Lipofectamine 2000和jetPRIME~（TM）对A549细胞转染效率及毒性的比较研究

目的评价及比较两种转染试剂Lipofectamine 2000和jetPRIMETM对A549细胞的转染效率及毒性。方法分别利用Lipofectamine 2000和jetPRIMETM将pEGFP-N1质粒转染A549细胞,转染24h后荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）的表达,计算转染效率,四甲基偶氮唑盐比色法[3-（4.5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT]检测两种转染试剂对A549细胞的毒性。结果质粒与Lipofectamine 2000比例（μg/μl）在1∶2至1∶3.5之间变化时,Lipofectamine 2000转染效率变化不明显,细胞毒性随着Li-pofectamine 2000用量增多而增大,质粒与Lipofectamine 2000比例（μg/μl）为1∶2.5时转染率最高,达（50.6±4.9）%,细胞存活率为（89.2±9.1）%;质粒与jetPRIMETM比例（μg/μl）在1∶1至1∶4之间变化时,jetPRIMETM转染效率变化明显,而细胞毒性变化不明显,质粒与jetPRIMETM比例（μg/μl）为1∶2时转染率最高,为（30.6±2.8）%,细胞存活率为（100.6±4.8）%;两者最大转染率及相应的细胞存活率均有统计学差异（P〈0.01,P〈0.05）。结论 Lipofectamine 2000转染A549细胞的效率高于jetPRIMETM,细胞毒性亦强于jetPRIMETM。     

三种转染试剂介导pGPU6/GFP/Neo真核表达载体转染鸡胚成纤维细胞的比较研究

目的：采用不同转染试剂介导pGPU6/GFP/Neo质粒转染鸡胚成纤维细胞UMNSAH/DF-1,以获得最优化的方法。 方法：分别采用不同剂量（1.25 μl、2.0 μl、2.5 μl）的Lipofec-tamin2000、Gbfectene-Elite及HilyMax转染试剂介导1 μg质粒进行转染,观察其转染效率,测定其转染细胞存活率。 结果：HilyMax组的转染效率为（86.85%±2.32%）,较Lipofectamin2000组（48.33%±3.24%）、Gbfectene-Elite组（37.35%±5.41%）高（F=18.882,P<0.05）;其中,HilyMax 2.5 μl组的转染效率最高为（90.53%±1.15%）。Lipofectamin2000组的细胞存活率（65.76%±5.78%）明显低于HilyMax组（89.54%±0.86%）、Gbfectene-Elite组（82.45%±3.56%）（F＝90.676,P＜0.05）。 结论：HilyMax对于鸡胚成纤维细胞具有最好的转染效率和最低的细胞毒性,推荐使用2.5 μl HilyMax：1 μg质粒进行鸡胚成纤维细胞的转染。     

FuGene HD试剂转染GFP入A549细胞关键条件的优化

目的 优化FuGene HD试剂转染外源基因入A549细胞的实验条件.方法 培养A549细胞,改变FuGene HD试剂/质粒DNA比例以及转染GFP基因的时间,荧光显微镜观察和计数绿色荧光蛋白表达细胞以非表达细胞,并计算转染效率和细胞活力.结果 FuGene HD试剂(μL)/质粒DNA(μg)比例为2.5,转染时间12 h,转染效率为(84.6±5.2)%;而细胞活力为(94.8±4.7)%.结论 FuGene HD试剂/质粒DNA比例为2.5,而转染时间为12 h,可在A549细胞获得较高转染效率和细胞活力.     

新型纳米载体SuperfectTM最适转染条件的研究

目的:对新型纳米转染载体SuperfectTM的转染效率和细胞毒性进行初步研究,以探讨其最适的转染条件。方法:以50%融汇率的小鼠黑色素瘤细胞为靶细胞,在不同条件下将,报告基因质粒pEGFP-C1与载体Super-fectTM混合为复合物进行转染。各实验组:不同的质粒剂量(0.25μg,0.50μg)、不同的N/P(N:载体分子表面胺基的数量,P:DNA中磷酸基团的数量)比(2∶1,5∶1,10∶1)及复合物与细胞的孵育时间(3 h,6 h)。各对照组:裸质粒转染组、载体转染组,非转染组为对照。转染72 h后,流式细胞仪检测转染效率,MTT法检测细胞毒性。结果:在不同条件下,SuperfectTM的转染效率有显著性差异(P<0.05),其细胞毒性与载体剂量和孵育时间相关。当质粒剂量为0.5μg,N/P比为5∶1,复合物与细胞孵育3 h时,SuperfectTM不仅具有较高的转染效率,而且表现出较低的细胞毒性。结论:SuperfectTM是一种高效低毒的转染载体,其最适转染条件主要与N/P比及复合物与细胞的孵育时间相关。SuperfectTM在基因治疗领域将具有良好的应用前景。     

Smad2特异性siRNA转染肝星状细胞的效率检测

[目的]提高siRNA表达载体在肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)中的转染效率。[方法]pEGFP-C1-CR4转染原代HSCs、HSC-T6细胞株,实验根据质粒DNA和阳离子脂质体的不同比例分为4组:1μg/0μL、1μg/1μL、1μg/2μL、1μg/4μL,1μg/0μL为对照组,其余3组为实验组。转染48 h后,使用荧光显微镜观察转染情况,同时流式细胞仪计算转染效率。[结果]质粒DNA和阳离子脂质体的比例为1μg/2μL和1μg/4μL时,原代HSCs转染效率为(56.55±3.12)%和(58.62±2.03)%(P>0.05),HSC-T6细胞株转染效率为(24.52±3.55)%和(25.49±2.33)%(P>0.05)。同样比例条件下,原代HSCs的转染效率显著高于HSC-T6细胞株的转染效率(P<0.05)。在实验组质粒、脂质体比例为1μg/2μL和1μg/4μL时,同种细胞的转染效率均无显著差别(P>0.05)。[结论]采用质粒DNA和阳离子脂质体的比例为1μg/2μL、1μg/4μL的条件,均能够在HSCs和HSC-T6中获得最佳转染效率,但前者更为经济。     

pEGFP-N1脂质体转染方法的优化及其应用

目的: 应用脂质体介导的转染方法将pEGFP-N1转染入Fisher大鼠甲状腺滤泡上皮细胞中,并获得较佳的优化方案,阐明该优化条件在转染其他目的基因时的适用性。方法: 分别选取不同配比的质粒和脂质体,将pEGFP-N1转入Fisher大鼠甲状腺滤泡上皮细胞。转染后36h,倒置荧光显微镜和流式细胞术检测细胞中增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达情况和转染效率;台盼蓝染色法检测细胞存活率,以此获得优化的转染条件。同时将pEGFP-Aquaporin2、pEGFP-Aquaporin4和pEGFP-Aquaporin5分别以上述条件转染,并获取相应优化的转染条件。结果: 在质粒质量固定的条件下,随着脂质体质量的增加,其转染效率和细胞存活率升高;但是当质粒:脂质体>1:4时,转染效率和细胞存活率下降。在质粒和脂质体比例固定而质量增加时,其转染效率和细胞存活率下降;当质粒:脂质体>3.2μg:12.8μL时,转染效率降低。应用脂质体介导的方法转染pEGFP-N1和转染pEGFP-Aquaporin2、pEGFP-Aquaporin4和pEGFP-Aquaporin5时,在质粒与脂质体的配比为1:4(3.2μg:12.8μL)时,转染效率达最高。结论: 在应用脂质体介导的目的基因转染时,pEGFP-N1优化的转染条件具有较为广泛的适用性,可用作后续目的基因高效转染优化条件。     

新型阳离子核酸载体的细胞转染效率研究

目的新型阳离子核酸载体LW13-2进行研究,分析其细胞毒性和基因转染效率,探讨其作为核酸载体的可能性。方法使用MTT比色法分析LW13-2与DNA在不同比例下的细胞毒性。选用绿色荧光蛋白表达质粒EGFP为报告基因,以人胚胎肾HEK293细胞为工具细胞,在荧光显微镜下观察计数,计算转染效率。结果当LW13-2与DNA的质量比为(1~3)∶1时,细胞毒性最低。LW13-2与DNA的质量比为3∶1时,转染作用4 h,在无血清培养基中继续培养48 h,得到LW13-2的最大转染效率为87.6%。结论通过与市售成熟转染试剂Lipofectamine 2000的对比,新型阳离子核酸载体在大幅提高基因转染效率的同时并没有增加其细胞毒性,有望成为核酸转移的有效载体,为相关研究及基因的靶向治疗研究提供基础。     

黑素瘤分化相关基因-7/白细胞介素-24抑制肺癌细胞增殖

目的：探讨黑素瘤分化相关基因-7／白细胞介素-24（mda-7／IL-24）对非小细胞肺癌细胞系H460增殖的影响。方法：将mda-7／IL-24插入真核表达载体pcDNA3中，构建重组表达载体pcDNA3-mda-7／IL-24。按照DNA和脂质体（Lipofectamine）的不同比例，将重组表达载体瞬时转染H460细胞，用RT—PCR检测mda-7／IL-24在不同转染条件下的表达，用MTT法检测转染重组表达载体后对H460细胞增殖的影响。结果：成功构建了mda-7／IL-24的重组表达载体，用SP6引物和mda-7／IL-24上游引物进行RT—PCR分析，在DNA和Lipofectamine的比例为1μg：2μl—1μg：4μl时有目的基因表达。按照1μg：2μl的比例瞬时转染重组表达质粒72h后进行MTT分析，结果表明，与未转染细胞和转染空质粒细胞相比，重组质粒pcDNA3-mda-7／IL-24对肺癌细胞H460的增殖有明显抑制作用，抑制率为18．4％。结论：mda-7／IL-24对非小细胞肺癌细胞系H460增殖具有明显的抑制作用。     

大鼠肝脏细胞及中国仓鼠肾脏成纤维细胞转染条件的优化

目的:应用携带有报告基因β-Gal的质粒对于使用Lipofectamine 2000转染大鼠肝脏细胞及中国仓鼠肾脏成纤维细胞条件进行优化.方法:在96孔板上按不同比例混合Lipofectamine 2000和质粒DNA后转染大鼠肝脏细胞及中国仓鼠肾脏成纤维细胞,成功转染的细胞因可表达β-Gal可分解底物X-gal在染液的存在下可使细胞呈蓝色,故计算蓝色细胞的比例即可了解转染的效率.应用方差分析的方法进行统计分析.结果:对于BHK细胞,当DNA与Lipofectamine 2000的比例为0.27∶0.8(μg∶μL)时转染效率最高,为(43.2±9.3)%;对于BRL细胞,DNA与Lipofectamine 2000的比例为0.10∶0.3(μg∶μL)时转染效率最高,可达(5.7±1.3)%.结论:Lipofectamine 2000可有效转染哺乳动物细胞,不同细胞有不同的最佳转染条件.     

PRMT1-shRNA质粒转染大鼠主动脉内皮细胞条件的优化

目的 优化在聚乙烯亚胺转染剂jetPEITM-RGD介导下将蛋白精氨酸甲基转移酶1(PRMT1)短发夹RNA(shRNA)质粒转染入原代培养大鼠主动脉内皮细胞时的转染条件. 方法 贴块法原代培养大鼠主动脉内皮细胞,经免疫细胞化学法(SP法)鉴定,取3-4代细胞,按不同jetPEITM-RGD/pPRMT1-shRNA比例进行转染,24 h后测定各组转染效率及细胞存活率.结果 使用6孔细胞培养板时,每孔加入3.0μg的pPRMT1-shRNA并以N/P=5加入jetPEITM-RGD转染效率最高为53.54%. 结论 本研究结果为高效地进行细胞转染及进一步在体基因干扰PRMT1的研究奠定了基础.     

多价阳离子脂质体介导重组基因pCKM-mPTH治疗甲状旁腺功能低下症的实验研究

目的探讨多价阳离子脂质体介导的pCKM-mPTH质粒治疗甲状旁腺功能低下症(HPT)的最佳方案。方法用DNaseⅠ敏感性试验测定脂质体对质粒的保护作用,用不同比例的脂质复合物及裸质粒进行体内外转染,收集细胞培养液和血清,采用放射免疫法测定其甲状旁腺激素(PTH)含量。结果脂质复合物比例为2∶1时,即对DNA有明显的保护作用;在体外转染实验中,复合物比例在3∶1时PTH表达量最高,为每24小时(16.4±4.8)pg/10 000细胞,而在此比例下pCKM-mPTH质粒达20μg/100μl时,模型体内PTH的血清浓度最高,为35.9 pg/m l±2.2 pg/m l。结论与裸质粒相比,多价阳离子脂质体更适宜于作为HPT基因治疗的非病毒载体,而其介导重组质粒pCKM-mPTH直接转染肌肉的良好效能取决于脂质复合物的构成比例和剂量。     

影响人脐静脉内皮细胞脂质体转染pReceiver-M29-PRKCB1效率因素的探讨

目的:探讨影响人脐静脉内皮细胞转染效率的因素,为优化外源基因在其中的表达提供实验依据.方法:选用适于转染人脐静脉内皮细胞的脂质体lipofectin,采用不同的转染条件:脂质体和DNA的用量;铺板密度;细胞与DNA-脂质体复合物孵育时间转染内皮细胞.荧光显微镜、流式细胞仪测定不同转染参数下的转染效率.结果:(1)24孔板中,铺板密度大于2×104个/孔和孵育时间超过4h,反而使转染效率下降.(2)随质粒质量增加转染效率逐渐上升,达峰后质粒质量的增加并不能显著增高转染效率.(3)特染效率达峰前,随着脂质体用量的增加,转染效率增高;达峰后,脂质体用量的增加,转染效率反降低.当DNA(μg)和脂质体(μl]的用量比为1∶6～1∶8时,获得最高的转染效率:18.62%.结论:采用优化后的转染参数在人脐静脉内皮细胞转染中可获得较优的转染效率.     

不同日龄大鼠颈上交感神经节神经元电转染方法

目的 建立一种高效电转染不同日龄大鼠颈上交感神经节(superior cervical sympathetic ganglion,SCG)神经元细胞的方法.提高转染后细胞的成活率、转染效率和干扰效率.方法 用传统的及经改良的神经元培养液分别培养电转染后的7日龄、14日龄和40日龄SD大鼠SCG细胞,24 h后用台盼蓝染色方法观察并计算细胞成活率;通过改变质粒DNA和siRNA与转染液比例,优化转染条件,于转染24h后在共聚焦显微镜下观察并计算转染效率或干扰效率.结果 改良培养液可使14日龄以上SD大鼠SCG细胞转染后成活率达到75％以上,明显高于传统培养液转染后的成活率(P＜0.01),且结果稳定,细胞状态良好,能够满足后续实验研究的要求;优化转染条件后,DNA 的转染率及siRNA的干扰率显著提高,当DNA与转染液比例为1∶100(μg∶μL)时,细胞转染率最高;当siRNA与转染液比例为1∶50(μg∶ μL)时干扰率最高.结论 通过改良神经元培养液及优化转染条件,成功提高了电转染后细胞的成活率、转染效率和干扰效率,利用电转染方法可成功转染不同日龄SD大鼠SCG神经元.     

HBV-前C区反义基因真核表达重组质粒电穿孔转染2.2.15细胞转化方案的条件优化

目的 :探索最佳HBV 前C区反义基因真核表达重组质粒电穿孔转染 2 .2 .1 5细胞的转化条件。方法 :构建含HBV 前C区反义基因真核表达重组质粒后 ,通过控制质粒DNA浓度、电压、电容、时间、温度等实验条件进行电转染观察转染细胞生长情况。结果 :在电压 2 1 0V、电容 975uF、温度 4℃、DNA终浓度在 0 .1 2 5μg/μl至0 .75μg/μl之间时 ,细胞转染生长情况最佳。结论 :上述优化实验条件 ,可明显提高HBV 前C区反义基因真核表达重组质粒电穿孔 2 .2 .1 5转染的成功率     

超声联合微泡介导缺氧诱导因子-1α基因转染293T细胞的实验研究

目的:探讨超声联合微泡造影剂介导缺氧诱导因子(HIF)-1α基因转染人胚肾293T细胞的转染效率。方法:将6孔板中的293T细胞悬液分为3组,A组:质粒+超声辐照组,加入质粒,终浓度为15μg/孔;B组:载基因微泡+超声辐照组,加入载基因质粒微泡混合液,质粒的终浓度为15μg/孔,微泡的终浓度为200μl/孔;C组:对照组,每孔中仅加入单纯质粒DNA,终浓度15μg/孔。A组和B组均接受超声辐照,超声照射条件为连续波,声强1.5 W/cm2,辐照时间30s。超声辐照转染48h后,用荧光显微镜和流式细胞仪分别定性定量观察各组细胞基因的转染效率。结果:转染48h后,荧光显微镜观察到转染成功的细胞内发出绿色荧光,流式细胞仪检测A组、B组、C组的基因转染效率分别为(5.6±0.5)%、(30.5±1.0)%、(0.1±0.1)%。结论:超声辐照联合微泡能够介导治疗性基因的体外细胞转染,为冠心病心肌缺血的HIF-1α基因治疗奠定基础。     

体外培养小脑浦肯野神经元转染及条件的优化

目的 探讨用化学转染试剂体外转染小脑浦肯野神经元的最佳转染条件.方法 体外分离培养E18 d的昆明小白鼠的小脑浦肯野神经元,用lipofectamineTM2000、磷酸钙沉淀试剂、Effectene转染试剂包被质粒分别转染体外培养7 d的浦肯野神经元.另外,用lipofectamineTM2000包被质粒,分别转染7、14、21 d以及28 d浦肯野神经元.每组分为5个样本.48 h后观察绿色荧光蛋白的表达情况,并用台盼兰检测细胞的存活率.结果 (1)3种转染试剂的最高转染率分别为lipofectamineTM2000(19.63±5.76)%、磷酸钙沉淀法(1.84±1.85)%、Effectene(1.48±1.38)%.lipofectamineTM2000与其他两种方法的转染率均有显著差异.(2)2 μl的lipofectamineTM2000的转染效率为(15.11±4.01)%,细胞存活率与对照组没有明显差异,为(92.98±2.10)%.(3)培养早期(7 d、14 d)的浦肯野神经元损伤小,与对照组没有明显差异.结论 该实验首次证实了lipofectamineTM2000能有效地转染体外培养的小脑浦肯野神经元.不同的发育阶段对转染效率也有较大的影响,lipofectamineTM2000比较适合早期的浦肯野神经元转染.     

人直肠癌细胞系HR-8348 DNA转化活性的研究及其初步鉴定

从国内建立的人直肠癌细胞系HR-8348提取基因组DNA,与pSV2neo质粒DNA共同转染大鼠成纤维细胞系rat-1细胞.HR-8348细胞DNA 80μg,pSV2neo质粒DNA4μg;采用磷酸钙沉淀法共转染10~6rat-1细胞,用含G418(400μg/ml)的DMEM培养液筛选.转染1周后,未加pSV2neo质粒DNA的对照组rat-1细胞全部死亡.2周后,从G418筛选后转染细胞长出的集落中,挑出具典型形态转化的细胞克隆4个.HR-8348DNA转化灶形成率为0.05个/(1μgDNA·10~6细胞).将其中C1-6转化灶扩     

Pre-let-7d转染卵巢癌细胞转染率的研究

目的研究Pre-let-7 d质粒在不同时间,以不同浓度转染人卵巢癌细胞的转染率。方法将构建的Pre-let-7 d质粒HmiR和连接随机序列的质粒CmiR转染人卵巢癌SKOV3、HO8910细胞,用荧光显微镜与流式细胞仪计数两种方法计算转染率。结果转染HmiR、CmiR后,荧光显微镜观察和流式细胞术计数结果显示SKOV3、HO8910细胞的转染率,以3μg质粒/孔转染SKOV3、HO8910人卵巢癌细胞比2μg、4μg质粒/孔的转染率高,24 h、48 h、72 h三个不同时间点用相同质量的质粒转染,转染率无显著差异。结论转染HmiR、CmiR后,荧光显微镜观察和流式细胞术计数结果显示以3μg质粒/孔转染SK-OV3 HO8910人卵巢癌细胞的转染率均在60%左右,符合实验要求。     

提高Lipofectamine2000对PC12细胞转染效率的研究

目的探讨提高PC12细胞转染效率的方法。方法细胞培养板用10μg/mLⅠ型牛胶原蛋白包被,通过在转染过程中加入9μmol/L趋溶酶体试剂氯喹及8μmol/L聚胺类试剂亚精胺,同时调整Lipofectamine2000与DNA用量的比例和转染时间。考察DNA与Lipofectamine2000的比例对PC12细胞转染效率的影响,转染时间对PC12细胞转染效率的影响,氯喹、亚精胺用量对PC12细胞转染效率的影响,氯喹、亚精胺对PC12细胞活性的影响,氯喹、亚精胺对PC12细胞神经轴突生长的影响及与4种常用脂质体转染试剂对PC12细胞转染效率的比较。结果①对PC12细胞转染,DNA∶Lipofectamine2000用量比例应控制在1∶4。②当转染时间分别为1、2、4、8、24 h时,PC12细胞转染率分别为35.5%、37.9%、40.5%、40.3%及38.6%,4 h达到最大转染效率。③氯喹、亚精胺加入浓度的增加,PC12细胞转染效率随之增加,当氯喹、亚精胺加入终浓度分别增至9μmol/L和8μmol/L时,PC12细胞的转染效率最高,转染效率为40.5%。④加入终浓度为9μmol/L氯喹与8μmol/L亚精胺前、后MTT试验吸光度(590 nm)分别为(0.466±0.042)与(0.451±0.038),差异无统计学意义(P>0.05),对PC12细胞的活性无影响。⑤加入氯喹、亚精胺前、后,PC12细胞的神经轴突生长数量与长度差异无统计学意义(P>0.05)。⑥FuGENE、PolyJet、Lipofectamine LTX and Plus、Lipofectamine2000 4种脂质体转染试剂对PC12细胞转染效率分别为10.5%、8.6%、11.8%及15.3%,本法PC12细胞转染率为40.5%,差异有高度统计学意义(P<0.01)。结论加入氯喹及亚精胺,实现阳离子脂质体Lipofectamine2000对PC12细胞的高效转染,为PC12细胞进行神经细胞基因功能及开发遗传病治疗方案等生物学研究提供了一种安全、廉价的新方法。     

shRNA抑制C-erbB-2基因表达对小鼠Lewis细胞凋亡的影响

目的:探讨shRNA抑制C-erbB-2基因表达对小鼠肺腺癌Lewis细胞凋亡的影响.方法:构建4个pGPU6/RFP/Neo-erbB-2质粒和pGPU6/RFP/Neo-shNC.应用Lipofectamine 2000转染pGPU6/RFP/Neo-shNC至小鼠肺腺癌Lewis细胞,应用荧光显微镜观察荧光,确定最佳转染效率.应用RT-PCR检测C-erbB-2 mRNA的水平,应用Western blotting检测该蛋白的表达,筛选干扰效果最好的质粒.应用流式细胞术检测空白组、pGPU6/RFP/Neo-shNC组和最佳干扰组细胞的凋亡率.结果:pGPU6/RFP/Neo-shNC(μg)∶Lipofectamine (μl)为0.4∶1时,转染效果最好.4个pGPU6/RFP/Neo-erbB-2质粒均能降低C-erbB-2 mRNA水平和蛋白的表达,其中干扰效果最好的是pGPU6/RFP/Neo-erbB-2-mus-3669,用于后续实验.pGPU6/RFP/Neo-erbB-2-mus-3669质粒组的凋亡率高于空白组和pGPU6/RFP/Neo-shNC组(P＜0.05).结论:pGPU6/RFP/Neo-erbB-2-mus-3669质粒能抑制小鼠Lewis细胞C-erbB-2基因的表达,诱导细胞凋亡.