癌胚抗原单链抗体-链亲和素融和蛋白的功能鉴定

目的: 用pET21原核表达系统表达癌胚抗原单链抗体-链亲和素融合蛋白.方法: 融合表达载体转化大肠杆菌菌株HMS174(DE3),用1mmol/L的IPTG诱导表达,表达产物行亲和印迹及免疫斑点分析.结果: SDS-PAGE表明,融合蛋白分子质量约57ku,亲和印迹及免疫斑点证实融合蛋白具有结合CEA与生物素的双特异性.结论: 原核表达系统可以表达具有双特异性的融合蛋白,该融合蛋白利用生物素标记的辣根过氧化物酶可直接检测抗原.     

CTLA-4/Ig融合蛋白在COS-7中的表达、纯化及鉴定

探讨ＰＣＴＬＡ－４／Ｉｇ融合蛋白表达载体在哺乳动物细胞中的表达及表达产物的鉴定,纯化为其功能研究和临床应用奠定基础。方法将ｐＣＴＬＡ－４／Ｉｇ表达质粒转染ＣＯＳ－７细胞,双抗体夹心ＥＬＩＳＡ检测细胞培养上清中融合蛋白表达：ＰｒｏｔｅｉｎＡ亲和层析纯化,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹、＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入等进行分子量,纯度、抗原特异性及生物知性鉴定。结果在ＰＣＴＬＡ－４／Ｉｇ质粒转染后的４８ｈ的     

Tropic 1808基因在大肠杆菌中的表达

目的;在大肠杆菌宿主系统中表达Ｔｒｏｐｉｃ１８０８基因编码的蛋白。方法：用ＰＣＲ方法从质粒中扩增出Ｔｒｏｐｉｃ１８０８ｃＤＮＡ开放阅读框架片段,并重组人表达载体ｐＥＴ－２１ａ中,转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,用ＩＰＴＧ诱导Ｔｒｏｐｉｃ１８０８融合蛋白的表达,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,表达蛋白条带转至ＰＶＤＦ膜进行氨基酸序列分析,结果：构建了ｐＥＴ－２１ａ－１８０８重组质粒,外源性Ｔｒｏｐｉｃ１８０８基     

弓形虫主要表面抗原基因克隆及在大肠杆菌中的表达

为在大肠杆菌中表达弓形虫主要表面抗原（ＳＡＧ１）,进一步研究其生物学功能。将ＳＡＧ１基因重组于ｐＧＥＭＥＸ－１融合型表达载体上,转化大肠杆菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）,得到含重组表达质粒ｐＧＥＭＥＸ－１／ＳＡＧ１的工程菌。结果表明ＩＰＴＧ诱导表达后,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测证实含有ＳＡＧ１蛋白。提示ｐＧＥＭＥＸ－１大肠杆菌系统可以表达具有免疫活性的ＳＡＧ１蛋白。     

人黑色素瘤单抗VH—TNF融合蛋白基因的构建和表达

在大肠杆菌中表达人黑色素瘤单抗ＶＨ－ＴＮＦ融合蛋白基因。方法；在人肿瘤坏死因子基因上游插入了抗黑色素瘤单抗Ｍｅｌ３的重链可变区基因，将此融合基因插入大肠杆菌表达系统ｐＧＥＸ－２Ｔ的ＧＳＴ基因下游，ＩＰＴＧ诱导表达，表达产物经凝血酶消化后，测定其对Ｌ９２９细胞的杀伤活性，并进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，用抗ＴＮＦ抗体进行蛋白印迹分析。     

血小板生成素突变体融合蛋白表达及纯化研究

目的：用大肠杆菌融合蛋白表达载体ｐＭＡＬ－ｃ２构建人血小板生成素突变体融合蛋白表达质粒ｐＭＡＬ－ＴＯＰＭ，方法：采用基因重组和表达，ＳＤＳ－聚丙烯酰胺胶电泳和蛋白纯化技术。结果：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明，ＩＰＴＧ诱导５ｈ后大肠杆菌ＪＭ１０９表达到最高水平，约占大肠杆菌菌体总体蛋白的３６．６％，除了大肠杆菌ＲＲ１不表达以外，大肠杆菌ＤＨ５αＨ１０１均有较高水平的表达，表达产物血小板生成素突变体融合蛋     

抑癌基因p16原核表达载体的构建及其表达的研究

为获取具有生物学活性的ｐ１６蛋白，采用定向克隆方法将双酶切克隆质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ－ｐ１６得到的ｐ１６ｃＤＮＡ片段连接到双酶切的原核表达载体ｐＢＶ２２０上，转化大肠杆菌ＴＧ１得到含重组表达质粒ｐＢＶ２２０－ｐ１６的工程菌，温度诱导表达后，经ＳＤＳ—ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测证实含有ｐ１６蛋白。结果表明，ｐ１６原核表达载体构建成功并表达出ｐ１６非融合蛋白。     

水蛭素基因在大肠杆菌中的克隆表达及分离纯化

目的：利用ＤＮＡ重组技术在大肠杆菌中融合表达水蛭素基因。方法：将水蛭素变体１的基因ＨＶ１克隆到ｐＥＺＺ３１８表达载体，转化Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９菌株，ＩＰＴＧ诱导表达，培养上清液经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶电泳检测，ｈＩｇＧ－ａｇａｒｏｓｅ亲和层析纯化。结果：表达的融合蛋白相对分子质量为２０ｋＤ，表达上清的抗凝血酶活力为４７ＡＴＵ（ＡｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎＵｎｉｔ）／ｍｌ。结论：在大肠杆菌中表达的水蛭素融合蛋白对凝血酶的凝血功能具有显著的抑制作用     

抑癌基因p16原核表达载体的构建及其表达的研究

为获取具有生物学活性的ｐ１６蛋白，采用定向克隆方法将双酶切克隆质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ－ｐ１６得到的ｐ１６ ｃＮＤＡ片段连接到双酶切的原核表达载体ｐＢＶ２２０上，转化大肠杆菌ＴＧ１得到含重组表达质粒ｐＢＶ２２０－ｐ１６的工程菌，温度诱导表达后，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测证实含有ｐ１６蛋白。     

水蛭素基因在大肠杆菌中的克隆表达及分离纯化

目的：利用ＤＮＡ重组技术在大肠杆菌中融合表达水蛭不基因。方法：将水蛭素变体１的基因ＨＶ１克隆到ｐＥＺＺ３１８表达载体，转化Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９菌株，ＩＰＴＧ诱导表达，增减上清液经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶电泳检测，ｈＩｇＧ－ａｇａｒｏｓｅ亲和层析纯化。结果：表达的融合蛋白相对分子质量为２０ｋＤ，表达上清的抗凝血酶和为４７ＡＴＵ／ｍｌ。结论：在大肠杆菌中表达的水蛭素融合蛋白对凝血酶的凝血功能具有显著的抑     

Tat融合蛋白表达载体TAT-OCT4的克隆化及蛋白表达研究

目的构建重组表达载体TAT-OCT4,在E.coli BL21中高效表达并纯化融合蛋白。为进一步通过蛋白转导方式诱导多能干细胞提供物质基础。方法经RT-PCR获得编码人OCT4的全基因序列,连接到原核表达载体TAT-V2上,得到重组表达载体TAT-OCT4,转化大肠埃希菌,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropylβ-D-thiogalactopyranoside,IPTG）诱导TAT-OCT4融合蛋白的表达。表达产物用SDS-PAGE鉴定,亲和层析柱纯化融合蛋白,并应用Western Blot检测蛋白的特异性,应用免疫荧光检测融合蛋白转导人皮肤成纤维（human skin fibroblasts,HSF）细胞的效果。结果成功构建了TAT-OCT4融合蛋白的原核表达载体,在诱导下获得了高效表达并纯化了融合蛋白,Western Blot鉴定正确。免疫荧光提示融合蛋白可快速转导入HSF细胞内。结论 TAT-OCT4融合蛋白可以安全,高效地转导入HSF细胞中。     

结核分枝杆菌PstS1-U1融合抗原的表达、纯化及其免疫活性测定

目的 为获得一种适于本地结核病临床诊断用抗原,将结核分枝杆菌38×103抗原--即磷酸盐传送蛋白1(phosphate transport system protein l,PstS1)和尿蛋白1(urine protein 1,U1)进行融合表达、纯化并测定其抗原活性.方法 用基因拼接法将结核分枝杆菌编码PstS1和U1蛋白的基因拼接在一起,克隆到原核表达载体pET28a中,通过IPTG诱导实现其高效表达,采用亲和层析纯化表达产物.用纯化的融合抗原免疫家兔获得抗血清,用该血清以及活动性肺结核患者血清对纯化产物的抗原活性进行测定.结果 成功构建了原核表达质粒,对表达产物进行亲和层析纯化,获得相对分子质量为57×103的目的蛋白.经Western blot检测融合抗原能够与活动性肺结核患者血清中的抗体发生结合.结论 本研究表达并纯化出PstS1-U1融合抗原,为进一步的应用奠定基础.     

人肿瘤蛋白D52重组融合蛋白的原核表达及特性鉴定

目的:表达人肿瘤蛋白D52(human tumor protein D52,hTPD52)的重组融合蛋白,并对该蛋白的生物学特性进行鉴定?方法:RT-PCR扩增乳腺癌MCF-7细胞中的hTPD52基因并克隆于pMD18-T载体中,测序鉴定序列正确后,分别插入pET-32a?pGEX-4T-2和pET-28a 3种表达载体中?重组质粒经酶切鉴定?序列分析正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),选择最佳表达载体和表达条件进行大量表达,表达产物经His柱亲和纯化和超滤浓缩后,应用Dot blot?Western blot鉴定纯化蛋白的特性?结果:正确扩增出了hTPD52基因,鉴定其为isoform 3型?用pET-32a-hTPD52重组表达载体能够大量表达可溶性的hTPD52-Trx融合蛋白,Dot blot显示表达的融合蛋白能和抗hTPD52的抗体结合,SDS-PAGE和Western blot显示表达的融合蛋白分子质量约为44 ku,去除Trx后仍能够与特异性抗体结合?结论:成功制备hTPD52重组融合蛋白,并证明原核表达的hTPD52保留了原有的抗原结合活性?     

狂犬病毒G蛋白基因的克隆?表达及生物学活性鉴定

目的:将狂犬病毒G蛋白(rabies virus G protein, RVG)基因片段克隆到原核表达载体中,表达并纯化GST融合G蛋白,为研制狂犬病新型ELISA抗体检测试剂盒提供诊断抗原?方法:根据GenBank发表的狂犬病病毒CVS-11株G蛋白结构基因序列设计引物,利用RT-PCR扩增出RVG基因片段,并定向克隆于pGEX-6P-1载体中,构建原核表达载体pGEX-RVG?阳性重组质粒转化宿主菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,通过对表达条件的优化,确定可溶性表达的最佳条件?利用谷胱甘肽转移酶(GST)亲和层析法获得纯化的目的蛋白,Western blot对表达的蛋白进行鉴定?结果:构建了原核表达载体pGEX-RVG,经IPTG诱导后可表达分子量约36 000融合蛋白,经纯化获得高纯度的目的蛋白?Western blot检测表明重组的融合蛋白有较好的生物学活性?结论:成功表达并纯化狂犬病毒G蛋白,为进一步研制狂犬病新型ELISA抗体检测试剂盒提供抗原?     

BLCAP蛋白多克隆抗体制备及其免疫学特性鉴定

目的:利用大肠杆菌BL21(DE3)表达BLCAP融合蛋白并制备和鉴定其多克隆抗体。方法:构建原核表达重组质粒pET32a(+)-BLCAP并转化到宿主菌BL21中,诱导表达带有His标签的目的融合蛋白,经Ni2+亲和层析纯化回收后免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体的效价,Western blot检测抗体的特异性和亲和性。结果:成功获得分子质量约为28 kU纯化的融合蛋白,免疫日本大耳白兔后得到抗BLCAP的多克隆抗体。ELISA测定显示抗体效价可达到1∶10 000。通过Western blot检测证明该抗体有较好的针对BLCAP蛋白的专一性。结论:重组质粒表达的BLCAP融合蛋白具有良好的抗原性。制备的特异性和效价良好的抗BLCAP的多克隆抗体,能够满足针对BLCAP免疫印迹和细胞免疫组化检测等实验要求,为今后深入研究BLCAP蛋白性质与功能提供了有用的实验工具。     

幽门螺杆菌CagA基因的原核表达及抗原性测定

目的：合成胃癌相关幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)的 CagA基因片段,建立原核表达系统,鉴定重组表达产物的抗原性。方法：选取前期研究确定的与胃癌相关的H.pylori CagA基因片段,优化设计并合成CagA基因,将合成的CagA基因从pUC57-CagA质粒中切出,用表达载体pET32a携带该基因转化宿主菌BL21(DE3),通过氨苄青霉素抗性筛选和菌落PCR挑选出阳性克隆pET32a-CagA;以IPTG诱导含pET32a-CagA的宿主菌表达融合蛋白,经SDS-PAGE凝胶电泳分析CagA蛋白表达情况,用Western印迹鉴定融合蛋白的抗原性。结果：设计并人工合成了CagA基因片段,序列测定结果显示,合成的CagA基因序列与设计的序列（AF289435）基本一致;成功构建pET32a-CagA原核表达质粒,对应蛋白序列与AAG09884同源性为100%;含pET32a-CagA的BL21(DE3)宿主菌经IPTG诱导后能表达CagA融合蛋白,经SDS-PAGE凝胶电泳分析结果表明,融合蛋白相对分子质量大小与预期一致(45 kD);Western印迹检测结果显示该融合蛋白可与抗H.pylori全菌抗体结合反应。结论：本实验构建的原核表达系统表达的CagA融合蛋白具有良好的抗原性,为临床胃癌相关H.pylori菌株的筛选和针对性治疗奠定了基础。     

重组α2-HS糖蛋白的原核表达、纯化及免疫学活性分析

目的:原核表达并纯化具有生物学活性的重组α2-HS糖蛋白(AHSG)。方法:提取人肝癌细胞株HepG2细胞总RNA,逆转录得cDNA,PCR扩增出目的基因,与pMD18-T载体连接后,转化至大肠杆菌DH5α中,大量扩增后提取克隆质粒,连接至原核表达载体pEP-30a(+)中,转化BL21(DE3),经IPTG诱导蛋白表达,通过镍离子亲和层析的方法纯化重组蛋白,采用SDS-PAGE电泳、免疫印迹杂交法对纯化产物进行分析鉴定。结果:成功构建了AHSG原核表达系统BL21(pET30a-AHSG),最佳诱导条件为80μmol/LIPTG诱导3h;诱导表达的蛋白相对分子质量约54600,主要以不溶性的包涵体形式存在,纯化后的重组蛋白质量浓度最高达2.3g/L,经免疫印迹杂交鉴定有抗原性。结论:成功构建了AHSG原核表达系统,该系统可高效表达重组AHSG蛋白,该蛋白具有良好的抗原性。     

S100A16基因的原核表达和多克隆抗体制备

目的:构建S100A16原核表达载体,制备S100A16蛋白多克隆抗体并初步鉴定?方法:RT-PCR扩增得到小鼠肝脏组织的S100A16基因,将此片段克隆到带有His标签的原核表达载体pET-28a多克隆位点,并转化大肠杆菌BL21(DE3)?IPTG诱导融合蛋白表达,以亲和层析的方法纯化His-S100A16融合蛋白?纯化蛋白经SDS-PAGE电泳鉴定后,免疫新西兰白兔制备抗血清?分别采用ELISA和Western blot方法检测抗体效价和特异性?结果:经双酶切和核酸序列分析证实成功构建pET-28a-S100A16原核表达质粒?考马斯亮兰染色结果证实IPTG可有效诱导融合蛋白表达?用纯化融合蛋白免疫新西兰白兔得到的S100A16抗体血清,经ELISA和Western blot检测结果显示该抗体效价高,特异性好?结论:构建带有His标签的S100A16原核表达载体,并获得高纯度His-S100A16融合蛋白及其多克隆抗体,为进一步研究S100A16生物学功能奠定基础?     

血管生成素与绿色荧光蛋白融合蛋白的表达及纯化

目的:表达并纯化血管生成素(ANG)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白,以进一步探讨血管生成素的生物学功能。方法:PCR扩增人ANG基因,将其与EGFP基因融合后克隆到高表达载体pMFHT,构建了原核表达质粒pHIS鄄ANG鄄EGFP。该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并用金属螯合亲和层析纯化目的蛋白。激光共聚焦显微镜和Westernblot鉴定融合蛋白的表达情况。结果:重组蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,并从破菌上清中一步纯化目的蛋白,纯度可达95%以上。Westernblot分析表明表达产物具有良好的抗原性和特异性。诱导表达的菌体在激光共聚焦显微镜下可发射明亮的绿色荧光。结论:成功的表达并纯化了ANG鄄EGFP融合蛋白,利用EGFP的荧光示踪作用,该融合蛋白可用于血管生成素核转位和胞内共定位蛋白质研究。     

幽门螺杆菌融合蛋白HspA-UreB在pMAL-C2x中的表达与免疫学活性研究

目的:在pMAL-C2x中表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)融合蛋白HspA-UreB,探索其免疫学活性,为Hp基因工程疫苗的研究奠定基础。方法:从重组质粒pNHA27和pNUB27中纯化回收hspA和ureB基因片段,并以hspA-ureB的顺序连接后插入原核表达载体pMAL-C2x中,表达麦芽糖结合蛋白(MBP)与HspA-UreB的融合蛋白。采用亲和层析法纯化融合蛋白MBP-HspA-UreB,并辅以弗氏佐剂皮下免疫小鼠,蛋白印迹法对免疫小鼠血清进行检测。结果:特异PCR法和酶切鉴定证实融合基因hspA-ureB克隆入表达载体,并以融合蛋白形式MBP-HspA-UreB高效表达,相对分子量为119 000,约占细胞总蛋白的31%。通过大肠杆菌抗原吸收法纯化免疫小鼠血清后,与纯化的融合蛋白进行杂交,结果显示在119 000处出现特异杂交带。结论:融合蛋白HspA-UreB具有良好的免疫原性和免疫反应性。