新法制备含VEGF启动子驱动的CD／TK融合基因重组腺病毒

目的 应用简化的细菌内同源重组法高效制备含血管内皮细胞生长因子(VEGF)启动子驱动的CD／TK融合基因重组腺病毒。方法 先以氯化钙法替代电穿孔法将腺病毒基因组质粒pAdEasy-1导入BJ5183细菌，制备BJ5183pAdEasy-1细菌；再以后者作感受态细菌，与线性化的转移质粒pAdtrack-VEGFP-CDglyTK进行同源重组，获得重组腺病毒质粒pAdEasy-VEGFP-CDglyTK，转染293细胞，制备含VEGF启动子驱动的CD／TK融合基因重组腺病毒。结果 构建重组腺病毒质粒的成功率为60％(6／10)。转染293细胞后7～12d可收获病毒。结论 简化的细菌内同源重组法简便易行，重组效率较高，易于推广应用。     

重组腺病毒载体含人抑瘤素的扩增及纯化

目的：构建含人抑瘤素(HOSM)基因的重组腺病毒载体，观察其对肿瘤细胞生长的影响。方法：用脂质体介导质粒DNA同源重组方法构建HOSM基因的重组缺陷型腺病毒载体，用聚合酶链反应(PCR)法鉴定所构建的ad-HOSM载体，在人胚肾细胞(293细胞)中扩增病毒。CsCl梯度超速离心纯化病毒，噬斑法测定病毒的滴度。结果：获得了高纯度、高滴度的重组腺病毒载体。结论：细胞内质粒DNA同源重组法能有效构建重组腺病毒载体，293细胞能有效扩增病毒。CsCl梯度超速离心法能制备高纯度的病毒，为进一步研究重组腺病毒介导HOSM基因对肿瘤细胞的生物学活性的影响打下基础。     

新法制备含VEGF启动子驱动的CD/TK融合基因重组腺病毒

目的 应用简化的细菌内同源重组法高效制备含血管内皮细胞生长因子(VEGF)启动子驱动的CD/TK融合基因重组腺病毒。方法 先以氯化钙法替代电穿孔法将腺病毒基因组质粒pAdEasy-1导入BJ5183细菌,制备BJ5183pAdEasy-1细菌;再以后者作感受态细菌,与线性化的转移质粒pAdtrack-VEGFP-CDglyTK进行同源重组,获得重组腺病毒质粒pAdEasy-VEGFP-CDglyTK,转染293细胞,制备含VEGF启动子驱动的CD/TK融合基因重组腺病毒。结果 构建重组腺病毒质粒的成功率为60%(6/10)。转染293细胞后7~12d可收获病毒。结论 简化的细菌内同源重组法简便易行,重组效率较高,易于推广应用。     

血管紧张素Ⅱ2型受体基因重组腺病毒简便快速的构建方法

目的:利用细菌内同源重组法构建含血管紧张素Ⅱ2型受体(AT2R)基因的重组腺病毒。方法:应用PCR技术从质粒PUHD AT2R中克隆出AT2R基因片段,定向克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV中,PmeⅠ酶切线性化后转化Adeasier1细胞,抽提经鉴定含有目的基因的重组腺病毒质粒,PacⅠ酶切后用脂质体转染293细胞,包装成重组腺病毒Ad AT2R。用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有GFP报告基因,对病毒滴度进行监测。结果:PCR检测表明重组腺病毒已含有目的基因AT2R,滴度为1.5×1012pfu/ml。结论:细菌内同源重组法构建腺病毒比传统的细胞内同源重组法具有成功率高、方法简便、快捷和实验周期短的优点。AT2R基因重组腺病毒的成功构建为进一步实验研究奠定了基础。     

细菌内同源重组制备重组腺病毒及其初步应用

目的通过细菌内同源重组方法构建重组腺病毒。方法质粒pAdTrack酶切线性化后，通过电转化方法转化AdEasier细菌，线性化的腺病毒重组质粒转染293包装细胞后获得重组腺病毒，观察腺病毒感染喉癌细胞Hep-2后的报告基因表达情况及病毒对培养细胞生长的影响。结果构建的重组腺病毒经酶切电泳鉴定正确；扩增的腺病毒转染培养的Hep-2细胞8 h后即开始表达报告基因，48 h后全部细胞均有报告基因表达；该重组的腺病毒对培养Hep-2细胞生长无明显影响。结论通过细菌内同源重组方法构建重组腺病毒，方法简单、成功率高、实验周期短。     

共刺激阻断剂CTLA4Ig基因重组腺病毒的构建与鉴定

目的 构建共刺激阻断剂CTLA4Ig基因重组的腺病毒载体。方法 将CTLA4Ig cDNA插入腺病毒表达质粒；将重组质粒与病毒基因组质粒共转染293细胞，产生重组腺病毒；采用dot-ELISA和PCR法筛选并获得CTLA4Ig阳性表达的重组腺病毒。结果 同源重组后，以dot-ELISA法筛选到2个293细胞的CTLA4Ig蛋白阳性表达空斑，PCR证实为含CTLA4Ig基因和腺病毒基因的重组体AdvCTLA4Ig。结论 本研究构建了CTLA4Ig基因重组的复制缺陷型腺病毒AdvCTLA4Ig，为进行器官移植基因治疗研究提供了工具。     

人ICOS胞外区腺病毒载体的构建与鉴定

目的利用细菌内同源重组法构建含ICOS胞外区基因的重组腺病毒。方法用基因工程的方法将ICOS胞外区的cDNA片段插入穿梭质粒pAdTrack-CMV中,形成转移质粒pAdtrack-cmv-ICOS,将之PmeⅠ酶切线性化后与腺病毒基因组质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,同源重组质粒PacⅠ酶切鉴定后用脂质体转染293细胞,包装成重组体腺病毒颗粒Ad-ICOS。采用PCR方法对重组腺病毒颗粒进行鉴定,利用穿梭质粒pAdTrack-CMV中带有GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行监测。通过Western Blot检测重组腺病毒感染后的293细胞上清中的ICOS胞外区蛋白。结果获得了重组人ICOS胞外区腺病毒载体颗粒。PCR检测表明重组腺病毒颗粒含有目的基因,滴度为2.1×1010pfu/ml。Western Blot检测到阳性目的条带。结论细菌内同源重组法是一种高效、简便、快捷的重组体腺病毒载体制备方法。所制备的重组体腺病毒Ad-ICOS在体外能有效表达相应的基因产物,为今后对ICOS胞外区的深入研究奠定了基础。     

体内靶向树突状细胞的腺病毒通用肿瘤疫苗的构建

目的 采用细胞菌内同源重组法构建人端粒酶逆转录酶(hTRT)重组腺病毒,并将其以甘露聚糖进行表面修饰,以探索构建一种新型的体内靶向树突状细胞(DC)的通用型肿瘤抗原. 方法将编码hTRT的cDNA序列自pBABE-PURO-hTERT质粒亚克隆至腺病毒质粒pAdTrack-CMV中,将后者与骨架质粒pAdEasy-1经电冲击共转化宿主菌BJ5183进行同源重组.经过克隆筛选获得正确的重组腺病毒质粒后,将其线性化转染293细胞包装获得重组腺病毒.将重组腺病毒扩增纯化,以甘露聚糖进行表面修饰.最后将甘露聚糖修饰后的腺病毒免疫小鼠. 结果重组腺病毒能在293细胞产生细胞病变效应(CPE),腺病毒转染后的细胞通过PCR及免疫印迹能测到hTRT的表达.重组腺病毒经过甘露聚糖修饰后,经高碘酸席碱染色呈阳性.重组腺病毒能在小鼠体内靶向脾脏DC细胞. 结论成功构建能体内靶向DC细胞的hTRT重组腺病毒,为通用型肿瘤疫苗的研发作出了新的探索.     

Hyper-IL-6融合基因重组腺病毒的构建及其在肝细胞中的表达

目的 在扩增出融合基因Hyper-IL-6的基础上,构建重组腺病毒Ad-HIL-6.用Ad-HIL-6感染人肝细胞LO2,观察细胞内Hyper-IL-6 rnRNA和蛋白的表达情况.方法 将Hyper-IL-6克隆至穿梭质粒,线性化后与腺病毒骨架质粒在BJ5183细菌内同源重组,构建重组腺病毒质粒.线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞,PCR进一步证实重组腺病毒的存在.RT-PCR检测Ad-HIL-6感染LO2细胞后Hyper-IL-6基因的表达情况,Western blot法检测Ad-HIL-6感染LO2细胞后Hyper-IL-6的蛋白表达情况.结果 酶切及PCR鉴定表明同源重组成功,重组腺病毒质粒转染293细胞后可见绿色荧光,感染293细胞得到大量病毒.重组腺病毒Ad-HIL-6能在LO2细胞中表达出Hyper-IL-6基因和蛋白,条带分另q为1600bp和60KD左右.结论 重组腺病毒AdHIL-6构建成功,为以后进行基因治疗奠定基础.     

细菌内同源重组法快速制备重组腺病毒

目的：探讨细菌内同源重组两步转化法快速构建重组腺病毒质粒和制备重组腺病毒的方法。方法：将腺病毒骨架质粒pAdEasyl转化BJ5183高效感受态,制备pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态,将线性化的腺病毒穿梭质粒pAdtrack—CMV转化至含pAdEasy—1的BJ5183感受态,筛选获得重组腺病毒载体pAdEazy—CMV。获得的重组腺病毒载体线性化后转染HEK293细胞,包装、扩增出重组腺病毒RAdCMV,氯化铯梯度离心法进行纯化,采用电镜负染鉴定重组腺病毒,用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白GFP的表达并检测重组腺病毒的滴度。继而用纯化的蘑组腺病毒感染HeLa细胞,测定转染效率。结果：成功构建了重组腺病毒载体pAdEazyCMV,透射电镜和绿色荧光鉴定证实病毒包装成功,并且具有感染力,病毒的滴度呵达2．0×10^10pfu／ml。结论：细菌内同源重组两步转化法可以快速构建重组腺病毒质粒,为后续构建携带不同目的基因的重组腺病毒奠定基础。     

甲状旁腺切除术对甲状旁腺机能亢进性骨病的远期疗效

为了评价甲状旁腺切除术对原发性甲状旁腺机能亢进（ＰＨＰＴ）所致骨病的远期疗效，回顾分析了１６例术后平均５．１（１．０～１０．５）年患者的临床表现、骨结构和骨密度恢复情况，结果表明手术虽能明显改善患者骨病，但在随访终点有１０／１６例（６２．５％）骨病恢复不全，其中骨病重的Ｙ１组比骨病轻的Ｙ２组恢复不全比例更高（Ｐ＜０．０５），１４／１６例血骨钙素（ＢＧＰ）和尿吡啶并啉（Ｐｙｒ）浓度处于中青年对照组范围内，这意味着其成骨与破骨处于平衡状态。这些结果提示：ＰＨ－ＰＴ患者应尽早诊断治疗，术后应对患者密切随访，重视对骨病恢复不全者的后续治疗     

胰十二指肠切除术后住院时间影响因素分析-回顾性研究

Background. Postoperative hospital stay after pancreaticoduodenectomy (PD) was relatively longer than other gastrointestinal operations, The aim of current study was to investigate the risk factors of postoperative hospital stay after PD. Methods. Patients who were performed PD in Cancer Hospital Chinese Academy of Medical Sciences (CHCAMS) between December 2008 and November 2012 were selected for the retrospective study. The clinical and pathological data was collected and analyzed. The primary outcome was postoperative hospital stay. Normal discharge or recovery was defined as postoperative hospital stay no more than 10 days, otherwise it was defined as delayed discharge or recovery (including hospital death). Results. Finally, 152 patients were enrolled in present study. Postoperative hospital stay was 19.7±7.7 (7-57 d). 67 of 152 patients were normal discharge, and 85 of 152 patients were delayed discharge. The overall morbidity of complications was 62.5% (95/152), and the mortality rate was 3.29% (5/152). Multiple factors analysis showed that complication morbidity (adjusted OR=10.40, 95%CI=3.58-30.22), age (adjusted OR=4.09, 95%CI=1.16-14.39), BMI (body mass index) (adjusted OR=4.40, 95%CI=1.19-16.23), surgical procedure (adjusted OR=26.14, 95%CI=4.94-153.19), blood transfusion (adjusted OR=7.68, 95%CI=2.09-28.27) and fluid input (adjusted OR=3.47, 95%CI=1.24-11.57) were significantly associated with delayed discharge. Conclusions. Postoperative complications affects the postoperative hospital discharge. Furthermore, age, BMI, transfused red blood, surgical procedure and input might prolong LOS (length of hospital stay). Studies with more patients were needed in future.     

甲磺酰胺苯乙胺类化合物抗心律失常活性的定量构效关系研究(Ⅰ)

以ＰＯＬＹＧＥＮ软件中的ＣＨＡＲＭｍ程序和集团坐标轮换法，对合成的１２个甲磺酰胺苯乙胺类化合物的结构进行计算机分子模拟。根据所得化合物的能量最低构象，计算了其ＶＤＷ体积、偶极矩、总键能、总键角能、总非正则能以及氮原子电荷等值，并对这些化合物进行ＣＮＤＯ／２法量化计算，这些计算结果作为结构参数分别与１２个化合物抗心律失常活性进行相关分析，以逐步回归法建立了两个相关性较好的方程：ｌｇｌ／ＭＥＣ＝６．９９９１－０．３８４２Ｘ２＋３．６７９６Ｘ５［ｎ＝１２，ｒ＝０．８５５９７５，ｓ＝０．１８９６７２，Ｆ＝１２．３３４６４＞Ｆ１－０．０５（３，９）＝３．８６］；ｌｇｌ／ＭＥＣ＝１４．７０３８－２１３．２６９２Ｘ４－１０．４８２９Ｘ５［ｎ＝１２，ｒ＝０．９３１９１９，ｓ＝０．１３３０４７，Ｆ＝２９．７１３５４＞Ｆ１－０．０１（３，９）＝６．９９］。结果提示，这类化合物的抗心律失常活性与分子中的原子轨道杂化程度和氮原子对分子ＨＯＭＯ和ＬＵ－ＭＯ的贡献有关，可以看出，氮上的取代不同会引起抗心律失常活性的不同     

欧洲刺柏（Juniper）

活性成分与药理作用欧洲刺柏药用部位是其浆果，具有促水排泄、防腐、抗胃肠胀气和抗风湿作用，还可改善胃功能。用作促水排泄药可增加尿量（水丢失），但不增加钠排泄。成分萜品烯-4-醇可增加肾小球滤过率，但刺激肾。欧洲刺柏浆果对单纯疱疹病毒体外显示抗病毒活性，并具抗真菌活性。动物实验显示，欧洲刺柏浆果提取物具有堕胎、抗生育、抗炎、抗胚胎植入、降血压、升血压和降血糖作用。欧洲刺柏浆果油具有兴奋子宫的活性，以及利尿、胃肠道抗菌和刺激作用，该油对平滑肌有阻止解痉作用。     

基于网络药理学探讨独活-羌活-细辛治疗膝骨关节炎的作用机制*

目的 基于网络药理学的方法分析和预测独活-羌活-细辛治疗膝骨关节炎可能的作用机制。方法 利用TCMSP数据库获取独活、羌活、细辛的活性成分及靶点,与CTD、NCBI等数据库获取的膝骨关节炎疾病基因靶点映射,构建药物-活性成分-疾病靶点网络。进行MCODE聚类分析,通过Omicshare云平台和DAVID数据库GO、KEGG通路富集分析。结果 从3味药中共筛选出了36个活性成分及205个靶点,主要有山柰酚、 β-谷甾醇、芝麻脂素、异紫花前胡苷等关键成分,AKT1、ESR1、JUN、CASP3等为关键靶点,核心基因有NOS3、ESR1、COX1、NR1I2,关键的生物进程和通路有类固醇激素反应性、活性氧代谢过程、AGE-RAGE通路和TNF通路。结论 独活-羌活-细辛可能通过多成分、多靶点网络来治疗膝骨关节炎。