HPV58E6基因的克隆及体外表达

目的：克隆并体外表达HPV58E6，为E6致癌作用和疫苗的研究奠定基础。方法：通过PCR方法从HPV58全基因克隆中扩增出HPV58E6基因片段，利用基因重组技术，将其克隆至真核表达质粒pcDNA3的T7启动子下游，体外转录成mRNA后，在源自网织红细胞的翻译缓冲液中表达生物素标记的HPV58E6蛋白，化学发光法检测，X光胶片曙光显影鉴定，结果：酶切电泳证实质粒构建正确，SDS-PAGE电泳显示在相当于HPV58E6分子量约18.8kD的位置出现条带，X光胶片亦在相应位置出现印迹条带。结论：成功表达了含有生物素标记的HPV58E6蛋白，为其致癌作用和治疗的研究奠定基础。     

高危人乳头瘤病毒58型E6基因的克隆及表达

目的：获得含人乳头瘤病毒(HPV)58型E6基因的克隆及表达重组体并体外表达E6蛋白．方法：聚合酶链方法从1例宫颈腺癌患者癌组织DNA中获得HPV58 E6基因,并将其与克隆载体pGEM—T Easy连接,获得重组体HPV58-E6-pGEM—T,继之以双酶切将E6基因与同样双酶切的线性化的pRSET-A表达载体连接,得到E6表达重组体pRSET-58E6,转化E．coliBL21(DE3),用LPTG诱导表达．结果：从1例宫颈癌患者中成功获得了少见HPV58型的E6基因并构建了其重组表达载体．经IPTG诱导后可表达M24000的6His HPV58E6融合蛋白,表达量占菌体蛋白的10％．结论：成功获得了少见HPV58高危型的E6基因,并可在E．coli中高效表达．     

人乳头瘤病毒58型E7基因重组真核表达质粒的构建与序列分析

目的:构建含人乳头瘤病毒58型(HPV58)E7基因的真核表达质粒,获得HPV58感染人后病毒基因结构的基本信息。方法:用HPV型特异性引物扩增出HPV58型E7 DNA,将HPV58 E7 DNA与PBS-T载体连接,获得克隆重组体HPV58 E7-PBS-T,经双酶切鉴定后,将E7基因与真核表达载体PCDNA3.1连接,然后经双酶切、测序鉴定,通过GenBank的数据库分析软件对HPV58型E7基因进行同源性分析。结果:双酶切重组DNA结果显示,重组体中HPV58型E7基因片段和载体DNA大小与预期计算一致,经BLAST比对,与GenBank数据库中的HPV58型E7基因序列具有高度的同源性,其中与1991年日本学者最早报道HPV58型E7基因相比,仅125位一个碱基的差异,即C-T的突变;推导相应的氨基酸由脯氨酸(pro)变为亮氨酸(leu)。结论:构建了含HPV58型E7基因的真核表达质粒,其基因序列与报道的基因序列高度同源,其微小差异对功能有无影响有待探讨。该重组质粒的构建为HPV58型E7基因及表达蛋白的功能研究奠定基础。     

HPV 58在宫颈癌组织中的感染分析及其转化基因的克隆

目的 分析中国陕西宫颈癌组织中HPV58的感染情况并克隆其E6、E7主要转化基因.方法 采用HPV GP5+/GP6+通用引物PCR 扩增58例宫颈癌组织DNA粗提物,继之将荧光偏振技术与模板指导的末端延伸反应(TDI-FP)结合,应用探针杂交延伸反应检测HPV58.用特异性引物随机从1例 HPV58 阳性标本中PCK 扩增HPV58 E6、E7基因,将其分别与pGEM-T Easy载体连接,所获得的重组质粒经内切酶消化和测序鉴定.结果 58例宫颈癌标本中10例(17.24%)为HPV 58阳性,克隆获得的HPV 58 E6、E7重组质粒经BLAST分析证实分别含有HPV 58完整的E6、E7基因,与GenBank收录的标准株比较,E6、E7基因分别有5个和2个硷基发生变异,可导致相应的蛋白质氨基酸序列中分别有4个和1个氨基酸替换.结论 中国陕西人宫颈癌组织中HPV 58感染较为多见,且HPV 58 E6和E7转化基因的硷基序列与标准株有所差异.本研究为下一步HPV 58相关肿瘤诊断试剂及疫苗的研制奠定了基础.     

pIRES2-HPV18E2-EGFP质粒重组及其在HeLa细胞中的表达

目的构建人乳头瘤病毒18型E2基因片段(HPV18E2)重组表达质粒并予以表达,为进一步研制HPV18相关疾病提供材料.方法以重组质粒(pBR322-HPV18)为模板,PCR方法扩增HPV18E2DNA片段,将HPV18E2DNA与加强绿色荧光质粒(pIRES2-EGFP)重组构建重组质粒(pIRES2-HPV18E2- EGFP).用酶切电泳及测序检查质粒重组后序列正确性.重组质粒转染Hela细胞.RT-PCR鉴定转染细胞中E2基因.结果 PCR扩增DNA片段约为1 kb,与预期结果相同.克隆重组质粒pIRES2-HPV18E2- EGFP酶切后显示的酶切图谱与预期相同,而且测序验证插入片段全序列无改变.转染并用G418筛选后,在荧光显微镜下可见绿色荧光细胞的表达.转染细胞RT-PCR出现特异性条带.结论成功构建表达HPV18 E2蛋白的靶细胞模型.     

HPV16E7基因的原核克隆及表达

目的:探讨从喉癌组织中HPV16 E7蛋白的原核克隆及表达.方法:采用PCR方法扩增HPV16 E7基因,经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后插入相同酶切pET28a(+)载体,转化JM109感受态细胞,并进行阳性克隆筛选.经IPTG对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测目标蛋白表达情况.结果:成功构建了原核表达质粒pET28/E7、HPV16 E7融合蛋白在BL21(DE3)菌株中高效表达.结论:HPV16 E7融合蛋白的表达为进一步深入研究HPV16E7蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用机制奠定了基础.     

人乳头瘤病毒6b型重组减毒沙门菌的构建及表达

目的：构建HPV6b L1-E7嵌合基因重组减毒沙门菌，为进一步粘膜免疫奠定基础。方法：用PCR方法扩增获得HPV6b的L1－E7嵌合基因片段，TA克隆后，再将L1－E7基因克隆入pTETnir15沙门菌表达质粒。用电转化法将重组表达质粒导入鼠伤寒减毒沙门菌S.BRD509(ΔaroA,ΔaroC)中，厌氧诱导其表达，蛋白样品做SDS－PAGE凝胶电泳和western blot分析。结果：用BamHI和SalI双酶切重组表达质粒pTETnir15-6bL1E7可释放2389bp和1554bp两片段，结果与预计相符。western blot结果显示，重组沙门菌在约56KD处有明显特异蛋白条带，而对照菌则无。结论：该重组沙门菌能特异地表达HPV6b L1-E7融合蛋白，人乳头瘤病毒HPV6b L1-E7重组减毒沙门菌构建成功。     

宫颈癌组织中HPV16E6的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的进行人乳头瘤病毒16型相关肿瘤的E6血清学研究。方法采用聚合酶链反应(PCR)从宫颈癌组织DNA中扩增出HPV16E6基因片段,克隆至测序质粒pGEM-T中,并用限制性内切酶将HPV16E6基因切下,克隆至表达质粒pGEMEX-1中,经IPTG诱导表达为融合蛋白,分子量约45KD。结果融合蛋白占菌体总蛋白的25％,免疫印迹检测表明HPV16E6融合蛋白能被抗HPV16E6抗体识别。结论大肠杆菌表达HPV16E6蛋白的获得可为HPV相关性肿瘤的血清学诊断和流行病学研究打下基础。     

人乳头瘤病毒16型E7基因原核表达载体的构建及表达

目的: 构建人乳头瘤病毒16型 (HPV-16) E7基因原核表达载体,观察目的基因的蛋白表达。方法:人工合成HPV16 E7基因核苷酸序列,利用特异性引物通过聚合酶链反应扩增HPV16 E7基因,并克隆至pGEX-4T1原核表达载体,构建重组表达载体pGEX-4T1-HPV16-E7。 将其转化到工程菌Rosetta后,经IPTG诱导表达,进行E7-GST融合蛋白的SDS-PAGE分析和Ni2+-NTA亲和层析纯化。结果: E7基因PCR扩增产物和重组表达质粒的双酶切产物经琼脂糖
凝胶电泳,均可见300 bp的目的基因条带。表达的重组蛋白经SDS-PAGE电泳和纯化后,在相对分子质量约36 000处有特异性表达带,与预期相符。结论: 在原核系统中含E7基因的重组质粒可有效表达E7-GST融合蛋白。     

生物素标记的 HPV11、16、18、51型 DNA 探针的制备

通过大量培养克隆有 HPV11、16、18、51型 DNA 序列的菌株,扩增其质粒,并采用碱变性法提取、纯化质粒 DNA,然后对质粒进行酶切、电泳回收 HPV DNA 片段并进行生物素标记,制备出生物素标记的 HPV11、16、18、51型 DNA 探针.用斑点杂交方法检测探针的灵敏度为 HPV11、16型0.05pg,HPV18 0.25 pg,HPV51 0.1 pg.     

HPV58 E2 DNA疫苗的构建及免疫原性研究

目的探讨人乳头瘤病毒58型（HPV58）早期基因E2作为DNA疫苗候选抗原的可行性。方法构建HPV58 E2真核重组表达载体pcDNA3/58E2,转染SiHa细胞,利用RT PCR检测HPV58E2 mRNA的转录。pcDNA3/58E2 DNA肌肉注射免疫BALB/C小鼠,ELISA检测小鼠血清中特异性anti HPV58E2 IgG水平。结果RT PCR结果表明,pcDNA3/58E2能够在真核细胞中有效转录HPV58E2mRNA。动物实验表明,质粒pcDNA3/58E2肌肉接种可诱导免疫小鼠产生抗E2特异性抗体。结论本研究成功构建了重组真核表达载体pcDNA3/58E2,并初步证明HPV58 E2 DNA 疫苗有良好的免疫原性。     

人β防御素2（HBD2）与人乳头瘤病毒HPVl6E6羧基端编码基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的构建人β防御素与人乳头瘤病毒HPV16E6羧基端基因的真核表达质粒，并检测其在真核细胞中的表达情况，探讨其作为DNA疫苗治疗宫颈癌的可行性。方法利用分子克隆技术，将HBD2基因片段与HPV16E6羧基端基因片段连接，插入真核表达质粒pcDNA3．1，经测序鉴定后，用阳离子脂质体法转染真核细胞COS7，RT—PCR及免疫组化法检测其表达。结果重组质粒pcDNA3．1／HBD2～HPV16E6C转染COS7细胞48小时后，RT—PCR扩增出插入的HBD2--HPV16E6C片段，免疫组化染色呈棕黄色阳性反应。结论人β防御素与人乳头瘤病毒HPV16E6羧基端融合基因能在真核细胞中有效表达，为今后进行整体动物DNA免疫试验奠定了基础。     

融合DNA疫苗CRT180/HPV6E7的构建及其免疫学特性研究

目的 构建融合DNA疫苗CRT180/HPV6E7,并评价其体外实验和动物模型上的免疫学特性,尤其是抗病毒致病基因的特异性细胞免疫反应.方法 分别构建DNA重组体pcDNA3.1-CRT180/HPV6E7,pcDNA3.1-CRT180,pcDNA3.1-HPV6E7.将pcDNA3.1-HPV6E7质粒经脂质体介导转染B16细胞,以G418筛选阳性细胞集落,荧光显微镜观察和RT-PCR鉴定表达HPV6E7的阳性细胞株.将质粒DNA肌注免疫C57BL/6小鼠,3次后取全血经流式细胞仪检测T细胞亚群的变化,LDH法检测小鼠的脾细胞和淋巴细胞与靶细胞B16/HPV6E7孵育后的CTL活性以及ELISA法检测共孵育上清中IL-2和IFN-γ浓度的变化.结果 各组质粒经鉴定表明构建正确.转染后细胞株稳定表达HPV6E7.DNA疫苗免疫小鼠后,pcDNA3.1-CRT180/HPV6E7免疫组较pcDNA3.1-HPV6E7免疫组的外周血CD8 T细胞和TCRγδT细胞的比例显著增加,脾细胞和淋巴细胞针对靶细胞B16/HPV6E7的CTL杀伤活性更明显,分泌IL-2和IFN-γ的水平升高(P＜0.05).结论 CRT180与HPV致病基因6E7相连的重组质粒疫苗pcDNA3.1-CRT180/HPV6E7能引发小鼠T细胞亚群CD8 分化并诱导出显著的特异性CTL反应.推测CRT180/HPV6E7 DNA疫苗在动物模型上可以有效激活抗HPV特异性细胞免疫,有利于病毒感染的清除.     

人乳头瘤病毒16型E7DNA疫苗的构建及其诱导特异性淋巴细胞增殖的研究

目的 :探讨人乳头瘤病毒 16型 (HPV16 )E7DNA疫苗诱导机体特异性细胞免疫应答的情况。方法 :采用分子克隆技术 ,构建HPV16野生型E7基因的真核表达重组体 ,将其转化大肠杆菌JM10 9进行筛选 ,通过限制性内切酶酶切鉴定和PCR分析 ,证明重组质粒中目的基因插入片段及载体DNA大小、方向、插入位点均正确 ,获得HPV16E7DNA疫苗 ,将E7DNA疫苗经皮内注射免疫动物 ,MTT比色法体外检测特异性淋巴细胞增殖反应。结果 :野生型E7DNA疫苗免疫组脾淋巴细胞在体外受到E7蛋白的再次刺激后出现特异性淋巴细胞增殖反应。结论 :野生型E7DNA疫苗可诱导特异性的细胞免疫应答 ,皮内注射HPVDNA疫苗是一种简便有效的免疫接种途径     

CONSTRUCTION AND IMMUNOGENICITY OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPE 6B L1 RECOMBINANT PLASMID

Objective To construct a DNA vaccine as a prophylactic model to prevent condyloma acuminatum and detect its immunogenicity in mice. Methods The major capsid protein (L1) gene of human papillomavirus (HPV) 6b was inserted into an eukaryotic expression plasmid (pcDNA3.1). The recombinant plasmid was transfected into COS-7 cells. Western blot were performed to detect whether L1 protein can be expressed in eukaryotic cells. Eighteen female BALB/c mice were tested for immunogenicity study. Results The recombinant plasmid (pcDNA3. 1-HPV6bL1) was verified as HPV6b L1 gene by sequencing. Western blot showed specific strip. Anti-L1 protein antibodies could be detected in the mice‘s sera inoculated with pcDNA3.1-HPV6bL1. Similarly, IL-4, IL-2, and IFN-γ were increased in the same mice. Conclusion HPV6b L1 recombinant plasmid was constructed successfully which had immunogenicity for BALB/c mice. It provided experimental evidence for the research of DNA vaccine of condyloma acuminata.     

HPV58型E7基因重组痘苗疫苗免疫保护作用的实验研究

目的制备含人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)58型E7基因的重组痘苗病毒疫苗,并利用动物肿瘤模型观察疫苗接种效果。方法利用PCR方法扩增HPV58E7DNA片段,在消除其转化活性的基础上,构建表达HPV58E7的重组痘苗病毒疫苗并免疫小鼠,观察该疫苗对E7阳性肿瘤细胞生长的抑制作用,体外诱导、测定细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocytes,CTL)活性。结果经定点突变的HPV58E7基因转化活性显著降低,用突变的E7基因构建的重组痘苗病毒免疫小鼠后,能抑制E7阳性肿瘤细胞在小鼠体内的生长并延长小鼠的生存期;免疫小鼠脾淋巴细胞体外可诱导产生针对E7阳性肿瘤的CTL细胞。结论在消除转化活性的基础上,HPV58E7可用于治疗与HPV58感染有关的肿瘤。     

HPV16E6羧基端编码基因的克隆及真核细胞表达

目的探讨用人乳头瘤病毒16型(HPV16)早期基因E6羧基端基因片段(E6C)研制DNA疫苗的可行性。方法采用PCR方法从质粒pHPVl6中获得E6C端基因片段,将其克隆入含巨细胞病毒(CMV)启动子的真核表达载体,脂质体介导基因转染LA795小鼠肺腺癌细胞并检测E6C的表达。结果成功构建了真核表达质粒pLNCE6C,免疫组化结果显示真核表达质粒pLNCF6C在LA795细胞中获得有效表达。结论选择去除转化功能区的E6C端基因构建真核表达质粒是一有益的尝试,为进行动物DNA免疫试验奠定了基础。     

HPV6b野生型E7基因与优化密码E7基因mRNA表达的分析

目的:构建人乳头瘤病毒6b型(HPV6b)E7基因重组真核表达质粒,比较优化密码E7基因(hu-E7)与野生型E7基因(wtE7)在mRNA水平的表达差异,初步探讨优化密码增强E7基因表达的机制。方法:EcoRI和KpnI双酶切pUC-wtE7质粒,游离wtE7片段,定向克隆入pcDNA3的EcoRI和KpnI位点,构建含wtE7的重组真核表达质粒pcDNA3-wtE7;与含hu-E7的pcDNA3-huE7质粒同时体外脂质体转染人羊膜细胞(wish细胞),提取细胞总RNA,采用RT-PCR方法,以β-actin做内参照半定量分析比较hu-E7与wtE7在wish细胞内的mRNA表达水平。结果:用EcoRI和KpnI双酶切重组表达质粒pcDNA3-wtE7可释放5.4kb和314bp两片段,说明质粒构建正确。RT-PCR结果显示,HPV6b-huE7与HPV6b-wtE7转染组在预计分子量190bp处均有明显特异性条带,对照组则无。凝胶成像分析仪半定量结果分析,二者无明显差异,无统计学意义P>0.05。结论:成功构建pcDNA3-wtE7真核表达质粒,并在wish细胞中获得特异性E7mRNA表达。HPV6b-hu-E7与HPV6b-wtE7基因在wish细胞内特异性E7mRNA的表达水平没有明显差异。     

HPV16 E5蛋白原核表达、鉴定及真核表达稳定株的筛选

目的研究HPV16 E5蛋白的生物学特性及其细胞转化机制,对HPV16 E5蛋白原核和真核表达质粒进行构建、表达和鉴定。方法以临床确诊的HPVl6感染患者子宫颈细胞DNA为模板,采用PCR方法扩增HPV16 E5基因,经BamHⅠ和HindIⅡ双酶切后插入相同酶切的pET32a（＋）载体,转染JMl09感受态细胞,并进行阳性克隆筛选。经IPTG对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS-PAGE和Wlescem blotting检测目标蛋白表达情况。将BamHⅠ和XhoⅠ双酶切pET32（＋）,E5质粒后取得的E5全基因片段转入pcDNA3．1（＋）空质粒,构建pcDNA3．1（＋）m5真核表达质粒并对NIH3T3细胞进行转染,最后用G418进行稳定表达株的筛选,并采用RT．PCR鉴定细胞内HPV16 E5基因表达情况。结果成功构建了原核表达质粒pET32/E5,在1mmol／LPTG、28℃诱导条件下BL21（DE3）菌体中HPVl6E5．TRX融合蛋白占菌体总蛋白的10％左右。真核表达质粒pcDNA3．1（＋）／E5在成功转染NIH3T3细胞后于250μg/mlG418浓度时筛选21d得到了E5基因稳定表达株,RT-PCR产物测序得到了HPV16 E5基因全序列。结论成功构建了pET32／E5原核和pcDNA3．1（＋）／E5真核表达质粒,HPV16 E5蛋白在大肠杆菌和NIH3T3细胞中的稳定表达．这些结果为进一步深入研究HPV16 E5蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用奠定了坚实基础。