wtp53基因在不同发育阶段大鼠小肠上皮细胞的表达特征及其与肠损伤修复的关系

目的研究抑癌基因wtp53在不同发育时期Wistar大鼠小肠上皮细胞的表达、分布特征以及与细胞增殖分化的关系,探讨wtp53基因在小肠创伤修复时可能发挥的生物学作用.方法利用wtp53单克隆抗体,以超敏的SP免疫组织化学方法,观察wtp53基因在胚胎、新生期各时间段Wistar大鼠小肠上皮细胞的阳性表达与分布特征.同时以细胞增殖活性的标志PCNA表达为参照,对不同时期细胞的增殖分化状况作对比性研究.结果在胚胎第17d(E17d)、E19d、新生期第1(P1)d,小肠上皮细胞wtp53基因的阳性表达范围较广,染色强度较深.P2d和wtp53基因表达不仅范围扩大且染色强度明显增强;到幼鼠期第28d,wtp53基因在小肠上皮细胞的表达为阴性;从胚胎至P2d,PCNA的表达与wtp53类似,而幼鼠期第28d,PCNA阳性细胞仅局限于小肠绒毛隐窝.结论在小肠发育的早期,上皮细胞的快速增殖分化期伴随着wtp53基因的高度表达,可能对遗传物质DNA的完整性起到监视和保护作用.     

乳腺癌p16，p53基因蛋白和mRNA的表达及其意义

目的:探讨乳腺癌组织p16和p53基因蛋白及其mRNA的表达及其意义。方法:采用免疫组化法和RT-PCR技术，检测乳腺癌组织和癌旁组织中p16和p53基因蛋白及其mRNA的表达。分析其表达与乳腺癌临床病理学特征之间的关系。结果:癌旁乳腺组织中p16基因蛋白的表达率为90.0%（27/30），p53基因蛋白的表达率为6.67%（2/30）;乳腺癌组织中p16基因蛋白表达率为38.3%（23/60），p53基因蛋白表达率为48.3%（29/60）。癌旁乳腺组织的p16 mRNA显著高于乳腺癌组织(P=0.023)，而在乳腺癌组织的p53mRNA水平显著高于癌旁乳腺组织（P=0.001）。乳腺癌细胞分化程度越高p16蛋白表达率越高，而p53表达蛋白正相反;有淋巴结和/或器官转移者p16蛋白表达率明显低于无淋巴结和/或器官转移者，而p53蛋白的表达率则相反。p16mRNA在组织学Ⅰ级的水平显著高于Ⅱ，Ⅲ级，而Ⅱ，Ⅲ级之间差异无显著性;p53mRNA在组织学Ⅰ级的水平显著低于Ⅲ级。有淋巴结和/或器官转移的p16mRNA和p53mRNA表达明显低于和高于无淋巴结和/或器官转移者。结论:p16和p53基因的改变与乳腺癌的发生发展关系密切，可用于评估乳腺癌的预后。     

神经肽对大鼠骨髓间质干细胞增殖影响的研究

目的 观察外源性降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)、P物质(substance P,SP)对大鼠骨髓间质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖的影响,并探讨其机制.方法 使用全骨髓法分离、培养大鼠BMSCs,采用RT-PCR、Western Blot在传代培养的不同时间(1、2、3周)检测BMSCs神经肽受体mRNA、蛋白的表达情况.在不同时间点(1、3、5、7、9 d)使用浓度为1×10-8 mol/L的CGRP、SP分别作用于BMSCs,使用MTT比色法检测BMSCs增殖能力,Western Blot法检测BMSCs细胞周期相关调控基因cyclin D1、cyclin E、p53的蛋白表达变化.结果 RT-PCR、Western Blot结果显示BMSCs稳定表达CGRP受体、SP受体,同一时间点的CGRP受体表达高于SP受体表达.MTT结果显示,与对照组相比,CGRP在9d时促进BMSCs增殖,SP在7、9 d时促进BMSCs增殖.Western Blot结果显示,与对照组相比,CGRP促进BMSCs内cyclin D1、cyclin E蛋白表达,在5 d时达到高峰;SP促进BMSCs内cyclin E蛋白表达,在5 d时达到高峰;两种神经肽均降低BMSCs内p53蛋白表达.结论 CGRP、SP对BMSCs的增殖有直接促进作用,影响细胞周期相关调控基因蛋白的表达是其作用机制之一.     

神经肽对大鼠骨髓间质干细胞增殖影响的研究

目的 观察外源性降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)、P物质(substance P,SP)对大鼠骨髓间质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖的影响,并探讨其机制.方法 使用全骨髓法分离、培养大鼠BMSCs,采用RT-PCR、Western Blot在传代培养的不同时间(1、2、3周)检测BMSCs神经肽受体mRNA、蛋白的表达情况.在不同时间点(1、3、5、7、9 d)使用浓度为1×10-8 mol/L的CGRP、SP分别作用于BMSCs,使用MTT比色法检测BMSCs增殖能力,Western Blot法检测BMSCs细胞周期相关调控基因cyclin D1、cyclin E、p53的蛋白表达变化.结果 RT-PCR、Western Blot结果显示BMSCs稳定表达CGRP受体、SP受体,同一时间点的CGRP受体表达高于SP受体表达.MTT结果显示,与对照组相比,CGRP在9d时促进BMSCs增殖,SP在7、9 d时促进BMSCs增殖.Western Blot结果显示,与对照组相比,CGRP促进BMSCs内cyclin D1、cyclin E蛋白表达,在5 d时达到高峰;SP促进BMSCs内cyclin E蛋白表达,在5 d时达到高峰;两种神经肽均降低BMSCs内p53蛋白表达.结论 CGRP、SP对BMSCs的增殖有直接促进作用,影响细胞周期相关调控基因蛋白的表达是其作用机制之一.     

Livin mRNA及Bcl-2，p53蛋白在胰腺癌中的表达

目的:探讨凋亡抑制蛋白Livin在胰腺癌组织中的表达及其与Bcl-2和p53蛋白表达的关系。 方法:采用逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）法检测52例胰腺癌和12例正常胰腺组织中Livin mRNA的表达；用免疫组织化学法检测胰腺癌组织中Bcl-2和p53蛋白的表达。 结果:Livin mRNA在胰腺癌中的表达率为71.2%，明显高于正常胰腺组织（P＜0.01）。Livin基因表达与胰腺癌的分化程度和淋巴结转移有关（P＜0.05）。Livin基因表达与Bcl-2蛋白表达有关，而与p53蛋白无关。 结论:Livin基因在胰腺癌的发生发展中起重要作用；Livin与Bcl-2的异常表达可能在胰腺癌的发生中起协同作用；Livin基因过表达与抑癌基因p53的失活无关。     

辛伐他汀对大鼠骨量及骨髓基质干细胞增殖、分化的影响

目的观察辛伐他汀体内给药对大鼠骨量和骨髓基质干细胞增殖、分化的影响。方法16只9周龄雌性SD大鼠按体重随机分成2组,每组8只：第1组（G1）,对照组,每天蒸馏水灌胃（N）;第2组（G2）,实验组,辛伐他汀灌胃20mg·kg^-1·d^-1（S20）,持续3周,于最后1次灌胃的第2天处死所有大鼠,取右侧股骨行骨密度和骨组织形态计量学测定;取左侧股骨和胫骨骨髓细胞分别向成骨、成脂方向诱导培养,并作如下检测：（1）成骨组：采用Cell Counting Kit-8（CCK-8）法检测定向成骨分化中的骨髓基质干细胞的增殖能力;细胞培养第16d和28d分别检测碱性磷酸酶（ALP）比活性、ALP染色和von Kossa染色;细胞培养第16d,提取总RNA,采用Real-time RT-PCR检测骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2,BMP-2）、碱性磷酸酶（ALP）、破骨细胞分化因子（RANKL） mRNA的表达;（2）成脂组：采用CCK-8法检测定向成脂分化中的骨髓基质干细胞的增殖能力;细胞培养第18d,检测LPL比活性,并提取总RNA,采用Real-time RT-PCR检测脂蛋白脂酶（LPL） mRNA的表达。结果辛伐他汀体内给药干扰21d后大鼠骨量和骨密度无显著变化。体外培养骨髓基质干细胞所有检测基因 mRNA水平、细胞增殖能力、矿化能力（von Kossa染色）、ALP比活性、ALP染色、LPL比活性两组间差异均无显著性。结论辛伐他汀体内给药3周对大鼠骨量及骨髓基质干细胞的增殖和分化无显著作用。     

早期直肠癌中p53和hMLH1的表达

目的探讨p53基因和hMLH1基因的突变是否是直肠癌发生的早期事件之一。方法用PV-9000二步法免疫组化检测技术对我院2003年2月至2009年7月期间的32例早期直肠癌、32例直肠腺瘤及30例正常直肠黏膜组织石蜡切片进行p53和hMLH1基因蛋白表达的检测。结果①正常直肠黏膜组织、直肠腺瘤组织及早期直肠癌组织中p53蛋白表达阳性率分别为0(0/30)、59.38%(19/32)及68.75%(22/32),其在直肠腺瘤组织和早期直肠癌组织中的p53蛋白表达阳性率差异无统计学意义(P0.05),但二者均明显高于其在正常直肠黏膜组织中的表达(P0.01);hMLH1蛋白在前述三种组织中的表达阴性率分别为0(30/30)、12.50%(4/32)和50.00%(16/32),其在早期直肠癌组织中的表达阴性率明显高于在直肠腺瘤组织和正常直肠黏膜组织中的表达(P0.01)。②在直肠腺瘤组织和早期直肠癌组织中p53阳性表达同时合并hMLH1阴性表达者分别占9.38%(3/32)及37.50%(12/32),二者间差异有统计学意义(P=0.008)。③p53阳性表达和hMLH1阴性表达均与早期直肠癌的分化程度有关(P0.05),而均与患者的性别、年龄、肿瘤最大径、浸润深度及大便潜血均无关(P0.05)。④p53阳性表达与腺瘤的增生程度有关(P=0.009),hMLH1阴性表达与腺瘤的增生程度无关(P0.05)。结论 p53基因和hMLH1基因的同时突变致癌作用明显,可能是直肠癌发生的早期事件之一。     

p53对HepG2细胞AMPKβ1基因表达的影响

目的研究p53对HepG2细胞AMPKβ1基因表达的影响,探讨p53通路对细胞生长的调控机制。方法体外培养HepG2细胞,利用依托泊苷（VP-16）对细胞DNA损伤作用引起细胞内p53蛋白的变化,以未处理细胞作对照。采用WesternBlot定量检测细胞内p53蛋白量和半定量RT-PCR检测AMPKβ1 mRNA相对表达量。结果在VP-16处理6h、12h、24h后,细胞内p53蛋白水平显著高于对照组（P〈0．05）,同时AMPKβ1mRNA相对表达量亦显著高于对照组（P〈0．05）。结论细胞内p53蛋白的升高与AMPKβ1mRNA的表达增强呈现一致,AMPKβ1可能是抑癌基因p53影响细胞生长的下游调控基因。     

p53 modRNA促进人诱导多能干细胞来源早期心肌细胞分化成熟的初步研究

目的 探索p53 modRNA对促进人诱导多能干细胞来源早期心肌细胞分化成熟的影响.方法 将p53 mod-RNA转染至人诱导多能干细胞来源的早期心肌细胞,利用qRT-PCR检测心肌细胞成熟相关基因mRNA的表达情况;利用Western blot检测心肌细胞成熟相关蛋白的表达情况;利用细胞免疫荧光染色观察心肌细胞的形态...     

结直肠癌患者血清中瘦素表达的研究

目的 探讨血清瘦素水平与结直肠癌各种临床病理改变的关系.方法 用双抗体夹心ABC-ELISA法检测30例无营养不良的结直肠癌患者(肿瘤组)和24例健康成年人(对照组)血清瘦素水平,分析结直肠癌不同临床病理特征下血清瘦素水平的差异;检测肿瘤组患者的血清CEA及CA19-9水平,用RT-PCR方法 测定肿瘤组肿瘤标本中K-ras、p53、腺瘤性结肠息肉病(APC)基因及结直肠癌缺失基因(DCC)mRNA的表达水平.结果 肿瘤组血清瘦素水平[(3.53±1.72) μg/L]明显高于对照组[(2.27±1.01) μg/L],P＜0.05,且这种差异与性别无关.肿瘤组中不同肿瘤部位、不同TNM分期间的血清瘦素水平差异无统计学意义(P>0.05);但随着肿瘤分化程度的降低,血清瘦素水平呈现下降趋势,其中低分化者的血清瘦素水平明显低于高分化者和中分化者(P＜0.05).肿瘤学的相关性分析结果 显示,血清瘦素水平与结直肠癌患者的血清CEA和CA19-9水平,肿瘤组织的癌基因K-ras以及抑癌基因p53、APC和DCC的表达均无相关性(P>0.05).结论 结直肠癌患者血清中的瘦素水平高于正常人;肿瘤的分化程度影响了血清瘦素的表达,但结直肠癌的TNM分期、部位和血清肿瘤标志物的水平与血清瘦素水平无关,与结直肠癌发生、发展密切相关的各种基因的表达与血清瘦素水平也无关.     

胆囊癌组织细菌L型的检测与p21及p53基因突变的关系

目的 探讨胆囊癌的发生与细菌L型感染和p21及p53基因突变的关系。方法 采用免疫组化SP法和革兰氏染色技术，对40例胆囊癌及40例慢性胆囊炎组织中的细菌L型和突变型p53蛋白及p21蛋白进行检测，并对胆囊癌组织中的细菌L型阳性伴p21及p53蛋白阳性表达结果和细菌L型阴性伴p21及p53蛋白阳性表达结果进行对比分析。结果 胆囊癌组织中革兰氏染色细菌L型检出率为77．5％(31／40)，明显高于胆囊炎的57．5％(23／40)，P＜0．05，且与免疫组化细菌L型抗原表达阳性率[80．0％(32／40)]具有一致性；胆囊癌组织中的p21及p53蛋白表达阳性率分别为62．5％(25／40)和65．0％(26／40)，明显高于胆囊炎组织中的p21及p53蛋白表达阳性率[2．5％(1／40)和5.0％(2／40)]，P＜0．05；胆囊癌组织中的细菌L型阳性者其p21及p53蛋白表达阳性率分别为75．0％(24／32)和78．1％(25／32)，明显高于细菌L型阴性者的p21及p53蛋白的表达阳性串率[12.5％(1／8)，12．5％(1／8)]，P＜0。05。结论 细菌L型参与了p21及p53基因的突变，并在胆囊癌的发生中可能起协同作用。     

p53对胃癌细胞BGC823中Survivin基因表达的影响

目的 探讨p53基因对胃癌细胞株BGC823中Survivin基因表达的影响及其作用机制。方法 应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot技术检测胃癌细胞株BGC823中Survivin和p53基因表达情况；利用质粒pcDNA3．0-rpS3转染该细胞株。应用实时聚合酶链反应（PCR）和Western blot检测细胞在培养后不同时间点Survivin mRNA和蛋白表达水平。结果 确认了胃癌细胞株BGC823中Survivin和突变型p53基因的表达。受野生型p53质粒转染的胃癌细胞在培养16和24h后，Survivin mRNA和蛋白质水平呈明显下降趋势。结论 野生型p53在转染胃癌细胞株BGC823后可显著抑制后者Survivin基因的转录和表达。     

雌激素对小鼠骨髓间质细胞LIM矿化蛋白-1 mRNA表达的影响

目的探讨雌激素对小鼠骨髓间质细胞LIM矿化蛋白-1（LIM mineralization protein—1,LMP-1）基因转录的影响。方法卵巢切除5个月后小鼠的骨髓间质干细胞经7d成骨诱导后,用100nmol／L17β-雌二醇（1713-E2）处理24h,通过RT-PCR法扩增LMP-1的mRNA,测定扩增条带的吸光度值,并用其与β-actin吸光度的比值来表示产物mRNA的相对含量。结果1713-E2处理组LMP-1的mRNA表达明显高于非处理组（P〈0．01）。结论雌激素可通‰过促进骨髓间质细胞LMP-1的mRNA表达以发挥其促成骨作用。     

Cyclin A和p21cip1在增生性瘢痕成纤维细胞中的表达及与细胞周期相关性的探讨

目的 探讨增生性瘢痕(HS)不同时期成纤维细胞(FB)中细胞周期素A(Cyclin A)、细胞周期蛋白-激酶的抑制因子p21cip1基因及蛋白的表达与同时期FB所处的细胞周期的相关性,为细胞周期相关基因的干预用于HS的防治提供前期理论依据.方法 采集HS不同时段(3、6、12、24个月)瘢痕标本32例,每个时段8例,并以8例正常皮肤作为对照组.利用实时荧光定量PCR法、蛋白质免疫印迹(Western blotting)法检测HS及正常皮肤中Cyclin A和p21cip1的mRNA、蛋白表达水平;用流式细胞术检测HS中FB的细胞周期情况.结果 HS中CyclinA的mRNA及蛋白质表达量在3、6、12、24个月组分别为19.34±2.41、0.99±0.11,19.30±1.42、0.96±0.09,10.73±2.93、0.66±0.58,9.29±0.97、0.65±0.14.p21cip1的mRNA及蛋白质表达量在3、6、12、24个月组分别为2.8±0.69、0.35±0.07;4.95±1.82、0.44±0.07;9.98±1.19、0.56±0.06;10.25±1.46、0.59±0.06.Cyclin A的mRNA和蛋白的表达,3与6个月组比较差异无统计学意义(P>0.05);3、6个月组分别与12、24个月和正常组比较差异有统计学意义(P<0.05);12、24个月与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05).p21cip1的mRNA和蛋白的表达,3个月组低于6个月组(P<0.05);3、6个月组分别与12、24个月和正常组比较表达明显降低(P<0.05);12、24个月和正常组比较差异无统计学意义(P>0.05).流式细胞仪检测结果显示3、6个月增生性瘢痕中细胞主要分布在S、G2/M期;而12、24个月组增生性瘢痕及正常皮肤中的细胞多处于G0/G1期.结论 随着HS的发展,HS中CyclinA的mRNA和蛋白的表达强度呈由强至弱的变化,p21cip1的mRNA和蛋白的表达则呈由弱至强的变化.不同时期HS中CyclinA和p21cip1各自的mRNA和蛋白的表达趋势基本一致;不同时期HS中FB的细胞周期分布情况与CyclinA和p21cip1 mRNA和蛋白表达强弱相对应;在HS发生早期对这两个基因进行干预,有可能在控制增生性瘢痕的发生和发展中发挥作用.     

在胆管癌组织中检测p53,p21WAF1的表达

目的 研究胆管癌中ｐ５３,ｐ２１＾ＷＡＦ１基因表达以及它们之间的关系。以期为找到一种早期诊断及判断胆管癌预后的方法找下一个基础。方法 本研究采用３０例人胆管癌及癌旁组织配对资料,应用原位杂交及免疫组化方法检测、ｐ５３、ｐ２１＾ＷＡＦ１基因表达经们之间的关系。进而分析它们与临床病理资料之间的相关性。结果 原位杂交检测３０例胆管癌中有１４例（１４／３０,４６．７％）呈ｐ５３阳性,１２例（１２／３０,４０．０％）ｐ２１＾ＷＡＦ１阳性。ｐ５３,ｐ２１＾ＷＡＦ１原位杂交结果与胆管癌的临床病理资料无明显相关性。免疫组化检测３０例胆管癌中,Ｐ５３蛋白表达阳性率明显高于无局部淋巴结转移组;临床Ⅲ期的病人Ｐ５３蛋白阳性率明显高于临床Ⅰ和Ⅱ期的病人,并且有Ｐ５３蛋白表达的病人其生存期明显短于无Ｐ５３蛋白表达的病人。ｐ２１＾ＷＡＦ１     

中波紫外线照射对HaCaT细胞p53mRNA和p53蛋白表达的影响

目的：研究中波紫外线（UVB）照射对永生化角质形成细胞株-HaCaT细胞的p5 3mRNA和p53蛋白表达的影响.方法：以一定剂量UVB照射HaCaT细胞,分别用RT-PCR法和Western blot方法检测照射后不同时间点的p5 3mRNA和p5 3蛋白的表达水平;同时检测不同剂量UVB照射后同一特定时间点p5 3mRNA和p53蛋白的表达水平.结果：30mJ/cm^2的UVB照射后HaCaT细胞的p5 3mRNA和p5 3蛋白表达逐渐增加,4h达到峰值,后逐渐恢复至照光后24h接近正常值;不同剂量UVB照射4h后,p53mR-NA和p53蛋白表达随剂量增加而增加.结论：HaCaT细胞p5 3mRNA和p5 3蛋白表达与UVB照射存在一定的时间和剂量关系.     

RNA激活技术上调p21WAF1/CIP1基因表达对胆囊癌细胞增殖、侵袭与迁移能力的影响

目的利用RNA激活技术上调人胆囊癌细胞(GBC-SD)中p21基因的表达,观察其对GBS-SD细胞体外增殖、侵袭和迁移能力的影响。方法将与p21基因启动子DNA序列互补的双链RNA分子(dsRNA)转染入人胆囊癌细胞中,采用RT-PCR法和Western blot分别检测p21基因mRNA及蛋白的表达情况;MTT法检测细胞增殖活性;Transwell小室法检测RNAa后细胞侵袭、迁移能力的变化。结果 dsRNA转染GBC-SD细胞72h后能显著上调p21基因mRNA和蛋白的表达,与空白组和对照组比较,转染dsp21后,GBC-SD细胞的增殖活性明显受到抑制,细胞侵袭及迁移能力明显下降。结论 RNAa技术能有效上调p21基因的表达并抑制细胞的增殖活性,降低其侵袭及迁移能力,为胆囊癌疾病的基因治疗提供依据。