LAMP在临床上诊断肺结核的应用评价

目的探究环介导等温扩增(LAMP)法在临床上诊断肺结核中的应用价值。方法选取2019年5月至2020年3月在本院进行检查的100例疑似肺结核症状的患者,所有患者均经临床确诊后分为肺结核组与非结核病组,各50例。所有患者均行LAMP检测、L-J培养及痰涂片检查。以痰涂片检查作为诊断肺结核金标准,比较LAMP、痰培养在结核分枝杆菌阳性检出率,并分析LAMP、L-J培养在肺结核中的诊断价值。结果50例肺结核组患者中LAMP共检出阳性50例,阳性率为100.00%;L-J培养共检出阳性39例,阳性率为78.00%,LAMP结核分枝杆菌阳性检出率高于L-J培养,差异有统计学意义(P<0.05);LAMP检查在诊断结核中灵敏度、阴性预测值均高于L-J培养,差异有统计学意义(P<0.05);LAMP检查与L-J培养诊断肺结核的特异度、准确度及阳性预测值比较差异无统计学意义。结论LAMP法在诊断肺结核中具有较高的灵敏度,且在结核分枝杆菌中阳性检出率较高,检测过程中具有操作简便、准确率高等优势,可用于结核病早期检测。     

结核分枝杆菌检测技术研究进展

结核是由结核分枝杆菌引起的一种世界性疾病,为最受关注的公共卫生问题之一。虽然近年来结核病的发病率呈下降趋势,但其对人类健康造成的危害仍十分严峻。患者的及时上报是结核病防控的重要环节之一,报告率的上升有助于提高结核的治愈率以及卫生机构对结核患者的管理强度。快速、准确的诊断方法直接影响结核病的报告率,影响疾病传播和患者管理,是控制结核发病的基础。近年来,分子诊断技术发展迅速,为结核病的快速诊断提供了新的思路。分子诊断技术检测速度快,灵敏度、特异度、准确率高,绝大多数技术成本低廉,可同时对多个样本进行检测,实用性较强,具有较好的发展前景。本文对现阶段临床上实际应用的结核诊断技术与近年来出现的新型分子诊断技术进行简要概述。     

环介导等温扩增技术在疾控机构微生物检测中的应用

环介导等温扩增技术(LAMP)是一种新型的体外等温扩增特异核酸片段的技术,具有特异性强、灵敏度高、快速简便等优点.本文综述了近年来LAMP在微生物检测领域的具体应用实例和研究进展,并对其应用前景做了展望.     

环介导等温扩增技术对结核分枝杆菌检测的临床应用价值

目的评估环介导等温扩增技术(LAMP)对肺结核的诊断价值。方法回顾性分析2017年4月至2018年9月郑州大学第一附属医院进行LAMP检测的413例患者,其中LAMP检测标本情况为肺泡灌洗液266例、痰标本147例。根据临床诊断情况将患者分为肺结核病组和非肺结核病组。将患者抗结核治疗前的LAMP结果与最终临床诊断及痰涂片结果进行比较,评价其敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比及阴性似然比。应用χ~2检验对肺结核患者肺泡灌洗液及痰标本的阳性率差异进行分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果 413例中119例(28.8%)为临床诊断的肺结核病患者,其中65例LAMP阳性,LAMP的综合敏感度为54.6%(65/119)。294例(71.2%)为非肺结核病患者,其中276例LAMP检测结果为阴性,特异度为93.9%(276/294),阳性预测值为78.3%(65/83),阴性预测值为83.6%(276/330),阳性似然比为11.42,阴性似然比为0.32。LAMP在痰涂片阳性标本中的敏感度为95.2%,在痰涂片阴性标本中的敏感度为45.9%,特异度为93.9%。在临床诊断肺结核患者中肺泡灌洗液标本和痰标本中LAMP的阳性率分别为63.2%(48/76)和39.5%(17/43)(χ~2=6.183,P<0.05)。结论 LAMP检测痰标本和肺泡灌洗液标本中的结核分枝杆菌用于结核病诊断具有良好的特异度。在临床诊断的肺结核患者中,LAMP对肺泡灌洗液标本检出的阳性率高于痰标本。     

环介导等温扩增技术联合结核分枝杆菌快速培养在涂阴肺结核中的诊断价值

目的探讨环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification metliod,LAMP,新型的核酸扩增技术)联合结核分枝杆菌快速培养(BACTEC MGIT 960,结核分枝杆菌检测仪)在痰涂片阴性肺结核中的诊断价值。方法收集疑似肺结核患者90例,随机分成A、B、C组,A组通过指南推荐涂阴肺结核诊断,B组通过LAMP确诊,C组通过LAMP联合BACTEC MGIT 960确诊,并给予抗结核治疗2个月后随访所有入组患者胸部CT变化情况,分别比较涂阴肺结核诊断方法、LAMP及LAMP联合BACTEC MGIT 960的诊断可靠性。结果涂阴肺结核指南推荐诊断阳性率40.0%,LAMP阳性率53.3%、联合检测阳性率60.0%,差异无统计学意义。联合检测敏感性88.9%,特异性91.7%均明显升高。结论在实际临床中,环介导等温扩增技术联合结核分枝杆菌快速培养(BACTEC MGIT 960)在痰涂片阴性肺结核诊断中特异性及敏感性高。     

环介导等温扩增技术在检测痰标本结核分枝杆菌中的应用

目的评价结核分枝杆菌环介导等温扩增技术（LAMP）快速检测试剂盒的临床应用效果。方法选取肺结核患者183例（肺结核组）和非肺结核患者120例（对照组）。采用涂片抗酸染色、罗氏培养法和LAMP对痰标本进行检测,采用结核分枝杆菌核酸扩增荧光检测试剂盒（TB- PCR）检测罗氏培养与LAMP结果不符的标本,分析LAMP与罗氏培养的检出率及两者的符合率。结果去除经鉴定为非结核分枝杆菌的10例标本,涂片抗酸染色、罗氏培养法和LAMP的阳性检出率分为64.1%（111/173）、64.7%（112/173）、78.6%（136/173）。LAMP与抗酸染色、罗氏培养阳性检出率的差异有统计学意义（P＜0.01）,抗酸染色与罗氏培养比较差异无统计学意义（P＞0.05）。以罗氏培养为金标准,LAMP检测的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为88.5%（108/122）、82.3%（149/181）、77.1%（108/140）、91.4%（149/163）,LAMP检测与罗氏培养的符合率为84.8%（257/303）。结论结核分枝杆菌环介导等温扩增技术的灵敏度和特异度高,具有简单易行、快速准确的特点,在肺结核患者的早期诊断中将发挥重要作用。     

环介导等温扩增技术用于结核病诊断的价值评估

 目的 评估环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）在诊断结核病中的应用价值。方法 以疑似活动性结核患者为研究对象。前瞻性收集患者临床标本,分装后进行荧光涂片显微镜镜检、BACTEC MGIT 960液体培养、MTB GeneXpert （Xpert）和LAMP检测,分析比较这4种检测方法的灵敏度和特异度,同时进行一致性检验。结果 研究共入组315例患者,分为痰标本组和非痰标本组,两组分别有175例和80例纳入分析。对于痰标本的检测,以液体培养为诊断标准时,LAMP的灵敏度为78.9%,特异度为82.7%;在有抗结核活性药物暴露史亚组中,LAMP的灵敏度为92.3%,Xpert的灵敏度为88.5%;以临床诊断为诊断标准时,LAMP的灵敏度优于涂片（58.9% vs. 46.0%,P<0.05）,特异度为98.0%;亚组分析提示在有抗结核活性药物暴露史的患者标本中,LAMP的灵敏度高于其他检测方法。对于非痰标本的检测,同样显示出优于涂片的灵敏度。结论 LAMP在结核病的诊断中具有较好的灵敏度和特异度,与Xpert检测结果一致性较高,与培养一致性中等,优于结核菌涂片法。在有抗结核活性药物暴露史的患者中,LAMP有可靠的检出率。     

结核分枝杆菌的荧光定量PCR快速诊断

目的传统的结核分枝杆菌鉴定方法敏感性差、鉴定时间长,影响诊断和治疗,本研究为克服传统方法的缺点,建立特异、敏感、快速的结核分枝杆菌检测方法。方法应用荧光定量PCR技术检测疑似结核病病人痰液中的特异性DNA片段,以达到对结核病病人的快速诊断。结果 PCR结果显示7例疑似结核病病人的痰液标本中检出目的基因片段,证明7例病人均为结核病病人。结论所建立方法可用于结核分枝杆菌的快速诊断。     

环介导等温扩增法快速检测结核杆菌复合群内主要致病菌

目的 快速诊断和区分结核杆菌复合群内两种主要致病菌.方法 利用环介导等温扩增(LAMP)技术建立快速检测和区分结核杆菌复合群内主要致病菌的方法,利用该方法对相关的临床分离株样本进行特异性检测,并利用1∶ 10倍比稀释的已知菌株DNA模板分析其敏感性.反应结束后通过电泳或向反应管中加入DNA染料肉眼判定检测结果.结果 该方法可以成功检测到主要的结核致病菌:人型和牛型结核分枝杆菌,与包括卡介苗在内的其余相关菌株均未见非特异性交叉反应.检测的灵敏度可达100拷贝/微升,高于常规PCR方法.结论 该检测方法具有敏感、特异、低成本和快速的特点,可检测和区分人型和牛型结核分枝杆菌,并能排除卡介苗对诊断的干扰.     

结核病实验室诊断研究新进展

随着分析技术的不断进步以及对结核杆菌致病机制研究的深入,结核病的实验诊断在分子标志物、结核抗体、核酸检测、γ干扰素释放试验和诊断模型等方面取得了很大的进步,极大丰富了结核病实验室诊断手段。这些实验手段的应用,为结核病的诊断提供了较好的选择方案。尽管如此,这些新手段仍仅作为辅助手段,不能完全替代涂片与培养等传统手段。因此,仍然有必要继续开展相关研究,以推动结核病的实验室诊断水平。随着分析技术的不断进步和结核病分子机制的深入探讨,相信会有更好的标志物或诊断手段进入临床并得以应用。     

产肠毒素大肠杆菌快速检测方法的建立和评价

目的 利用环介导等温扩增（LAMP）技术,建立产肠毒素大肠杆菌（ETEC）的快速、便捷、敏感、特异的检测方法,并对该方法的特异性和敏感性进行评价,为实验动物检测和细菌性腹泻的诊断提供技术支持。方法 根据GenBank公布的产肠毒素大肠杆菌的LT毒素基因序列（S60731.1）设计外引物和内引物进行LAMP扩增,对LAMP特异性和敏感性与PCR方法做比较。结果 建立的LAMP方法检测限为100pg,灵敏度是PCR的10倍以上并具有较高的特异性,利用该方法对27份猴腹泻样品进行LAMP和PCR方法检测, LAMP（60min内）检测结果与PCR符合率为100%,而LAMP（90分钟内）检测敏感性高于PCR。结论 建立了一种用于检测肠毒性大肠杆菌（ETEC）的LAMP检测方法,该方法特异性强,灵敏度高,方便快捷,适合于ETEC临床快速检测。     

环介导等温扩增法直接检测阳性血培养瓶中大肠埃希菌

目的：应用环介导等温扩增技术（LAMP）建立一种快速敏感的直接检测阳性血培养瓶中大肠埃希菌的方法。方法根据美国国立卫生研究院基因序列数据库（GenBank）上大肠埃希菌的lacZ（登录号：M74750）基因序列,设计4条特异引物（2条内引物、2条外引物）,对lacZ基因进行扩增,对扩增反应进行优化。分别验证该方法的特异性及敏感性,并与传统培养法进行比较。结果在300份阳性血培养瓶中,采用LAMP法检测到68株大肠埃希菌,所设计引物对大肠埃希菌扩增的特异性及敏感性均较好,与传统培养法比较,灵敏度和特异性均达100％,但传统培养法的检出时间为3d,而LAMP法的检出时间只需1h。结论LAMP检测大肠埃希菌是快速、低成本、特异性强、灵敏度高的方法,适合临床开展。     

快速检测单核细胞增生李斯特菌LAMP方法的建立

目的:建立一种检测单核细胞增生李斯特菌核酸的快速、特异的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermalamplification,LAMP)方法。方法:针对单核细胞增生李斯特菌的李斯特菌溶血素hlyA基因设计4条LAMP引物,在水浴箱内65℃保温约60 min,完成对单核细胞增生李斯特菌的扩增,扩增产物经肉眼、SYBR Green I染色和电泳鉴定。利用LAMP和PCR方法同时检测1株单核细胞增生李斯特菌和10株非单核细胞增生李斯特菌(对照组)来验证LAMP方法的特异性。用LAMP和PCR方法分别检测一系列稀释后的单核细胞增生李斯特菌菌液,比较两者的敏感性。结果:经肉眼、加染料和电泳均能观察到1株单核细胞增生李斯特菌LAMP扩增阳性反应,10株非单核细胞增生李斯特菌没有出现LAMP扩增。LAMP敏感度比PCR高,LAMP检测单核细胞增生李斯特菌的检测下限为3 cfu/ml,PCR检测下限>300 cfu/ml。LAMP检测速度比PCR更快,只需要60 min。结论:建立了一种检测单核细胞增生李斯特菌的快速、特异的LAMP方法。     

聚合酶链反应对结核杆菌的诊断应用

利用聚合酶链反应（PCR）对135例多类临床标本（痰、胸水及尿等）进行了检测，临床疑诊为结核病中105例，其中18例结核杆菌涂片阳性，PCR检测均为阳性；87例结核杆菌涂片阴性的标本，57例PCR检测阳性，总阳性率为71.4%，对照的30例非结核病的标本则无阳性，本研究结果表明，PCR在敏感性，特异性方面均优于传统的结核病诊断方法，它简捷、易行、直观、尤其适用于结核病的早期、快速诊断。     

LAMP与RT-PCR法检测痰结核分枝杆菌的效果比较

目的 比较环介导等温扩增技术(LAMP)和实时荧光PCR技术(RT-PCR)检测结核分枝杆菌的效果.方法 可疑肺结核患者痰标本118份,分别采用痰涂片镜检、罗氏固体培养基培养、LAMP、RT-PCR方法进行结核分枝杆菌检查.结果 结核分枝杆菌阳性检出率痰涂片镜检38%、罗氏固体培养基培养41%、LAMP 45%、RT-PCR 55%,4种方法阳性检出率比较差异有统计学意义(P＜0.05);以常规罗氏固体培养法为标准,LAMP法的灵敏性和特异性分别为92.0%(46/50)和86.8%(59/68),与罗氏培养法比较差异无统计学意义(P＞0.05),一致性强(Kappa=0.777);PCR法的灵敏性和特异性分别为86.0%(43/50)和66.2%(45/68),与罗氏培养法比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论 RT-PCR检测法阳性率最高,但特异性低;LAMP法灵敏性和特异性较高,与传统培养法一致性好,操作简便易行、快速准确.     

建立环介导等温扩增方法检测腹泻患者中小肠结肠炎耶尔森菌

目的建立快速的检测方法对腹泻患者中的小肠结肠炎耶尔森菌进行快速检测。方法利用析因设计试验方法建立并优化检测小肠结肠炎耶尔森菌的环介导等温扩增技术（LAMP）,并与普通PCR法对临床腹泻标本进行检测比较。结果析因设计试验确定LAMP最佳反应体系：Mg2＋＋为2．0mmol,内引物FIP／BIP为1．6umol,dNTPs为1．6mmol,时间为60rain,反应温度为63℃。对12种细菌进行LAMP扩增,仅小肠结肠炎耶尔森菌获得阳性扩增结果,小肠结肠炎耶尔森菌基因组DNA和纯培养物的检测灵敏度分别为38．05fg和15CFU／ml。对腹泻样本进行直接检测,检测限为150CFU／g。539例腹泻患者粪便标本中,LAMP成功检出13例样本中含有小肠结肠炎耶尔森菌,普通PCR检出11例,灵敏度为100％,特异度为99．62％。结论本方法检测小肠结肠炎耶尔森菌特异性强、灵敏度高．且操作简单、快速、检测成本低．适合基层单位及现场廊用．     

环介导等温扩增技术检测铜绿假单胞菌的研究

用环介导等温扩增技术(LAMP)快速、灵敏地检测铜绿假单胞菌.利用铜绿假单胞菌gbca基因,特异性设计3对LAMP引物,在反应体系中添加羟基萘酚蓝(HNB)荧光染料,通过反应前后颜色的变化肉眼观察结果,并用琼脂糖凝胶电泳加以验证.对临床标本利用LAMP和PCR法平行检测,验证该法灵敏度、特异性.针对铜绿假单胞菌DNA特异性引物的LAMP法可以扩增,其他无扩增产物.本实验建立的LAMP法具备简便、快速、特异性强和灵敏度高的特点,适于实际应用.     

霍乱弧菌LAMP快速检测方法的建立及应用

目的 建立环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测霍乱弧菌.方法 针对霍乱弧菌外膜蛋白的ompW基因设计特异引物,优化反应条件,建立霍乱弧菌的LAMP检测方法.通过对47株细菌及模拟污染现场,检测该方法的灵敏度、特异度和实用性.结果 活菌计数方法表明建立的LAMP方法检测霍乱弧菌的灵敏度为1.6×10~2 cfu/ml.在人工污染霍乱弧菌的粪便及海水标本中检测的敏感度为1.6×10~3 cfu/ml,在牛奶标本中敏感度为1.6×10~4 cfu/ml.检测21株霍乱弧菌均为阳性,26株非霍乱菌则全部阴性,特异度为100%.结论 建立的LAMP方法检测霍乱弧菌灵敏度、特异度高,可用于霍乱现场监测和流行病学调查.

Abstract：

Objective To establish a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method for rapid diagnosis of Vibrio cholerae. Method Based on the ompW nucleic sequence of Vibrio cholerae, a pair of primers was designed for LAMP. The reaction conditions were optimized, and the specificity, sensitivity, and practicability of LAMP were tested using 47 baterial strains and simulated contaminated sites. Results The results of viable bacterium count showed that LAMP was capable of detecting Vibrio cholerae at a level as low as 1.6×10~2 cfu/ml. The minimal detectable concentration was 1.6×10~3 cfu/ml for simulated contaminated samples such as feces and seawater, and 1.6×10~4 cfu/ml for contaminated milk. All the 21 strains of Vibrio cholerae yielded positive results in LAMP, and the 26 strains of other bacteria all showed negative results, with a detection specificity of 100%. Conclusion The established LAMP method has high specificity and sensitivity for detecting Vibrio cholerae and is applicable in field monitoring and epidemiological study of Vibrio cholerae.     

分子信标荧光定量PCR快速检测结核分枝杆菌方法的初步研究

目的建立分子信标荧光定量PCR快速检测结核杆菌方法,为临床结核病的诊断提供特异性强、灵敏度高、可标准化、自动化的检测方法。方法根据GenBank数据库公布的结核分枝杆菌IS6110基因的保守序列,设计引物与分子信标探针,建立结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法;以10种细菌作对照分析该方法的特异性与灵敏度;应用已建立的方法检测结核分枝杆菌,评价其应用价值。结果所建立的分子信标荧光定量PCR检测10种细菌,只有结核分枝杆菌有荧光信号,与其他细菌无交叉反应,4拷贝/PCR反应体系的结核分枝杆菌都能有效检出。对100株结核分枝杆菌的检测结果为阳性,单一检测时间仅需2h。结论分子信标荧光定量PCR检测方法快速、灵敏度高、特异性强,可用于快速诊断结核病,为结核病的诊断与治疗提供新的检测手段。