狂犬病病毒不同毒株的生物学特性研究

目的研究狂犬病不同固定毒株对动物的致病性和对细胞的感染性。方法以小鼠脑内和肌内途径接种比较不同毒株的致病性,研究并建立HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)诱导的空斑形成技术测定病毒空斑形成单位(plaque-forming unit,PFU)和细胞病变感染技术测定病毒感染滴度(CCID50),并用以比较不同毒株的病毒滴度,实验同时以常规的直接免疫荧光法(direct immunofluorescent assay,dFA)做对照。结果不同固定毒株对10~12g小鼠的脑内致病力普遍很高,但肌内毒力普遍较低,脑腔感染致病力比肌内感染致病力高3.0~5.0lg LD50,CVS株相差最大为5.0lg LD50。用两种新的方法 (PFU和CCID50)测定不同毒株的病毒滴度与dFA法测定的结果比较,除个别株外无明显差异,如CVS-11、4aG、PV株用三种方法测定的滴度均在7.1~7.9lg。结论用dFA法测定病毒滴度的结果与小鼠脑内测定的结果有可比性,用以替代小鼠脑内法测定病毒滴度是可行的。两种细胞感染法测定的病毒滴度操作简便,无需贵重仪器和昂贵试剂,可以更广泛地应用于狂犬病病毒和疫苗发展的研究。     

人呼吸道合胞病毒病理特征分析

目的 系统分析人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,HRSV)对体内外不同细胞影响的病理学变化特征.方法 将 HRSV A2株病毒接种到人二倍体KMB17细胞、VERO细胞,同时接种小鼠、乳鼠、豚鼠,通过病理切片及电镜切片检查,分析体内外不同细胞的感染变化情况.结果 HRSVA2株病毒对VERO细胞感染力强于二倍体KMB17,细胞;小鼠及乳鼠脑内接种不引起死亡,没有炎症细胞浸润;豚鼠鼻腔接种主要感染下呼吸道及肺部,引发浸润性病变,对核膜、核仁均产生损伤,肺及组织片状坏死.结论 VERO细胞适于HRSVA2株的病毒培养;豚鼠可作为HRSV毒力评价的动物模型.     

肾综合征出血热病毒毒力及抗原性研究

４３株不同来源的ＨＦＲＳＶ在乳小白鼠内传代，测定其平均死亡时间，并计算经脑内及皮下接种的半数致死量（ＬＤ５０）及半数感染量（ＩＤ５０），选择其中１７株病毒测定其蛋白含量，核膜结构蛋白滴度，二者的比值及其比活性。结果提示：４３株病毒据其毒力分为４个型，其乳鼠内传代次数与平均死亡时间及ＬＤ５０、ＩＤ５０无平行关系，不同毒株的核、膜结构蛋白比值，比活性各不相同，说明不同来源的ＨＦＲＳＶ毒力、抗原性各有差     

实验动物病毒感染监测试剂的研制——Ⅰ、Ⅲ型小鼠肝炎病毒、仙台病毒、Ⅱ型呼肠孤病毒、痘苗病毒抗原和抗体制备方法

本文描述以DBT细胞、人二倍体细胞(C15)、鸡胚尿囊液、鸡胚尿囊膜分别培养增殖Ⅲ型小鼠肝炎病毒、仙台病毒、Ⅱ型呼肠孤病毒和痘苗病毒的方法。获得的细胞病毒悬液经TCID_(50)、PFU或HA试验测定,其滴度与药品生物制品检定所供给的MHV_3、HVJ毒种和由荷兰引进的Reo_2毒种滴度无差异。以鼠脑培育的MHV_3抗原和C15培养的Reo2抗原分别免疫雌性小鼠,再以S 180细胞诱导小鼠产生腹水,所获腹水抗体经CF或HI试验测定,前者CF抗体滴度为1:64。后者HI抗体滴度为1:1280。以鸡胚囊尿液制备HVJ抗原,不论是免疫雄性来亨鸡还是免疫小鼠,所获血清或腹水的HI抗体滴度均≥1:1024。用鸡胚细胞痘苗抗原免疫家兔——注射两前脚掌和右后脚掌,也产生较理想的HI抗体水平(1:256～512)。     

肾综合征出血热病毒灭活疫苗的研究 Ⅰ、疫苗病毒株选择的研究

从34株HFRS病毒中选育出的3株病毒,在乳鼠脑内的分布相同,小鼠以嗜神经症状为主,表现为后肢麻痹;3株病毒的毒力基本一致,但41D株毒力略高于A16和R63株,从16株单克隆抗体反应结果来看,3株病毒与多数克隆抗体均起反应。其中A16抗原决定簇较完全。三株病毒与不同毒株的免疫血清反应表现出抗原的一致性,交叉中和试验能产生高滴度的中和抗体并能中和病毒。故认为3株病毒均达到了制备灭活疫苗的基本条件,并用A16病毒制备了灭活疫苗。     

广州2002年登革病毒流行株的分离鉴定及进化分析

目的从2002年广州采集的可疑登革病人血清中分离登革病毒,明确流行株的血清型及基因型,并鉴定该分离株的毒力。方法采集疑似登革热患者血清20份,应用C6／36细胞体外培养的方法进行病毒分离,并合成登革病毒通用引物,进行逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)后,将PCR扩增产物克隆到T载体进行序列测定和比对。确定血清型后,进一步扩增在病毒进化上有代表意义的病毒血清型特异性E／NS1连接区基因片段,测序后用邻位相连(N—J)法构建登革病毒进化树,分析此次登革病毒流行株的来源。通过乳鼠脑内接种及空斑实验,测定分离株的毒力。结果上述20份血清标本中,5份标本出现明显的细胞病变,主要表现为细胞融合,形成大小不一的空泡和网状结构。RT-PCR扩增、序列测定证实为登革病毒Ⅰ型。E／NS1连接区基因序列片段分析表明,2002年广州分离株(DEN-1／GZ2002)的核苷酸序列与基因型Ⅳ型的DEN—1／T14株(澳大利亚,1981)同源性最高,达98％。N—J法构建进化树显示：11株DEN-1病毒分成3个基因群,分别与Rico-Hesse1990分型中的Ⅰ,Ⅳ和Ⅴ型以及Ana P．Goncalvez 2002年分型中的亚洲型,南太平洋型和美N／tbN型相符,本室分离的DEN-1／GZ2002株属于Ⅳ型或者称南太平洋型。DEN-1／GZ2002株脑内接种乳鼠11d左右导致乳鼠弓背,后肢麻痹、瘫痪,直至死亡。感染Vero细胞8d后可见小而不透明的空斑,病毒滴度可达10^6pfu／ml,TCID50为4．37log pfu／0．2ml。结论2002年广州登革热流行为登革病毒Ⅰ型感染所致,病毒基因型为Ⅳ型,本实验虽然未明确毒力相关基因,动物实验及细胞感染实验证实该分离株的毒力较弱。     

人巨细胞病毒增殖性感染新生乳鼠大脑皮质神经细胞

目的探讨人巨细胞病毒(HCMV)AD169株在体外增殖性感染新生乳鼠大脑皮质神经细胞。方法在长成单层的Balb/c新生乳鼠的大脑皮质神经细胞培养物上,接种TCID50为5×103/3ml的HCMVAD169株感染的HF细胞上清液。通过相差显微镜、PCR、RT-PCR、间接免疫荧光、TCID50、透射电镜等方法观察和鉴定HCMV在神经细胞内的感染状况。结果接种病毒的大脑皮质神经细胞在感染后第1天即可观察到特征性细胞病变效应,且随着感染时间的延长病变逐渐加重;HCMVIE和UL83DNA及mRNA检测均可见阳性条带;HCMVpp65蛋白免疫荧光检测亦为阳性,蛋白质表达量随着培养时间的延长明显提高;TCID50检测随着感染时间的延长病毒滴度逐渐上升;在神经元胞浆内通过透射电镜观察到病毒颗粒。结论HCMVAD169株可能具有增殖性感染乳鼠大脑皮质神经细胞的能力。     

肾综合征出血热病毒血凝活性的初步研究

目前,我国已从多种宿主动物和不同疫区患者血液中分离出肾综合征出血热病毒(HFRS-V),并已证实这些毒株的毒力及抗原性并不完全一致。1984年,汤一苇、TF Tsai等曾报道朝鲜出血热(KHF)病毒(76/118)株具有血凝活性,但迄今尚未见对我国分离的HFRS-V血凝活性研究的报道。为了探讨我国不同宿主来源的HFRS-V有无血凝活性、血凝活性与毒力的关系、不同毒株血凝素的特异性及其相互关系,我们在将国内各主要代表毒株(曾经McAb检查具有抗原性差异)和KHF76/118株适应于乳鼠的基础上,参照汤一苇等报道的方法加以简化,从感染乳鼠脑制备血凝素,对这些毒株的血凝活性进行了研究。 结果表明,我国自黑线姬鼠、家描和病人血液中分离的HFRS-V均具有不同程度的血凝活性,血凝滴度的高低似与病毒对乳鼠的致病力有关。在野鼠型毒株,血凝活性均达到一定滴度,如自安徽分离的陈株、C_4株,血凝滴度达1:128,略高于76/118侏(1:64),黑龙江的H8205株血凝滴度为1:32～1:64,四川的A_(216)株也达1:32。而家鼠型毒株,如自河南轻型出     

肾综合征出血热病毒A_(16)株乳鼠脑内传代病毒繁殖的电镜观察

肾综合征出血热病毒(HFRS)A_(?)株,是我们研制死毒疫苗的代表株之一。通过小白鼠乳鼠脑内传代,可以使乳鼠有规律地发病。用间接荧光抗体试验及血凝抑制等方法鉴定,证实为HFRS 病毒。为了进一步从电镜下验证,我们用超薄切片法和病毒提纯后负染色法,对A_(?)株的病毒进行了形态研究。     

空心莲子草类盐注射液治疗乳鼠汉滩病毒感染

目的 :研究空心莲子草类盐注射液治疗汉滩病毒 (HTNV)感染乳鼠的疗效。方法 :应用正交设计 ,选择空心莲子草类盐注射液剂量为 2 0 0mg·kg-1·d-1对感染HTNV 76 / 118株的乳鼠进行治疗 ,采用微量细胞培养结合直接免疫荧光法和逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)检测治疗后乳鼠不同组织中的病毒滴度和病毒核酸。结果 :空心莲子草类盐注射液能减轻乳鼠发病症状 ,降低死亡率 ,延长平均生存天数 ;乳鼠脑、心、肺、脾、肾等脏器中感染性病毒滴度下降 ;空心莲子草类盐能加快血液中HTNV76 / 118的清除。同时研究结果也显示空心莲子草类盐注射液抗HT NV 76 / 118株的作用类似病毒唑。结论 :空心莲子草类盐注射液在体内对HTNV感染乳鼠有治疗作用。     

缺失C8-K3片段重组天坛痘苗病毒的免疫策略研究

目的探索不同的DNA疫苗初免-重组痘苗病毒加强免疫策略的效果,为建立最佳免疫方案提供依据。方法对小鼠进行DNA疫苗初免,之后分别加强免疫一针、两针和三针重组痘苗病毒VTT△C8-K3-gag,在不同时间点采取血样及制备脾细胞,检测针对痘苗病毒和HIV特异性体液免疫及细胞免疫应答。结果三种免疫策略中,DNA疫苗初免-VTT△C8-K3-gag加强免疫两次的效果最佳,诱导的针对p55的结合抗体滴度达到106,分泌IFN-γ的T细胞数为342/106细胞。针对痘苗病毒的体液和细胞免疫应答显著低于加强免疫三针诱导的免疫反应。结论DNA疫苗初免-VTT△C8-K3-gag加强免疫两针可诱导较高水平的HIV免疫应答,同时保证了较低水平的载体免疫反应。     

带EB病毒膜抗原基因痘苗病毒的构建和表达

以痘苗病毒天坛株为载体,构建表达EB病毒膜抗原的重组痘苗病毒株。在重组病毒的感染细胞膜上表达病毒的膜抗原。该抗原免疫家兔能产生抗体。     

可疑病鼠的鼠痘病毒分离和鉴定

用可疑病鼠的肝脏及病变组织经接种鸡胚绒毛尿囊膜及ＨｅＬａ细胞分离出一株病毒，该毒株可使鸡胚颈毛尿囊膜上产生典型痘斑，通过细胞病形态、病变组织嗜酸包涵体、电镜观察及特展览因清学鉴定，证实所分离病毒符合鼠病病毒的特征。     

用痘苗病毒天坛株及池田株提高鼠白血病L_(7711)细胞抗原性的研究

本文用痘苗病毒天坛株及池田株分别处理615鼠白血病L_(7711)细胞制备瘤苗,对鼠进行免疫后,再用L_(7711)细胞攻击。结果表明,免疫组均比对照组腹水增长缓慢、生存期延长。证明两株病毒均能增强鼠L_(7711)白血病细胞的抗原性,而且天坛株比池田株作用明显。     

HPV58型E7基因重组痘苗疫苗免疫保护作用的实验研究

目的制备含人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)58型E7基因的重组痘苗病毒疫苗,并利用动物肿瘤模型观察疫苗接种效果。方法利用PCR方法扩增HPV58E7DNA片段,在消除其转化活性的基础上,构建表达HPV58E7的重组痘苗病毒疫苗并免疫小鼠,观察该疫苗对E7阳性肿瘤细胞生长的抑制作用,体外诱导、测定细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocytes,CTL)活性。结果经定点突变的HPV58E7基因转化活性显著降低,用突变的E7基因构建的重组痘苗病毒免疫小鼠后,能抑制E7阳性肿瘤细胞在小鼠体内的生长并延长小鼠的生存期;免疫小鼠脾淋巴细胞体外可诱导产生针对E7阳性肿瘤的CTL细胞。结论在消除转化活性的基础上,HPV58E7可用于治疗与HPV58感染有关的肿瘤。     

Construction of a vaccinia virus vectored multi--epitope live vaccine candidate for Plasmodium falciparum

Theemergenceandrapidspreadofdrug--resistantPlasmodiumfalciparumandinsecticide--resistantmosquitoeshaveseriouslyimpairedtheeffectivenessofthecommontoolsformalariacontrol.Theneedsforaneffectivevaccineisthusurgentandofprimeimportancetothepreventionofmalaria[lj.Inconsiderationofseveralmajorobstaclestothedevelopmentofaneffectivevaccine,especiallythevariabilityofantigensandthespecifityofstageandspecies(strain)ofmalariaparasites,thelivevaccinebasedoneukeryoticexpressionandmultiplegenesispaidattention…     

CEA重组痘苗病毒对实验性CEA阳性肝癌的预防和治疗作用

目的：探讨CEA重组痘苗病毒(CEA—rV)对小鼠CEA阳性肿瘤的预防和治疗作用。方法：①预防作用观察：将实验小鼠分为4组，第1、2组和第3、4组分别皮下接种野生型痘苗病毒(W—VV)和CEA—rV3次，末次接种后，第1、3组皮下注射同源鼠CEA阴性肝癌细胞(Hepa—CEA)，第2，4组接种Hepa—CEA^ 。肿瘤细胞接种后每周测量肿瘤体积，共6周。②治疗作用观察：第1、2组先皮下注射Hepa—CEA^-，3、4组接种Hepa-CEA^ ，7d后1、3组皮下接种W—VV，2，4组接种CEA—rV。肿瘤细胞接种后每周测肿瘤体积，共6周。结果：①预防作用：接种CEA—rV和Hepa—CEA^ 组(第4组)小鼠在观察期内无肿瘤形成，其他小鼠皮下均有肿瘤形成，并且以相近速度增长。②治疗作用：接种Hepa—CEA^ 和CEA—rV组(第4组)小鼠皮下肿瘤生长缓慢，瘤块较小，其他3组肿瘤生长迅速，瘤块较大。整个实验过程中各组小鼠均未表现出其他任何不良反应。结论：CEA—rV对实验性CEA阳性肿瘤具有良好的预防和治疗作用，而且预防作用更佳。     

季节性流感疫苗对小鼠感染H7N9禽流感病毒的保护效力

目的 评价季节性流感裂解疫苗对流感病毒H7N9的免疫保护效力。方法 用我国2012～2013年度季节性流感裂解疫苗,以腹腔注射方式免疫BALB/c小鼠,并设PBS免疫模型组,末次免疫14 d后以5 LD₅₀ A/Anhui/1（H7N9）进行攻试验。感染后观察记录小鼠临床表现,体重变化,并分别于第2天和第4天每组处死3只小鼠,取肺组织和鼻甲骨测病毒滴度和载量。结果 感染后疫苗与模型组小鼠体重下降明显,疫苗组存活率为10%,模型组全部死亡。感染后第4天疫苗组鼻甲骨滴度显著低于模型组。血凝抑制试验及中和实验表明免疫小鼠血清无中和H7N9病毒抗体。结论 季节性流感疫苗在小鼠中对于H7N9流感病毒感染无明显保护作用。     

可溶性白细胞介素6受体β亚基在重组痘苗病毒中的表达及其对动物的免疫效果

目的 :构建可溶性白细胞介素 6受体 ( IL- 6R) β亚基 ( sgp130 )重组痘苗病毒 ,感染动物细胞使其表达 sgp130 ,用重组病毒免疫动物产生特异性抗 sgp130抗体。　 方法 :将 sgp130基因导入痘苗病毒载体 p JSA1175,用脂质体转染法将重组载体与野生型痘苗病毒在 TK-143细胞中发生同源重组 ,用 Bud R和 X- gal双重选择 ,得到带有人 sgp130的重组病毒 ( Vsgp130 )。　 结果 :采用 IDA和 Western Blotting法证实 ,感染 Vsgp130的 TK-143细胞上清中有较强的 sgp130表达 ,表达产物分子量为 10 0 0 0 0左右。用重组病毒免疫家兔和 Balb/c小鼠 ,可刺激抗体产生。　 结论 :sgp130在痘苗病毒载体系统中的表达成功及抗 sgp130多克隆抗体的产生为进一步研究 IL- 6等细胞因子信号传导机理及研制抗 sgp130单克隆抗体奠定了基础     

恶性疟多表位疫苗在鼠疟的保护性试验

为寻找恶性疟原虫基因工程多表位疫苗保护性评价的模型动物,利用鼠约氏疟原虫（Plasmodium　yoelii）及伯氏疟原虫小鼠（Phasmodium　bergher）模型对本实验室构建的恶性疟原虫（Plasmodium　falciparum）多表位基因工程候选疫苗进行了体内保护性及免疫模式试验。结果在约氏疟原虫,先用该疫苗基因的大肠杆菌表达蛋白免疫、后用含同一基因的重组痘苗病毒加强免疫组与野生型痘苗病毒免疫组及空白对照相比,小鼠的死亡时间延长（P<0.01）。结果初步显示,约氏疟原虫鼠模可用作该基因工程多表位恶性疟原虫候选疫苗的保护性评价。