测

目的构建肺炎衣原体AR39株Cpn0308基因真核表达重组质粒,体外转染HeLa细胞并检测表达情况,为Cpn核酸疫苗的研制做准备。方法应用PCR技术从CpnAR39株基因组中扩增Cpn0308全长基因,重组入pcDNA3.1/HisA真核表达载体相应位点,进行酶切鉴定和序列分析后,运用脂质体介导重组质粒转染HeLa细胞,间接免疫荧光技术检测目的蛋白在真核细胞中表达情况。结果 PCR扩增得到393bp的特异性Cpn0308基因,筛选鉴定出pcDNA3.1/HisA-Cpn0308真核表达重组体,序列测定证实与GeneBank登录的CpnAR39株Cpn0308基因一致;间接免疫荧光法检测到重组质粒转染的HeLa细胞能够表达目的蛋白。结论成功构建pcDNA3.1/HisA-Cpn0308真核表达重组体,且该重组体能够在体外真核细胞中表达目的蛋白,为进一步研究CpnDNA疫苗以及研究该蛋白的生物学功能提供实验基础。     

融合DNA疫苗CRT180/HPV6E7的构建及其免疫学特性研究

目的 构建融合DNA疫苗CRT180/HPV6E7,并评价其体外实验和动物模型上的免疫学特性,尤其是抗病毒致病基因的特异性细胞免疫反应.方法 分别构建DNA重组体pcDNA3.1-CRT180/HPV6E7,pcDNA3.1-CRT180,pcDNA3.1-HPV6E7.将pcDNA3.1-HPV6E7质粒经脂质体介导转染B16细胞,以G418筛选阳性细胞集落,荧光显微镜观察和RT-PCR鉴定表达HPV6E7的阳性细胞株.将质粒DNA肌注免疫C57BL/6小鼠,3次后取全血经流式细胞仪检测T细胞亚群的变化,LDH法检测小鼠的脾细胞和淋巴细胞与靶细胞B16/HPV6E7孵育后的CTL活性以及ELISA法检测共孵育上清中IL-2和IFN-γ浓度的变化.结果 各组质粒经鉴定表明构建正确.转染后细胞株稳定表达HPV6E7.DNA疫苗免疫小鼠后,pcDNA3.1-CRT180/HPV6E7免疫组较pcDNA3.1-HPV6E7免疫组的外周血CD8 T细胞和TCRγδT细胞的比例显著增加,脾细胞和淋巴细胞针对靶细胞B16/HPV6E7的CTL杀伤活性更明显,分泌IL-2和IFN-γ的水平升高(P＜0.05).结论 CRT180与HPV致病基因6E7相连的重组质粒疫苗pcDNA3.1-CRT180/HPV6E7能引发小鼠T细胞亚群CD8 分化并诱导出显著的特异性CTL反应.推测CRT180/HPV6E7 DNA疫苗在动物模型上可以有效激活抗HPV特异性细胞免疫,有利于病毒感染的清除.     

人乳头瘤病毒16型E7C端亚基因片段的克隆与表达

目的旨在获得无转化活性而保留抗原性的人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）Ｅ７Ｃ端,为进一步研制抗ＨＰＶ１６疫苗打下基础。方法应用自行设计合成的引物进行ＰＣＲ扩增ＨＰＶ１６Ｅ７Ｃ端亚基因片段,并克隆入真核表达载体ｐＬＮＣＸ。结果准确获得含有Ｅ７Ｃ亚基因片段的重组质粒ｐＬＮＣＥ７Ｃ,将ｐＬＮＣＥ７Ｃ转染Ｂ１６细胞。对Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交阳性克隆应用Ｅ７多抗进行免疫组织化学方法检测,检出Ｅ７Ｃ的表达。结论所构建的表达质粒适于ＤＮＡ疫苗的制备。     

HPV16E6羧基端编码基因的克隆及真核细胞表达

目的探讨用人乳头瘤病毒16型(HPV16)早期基因E6羧基端基因片段(E6C)研制DNA疫苗的可行性。方法采用PCR方法从质粒pHPVl6中获得E6C端基因片段,将其克隆入含巨细胞病毒(CMV)启动子的真核表达载体,脂质体介导基因转染LA795小鼠肺腺癌细胞并检测E6C的表达。结果成功构建了真核表达质粒pLNCE6C,免疫组化结果显示真核表达质粒pLNCF6C在LA795细胞中获得有效表达。结论选择去除转化功能区的E6C端基因构建真核表达质粒是一有益的尝试,为进行动物DNA免疫试验奠定了基础。     

人乳头瘤病毒16型E7DNA疫苗的构建及其诱导特异性淋巴细胞增殖的研究

目的 :探讨人乳头瘤病毒 16型 (HPV16 )E7DNA疫苗诱导机体特异性细胞免疫应答的情况。方法 :采用分子克隆技术 ,构建HPV16野生型E7基因的真核表达重组体 ,将其转化大肠杆菌JM10 9进行筛选 ,通过限制性内切酶酶切鉴定和PCR分析 ,证明重组质粒中目的基因插入片段及载体DNA大小、方向、插入位点均正确 ,获得HPV16E7DNA疫苗 ,将E7DNA疫苗经皮内注射免疫动物 ,MTT比色法体外检测特异性淋巴细胞增殖反应。结果 :野生型E7DNA疫苗免疫组脾淋巴细胞在体外受到E7蛋白的再次刺激后出现特异性淋巴细胞增殖反应。结论 :野生型E7DNA疫苗可诱导特异性的细胞免疫应答 ,皮内注射HPVDNA疫苗是一种简便有效的免疫接种途径     

HPV58型E7基因重组痘苗疫苗免疫保护作用的实验研究

目的制备含人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)58型E7基因的重组痘苗病毒疫苗,并利用动物肿瘤模型观察疫苗接种效果。方法利用PCR方法扩增HPV58E7DNA片段,在消除其转化活性的基础上,构建表达HPV58E7的重组痘苗病毒疫苗并免疫小鼠,观察该疫苗对E7阳性肿瘤细胞生长的抑制作用,体外诱导、测定细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocytes,CTL)活性。结果经定点突变的HPV58E7基因转化活性显著降低,用突变的E7基因构建的重组痘苗病毒免疫小鼠后,能抑制E7阳性肿瘤细胞在小鼠体内的生长并延长小鼠的生存期;免疫小鼠脾淋巴细胞体外可诱导产生针对E7阳性肿瘤的CTL细胞。结论在消除转化活性的基础上,HPV58E7可用于治疗与HPV58感染有关的肿瘤。     

深圳地方株人乳头瘤病毒18型E6E7基因的克隆、序列分析及E6/E7融合基因的构建

[摘要] 目的 克隆人乳头瘤病毒18型E6E7基因序列,构建E6/E7融合基因,为HPV治疗性疫苗的研制打下基础。方法 采用PCR 技术扩增1例HPV18阳性患者组织中HPV18 E6E7基因。将PCR产物回收,插入pSC-A质粒载体构建pSC-A/HPV18 E6E7重组质粒并进行核酸限制性内切酶鉴定及DNA测序分析;通过点突变方法使HPV18 E6、E7基因的开放读码框(ORF)融合以简化后续的基因表达问题。结果 成功构建了pSC-A/HPV18E6E7重组质粒,测序分析表明克隆的HPV18 E6E7基因与GenBank收录的德国株(AY262282)完全一致,点突变成功使E6基因的终止密码子突变,使HPV18 E6、E7基因融合。结论 本研究获得了正确的HPV18 E6E7基因,为其重组表达及其相关研究奠定了良好基础。     

肺炎链球菌黏附素A基因疫苗的构建及对小鼠鼻咽部肺炎链球菌携带的防御作用

目的 探讨肺炎链球菌表面黏附素A(PsaA)基因疫苗的免疫原性及其对小鼠鼻咽部肺炎链球菌携带的防御作用.方法 PCR技术从肺炎链球菌R6标准株扩增PsaA基因,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-PsaA,脂质体法转染BHK-21细胞,逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫印迹(Western blot)检测重组质粒在BHK-21细胞中的转录和表达.应用PsaA基因疫苗肌肉注射免疫BABL/c小鼠,ELISA检测脾细胞上清IFN-γ分泌,特异性抗体IgG水平及其亚型分布(IgG1/IgG2a).利用BABL/c小鼠肺炎链球菌D39株鼻咽部携带模型,鼻咽部灌洗液菌落计数观察免疫小鼠鼻咽部肺炎链球菌携带改变.结果 RT-PCR及Western blot显示重组PsaA蛋白在BHK-21细胞瞬时表达,ELISA检测到免疫小鼠血清高水平的IFN-γ及特异性IgG抗体(IsG1/IgG2a＜1),小鼠攻击实验证明PsaA基因疫苗免疫组小鼠D39携带菌落计数明显少于对照组(P＜0.01).结论 肺炎链球菌表面毒力蛋白PsaA基因疫苗免疫小鼠激发了抗原特异性的细胞及体液免疫反应,显著减少了小鼠鼻咽部肺炎链球菌的携带,为肺炎链球菌DNA疫苗理想侯选抗原之一.