纹状体组织提取液诱导人胚胎神经干细胞向多巴胺能神经元分化的实验研究

目的体外培养人胚胎神经干细胞并诱导其向多巴胺能神经元分化。方法从临床引产的人胚胎（胎龄8～16周）海马组织中分离、培养人胚胎神经干细胞, 对其进行诱导分化。诱导剂采用来源于20周胎龄胚胎的纹状体的组织提取液。实验分为2组：对照组无诱导剂,培养基为撤除生长因子的基础培养基;实验组培养基中加入纹状体组织提取液50μL/mL;于诱导分化的第7天终止诱导分化,采用标记TH的免疫荧光染色方法检测TH阳性细胞量,用RT-PCR方法检测TH-mRNA的表达情况。结果抗TH的免疫荧光染色结果为：对照组与实验组的TH阳性细胞率分别为(0.53±0.17)%和(7.38±0.84)%,两组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。RT-PCR结果显示：对照组TH-mRNA表达不明显,实验组明显表达TH-mRNA,实验组与对照组的TH-mRNA表达差异亦有统计学意义（P＜0.05）。结论纹状体组织提取液具有促进人胚胎神经干细胞向多巴胺能神经元分化的作用。     

全反式维甲酸诱导中脑神经干细胞向多巴胺能神经元分化的作用

目的：观察全反式维甲酸（all-trans retinoic acid,ATRA）体外对大鼠中脑神经干细胞（neural stem cells,NSCs）的诱导分化作用及其可能的分子机制。方法：分离培养孕14～15 d大鼠中脑NSCs,使用1.0μmol/L ATRA诱导1、3、5和7 d,以免疫组织化学染色观察ATRA对NSCs分化为多巴胺能神经元的影响;RT-PCR分析维甲酸（retiadic acid,RA）各受体表达情况。结果：ATRA诱导后多巴胺能神经元特异性酪氨酸羟化酶（TH）染色呈阳性,细胞有多个细长突起,与对照组比较,诱导7 d后多巴胺神经元特异性TH染色阳性细胞率均明显升高（P〈0.01）;各诱导组RA受体βmRNA的表达量均明显升高（P〈0.01）,而且存在时间依赖性。结论：ATRA能显著提高NSCs分化为多巴胺能神经元的比例,同时发现细胞维甲酸A受体（RAR）βmRNA表达增加,RARβ激活可能促进NSCs向多巴胺神经元方向的分化。     

全反式维甲酸及银杏提取物对神经干细胞分化的影响

目的探讨全反式维甲酸(ATRA)、银杏提取物(Egb)对体外培养的神经干细胞(NSCs)分化为胆碱能神经元和多巴胺能神经元的作用。方法取第3代NSCs诱导分化,试验分为4组:ATRA组(10-8mol/L)、Egb组(2mg/L)、ATRA(10-8mol/L)+Egb组(2mg/L)和空白对照组;免疫细胞化学染色检测神经微管相关蛋白(MAP2)、乙胆碱酯酶(AchE)和酪氨酸羟化酶(TH)的表达,并计算阳性染色细胞的百分率。结果ATRA组诱导神经干细胞分化为AchE阳性和TH阳性神经元的百分率分别为26·32%±3·62%和12·02%±2·78%;Egb组分别为42·93%±3·08%和18·13%±1·74%;ATRA+Egb组分别为43·32%±5·60%和13·03%±2·54%;空白对照组分别为27·68%±2·51%和5·74%±1·81%。结论ATRA和Egb均可促进NSCs向TH阳性神经元分化,Egb还可促进NSCs向AchE阳性神经元分化,ATRA和Egb联用无协同效应。     

不同浓度GDNF诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化研究

目的观察不同浓度胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对神经干细胞(NSCs)向多巴胺(DA)能神经元分化的影响。方法取新生鼠脑组织体外分离培养NSCs,第2代NSCs诱导培养基中分别加入0、5、10、20 ng/mL GDNF进行诱导。用逆转录-聚合酶链反应检测诱导后细胞酪氨酸羟化酶(TH)mRNA的表达,免疫细胞化学染色鉴定NSCs,检测NSCs向DA能神经元分化率。结果各诱导组均表达TH mRNA。神经球具有自我更新和表达巢蛋白的能力,诱导分化后的细胞能表达神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞特异性抗原。与空白对照组比较,GDNF诱导组TH阳性细胞率均明显升高(P<0.05);且10、20ng/mL GDNF诱导组升高幅度明显高于5 ng/mL GDNF诱导组(P<0.05),10、20 ng/mL GDNF诱导组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论从新生鼠脑组织分离出NSCs。不同浓度的GDNF均能促进NSCs向DA能神经元分化,GDNF浓度从10ng/mL提高到20 ng/mL时TH阳性细胞率无明显变化。     

Differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells into dopaminergic neuron-like cells induced by angiotensin Ⅱ combined with growth factor

目的:观察血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,AngⅡ)联合应用多种生长因子体外诱导人骨髓间充质干细胞(Human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs)向神经元和多巴胺神经元分化的潜能.方法:从正常人骨髓中分离单个核细胞并对hBMSCs进行纯化、鉴定;hBMSCs先经用碱性成纤维细胞生长因子和表皮细胞生长因子预诱导,再用胶质细胞源性神经营养因子(Glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)和AngⅡ联合诱导生长良好的hBMSCs向神经元分化.倒置显微镜观察hBMSCs分化过程中细胞形态的变化;RT-PCR方法检测诱导前后hBMSCs神经干细胞的标记物巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(Neuron-specific enolase,NSE)、神经胶质细胞的特异性标记物酸性纤维蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)以及多巴胺能神经元特异性标记物酪氨酸羟化酶(Tyrosinehydroxylase,TH)等标志物的表达情况;免疫荧光法检测诱导前后hBMSCs的NSE、TH和GFAP蛋白表达情况.结果:流式分析获得了高纯度的hBMSCs.在不同浓度的AngⅡ诱导2周后,倒置显微镜观察hBMSCs,具有典型神经元细胞形态,大多呈双极、多极和锥形;Nestin、NSE、TH的基因mRNA表达量,诱导组相较于对照组,有显著性差异(P＜0.05);免疫荧光细胞化学检测结果表明诱导分化后表达NSE、Nestin、TH蛋白的细胞数明显增加(P＜0.05),但诱导前后的细胞都不表达GFAP基因.结论:多种生长因子联合AngⅡ可以在体外诱导hBMSCs分化为多巴胺能神经元样细胞.     

神经干细胞诱导分化成多巴胺能神经元的时间效应

目的 探讨培养于诱导分化液中不同时间的大鼠神经干细胞体外诱导分化成多巴胺能神经元的效应.方法 大鼠神经干细胞球在含有细胞因子IL-1、IL-11、GDNF和LIF的诱导分化液中分别培养2、4、6、8的10 d后,流式细胞仪检测其体外诱导分化成多巴胺能神经元的分化率.结果 在诱导分化液中大鼠神经干细胞球呈贴壁生长,球形结构开始塌陷,球内细胞从球体中央逐渐向四周分化扩展出较多形态各异的细胞,多数细胞有1、2个长突起或有多个短突起.免疫组织化学显示分化的细胞中含有TH阳性细胞,流式细胞仪检测诱导分化2、4、6、8和10 d的神经球分化成TH阳性细胞比率分别为(3.2%±0.9%)、(6.8%±1.6%)、(16.7%±2.6%)、(14.8%±1.8%)和(12.2%±2.5%).结论 大鼠神经干细胞体外诱导分化成多巴胺能神经元存在着分化的时间效应,诱导分化6d的神经干细胞分化成多巴胺能神经元的比率最高.     

Notch1基因在神经干细胞分化过程中的表达

目的　研究Notch1基因在全反式维甲酸 (all trans retinoic acid ,ATRA)诱导人胚胎神经干细胞分化为神经元过程中的表达及其发挥的作用。方法　用 1 μmol/L的ATRA在体外诱导人胚胎神经干细胞 ,诱导 7d后 ,做神经元特异性烯醇化酶 (neuronspecificendase,NSE)免疫荧光染色 ,计数分化为神经元的比例。于诱导前、诱导 3d和诱导 7d ,提取细胞的总RNA。用半定量RT PCR法检测Notch1基因的表达。结果　与对照组相比 ,ATRA能显著提高人胚胎神经干细胞分化为神经元的比例 (P <0 .0 1 )。Notch1基因在ATRA诱导后明显下调 (P <0 .0 0 1 )。结论　ATRA能显著提高人胚胎神经干细胞分化为神经元的比例 ,Notch1基因在人胚胎神经干细胞分化为神经元的过程中起负调控作用。     

GDNF基因转染诱导神经干细胞向神经元分化的作用

目的探索转染GDNF基因到大鼠神经干细胞(neural stemcell,NSC)的方法,并研究其诱导大鼠神经干细胞向神经元和多巴胺能神经元分化的作用。方法体外扩增GDNF基因,并构建带有绿色荧光蛋白(GFP)的表达载体PcDNA3-GDNF-GFP质粒。悬浮培养大鼠胚胎神经干细胞,脂质体介导PcDNA3-GDNF-GFP质粒转染神经干细胞,荧光显微镜观察转染及表达情况;免疫细胞化学鉴定β-微管蛋白Ⅲ(β-Tubulin III)和酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase,TH),以确定神经干细胞的分化为神经元和多巴胺能神经元情况。结果转染后72 h,荧光蛋白大量表达。脂质体介导PcDNA3-GDNF-GFP质粒转染神经干细胞后,神经干细胞分化为神经元和多巴胺神经元的比例明显增高。结论脂质体介导GDNF基因转染神经干细胞的方法简单、有效,是一较为理想的基因转染方法。GDNF基因能明显促进神经干细胞分化为神经元和多巴胺神经元的比例。     

人孤雌胚胎干细胞向多巴胺能神经元的体外分化

目的 研究人孤雌胚胎干细胞向神经上皮祖细胞和神经元诱导分化的能力.方法 人孤雌胚胎干细胞在人饲养层细胞上诱导后机械消化传代,在多巴胺能神经元诱导培养基中悬浮后贴壁分化,Pax6、Nestin和PSA-NCAM抗原染色检测神经上皮祖细胞的形成,Tuj1和TH抗原粢色检测多巴胺能神经元的形成.结果 人孤雌胚胎干细胞诱导可形成的神经上皮祖细胞中,具有典型的rosette结构,其Pax6和Nestin阳性细胞比例分别为(84.7±5.3)%和(92.0±4.7)%.该神经上皮祖细胞可形成PSA-NCAM染色阳性的神经元前体和Tuj1染色阳性的神经元,Tuj1阳性细胞中(33.3±4.3)%为酪氨酸羟化酶染色阳性细胞.结论 人孤雌胚胎干细胞体外诱导分化可形成高纯度的神经上皮祖细胞,并可进一步分化为多巴胺能神经元.     

人神经干细胞向多巴胺神经元的定向分化

目的 :将体外扩增的神经干细胞在体外诱导向多巴胺能神经元分化 ,为帕金森氏病的细胞移植治疗奠定基础。方法 :利用无血清培养和单细胞克隆技术从 4月龄胚胎中脑组织获得神经干细胞 ,用 10 %胎牛血清 (FBS)、IL -1α以及IL -1α +IL -11+LIF+GDNF的组合诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化 ,用酪氨酸羟化酶 (TH)免疫检测分化为多巴胺神经元的情况。结果 :10 %FBS只能使极少数神经干细胞分化为TH阳性的多巴胺神经元 ;IL -1α可以诱导神经干细胞较多地分化为TH阳性多巴胺神经元 ,但细胞形态上不成熟 ;联合应用IL -1α、IL -11、LIF、GDNF后 ,分化的多巴胺神经元数量上和单用IL -1α相似 ,但细胞形态上比较成熟。结论 :联合应用IL -1α、IL -11、LIF、GDNF等细胞因子诱导人神经干细胞分化得到的TH阳性多巴胺神经元不但数量较多 ,其细胞形态也比较成熟     

特定微环境下诱导脐血间充质干细胞向神经细胞的分化

目的 在体外分离培养人脐血间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs),探讨脐血间充质干细胞体外培养生长特性及向神经细胞分化的诱导条件.方法 在体外将脐血MSCs进行向神经细胞的定向诱导,观察脐血MSCs的形态变化,并在诱导后第5天用免疫荧光染色检测脐血MSCs中神经元细胞特异性的标志物;并与单纯低糖DMEM培养基培养的对照组脐血MSCs相比较.结果 诱导组中的脐血MSCs生长伸展,形成突起,呈放射状,并可互相形成连接,免疫荧光显示特异性烯醇化酶(neuronspecific enolase,NSE)阳性,表现出神经元细胞的特性.而对照组中的脐血MSCs未形成神经样形态结构,免疫荧光NSE阴性.结论 脐血MSCs可在体外经化学方法 定向诱导分化为神经细胞,可应用于神经修复及再生等领域.     

CD133~+人脐血造血祖细胞的干性维持培养及鉴定

目的从人脐带血中分选出CD133+造血祖细胞,并进行长时间干性维持培养。方法通过免疫磁珠法分选出人脐带血中的CD133+造血祖细胞,经流式细胞仪检测免疫磁珠分选后的CD133+造血祖细胞。采用五种方法扩增培养该细胞,8周后,再通过细胞形态学、流式细胞术、免疫细胞化学和免疫荧光对细胞进行干性鉴定,探索最佳干性维持培养方法。结果通过免疫磁珠法可以从人脐带血中分选出80%以上的CD133+造血祖细胞。采用优化的无血清培养基培养8周之后,CD133+造血祖细胞可得到有效扩增。而其他的培养基会使CD133+造血祖细胞由半悬浮细胞分化为梭形贴壁细胞,并且细胞状态欠佳。结论利用免疫磁珠法分选出的CD133+造血祖细胞,采用优化的无血清培养基能够有效扩增该细胞,并可长期有效的维持其干性。     

OECs无血清上清液体外诱导UB-MSCs向神经细胞分化

目的:观察大鼠嗅鞘细胞无血清上清液诱导脐血间充质干细胞向神经细胞分化的作用。方法:采用差速贴壁联合阿糖胞苷抑制法获得较高纯度的嗅鞘细胞,在最佳状态细胞无血清培养后取上清液。收集正常足月剖腹产胎儿的脐带血,经肝素抗凝,用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞,采用差速贴壁法纯化间充质干细胞,传第三代后用上述收集的嗅鞘细胞无血清上清液诱导,观察诱导分化过程,免疫组化鉴定分化结果。结果:用差速贴壁和阿糖胞苷抑制法可获得纯度高达95%的嗅鞘细胞,使用无血清嗅鞘细胞上清液培养脐血间充质干细胞后,发现能诱导脐血间充质干细胞向神经细胞形态分化,胞体呈椭圆形,伸出长突起。诱导7天后相差显微镜下可观察到神经干细胞、神经元和胶质细胞形态的细胞,与NSE、GFAP细胞免疫组化结果一致。结论:大鼠嗅鞘细胞无血清上清液有明显诱导脐血间充质干细胞分化为神经细胞的作用。     

低氧促进人脐带血间充质干细胞向神经细胞分化

目的探讨低氧环境对脐带血间充质干细胞诱导分化成神经细胞的促进作用。方法收集4例志愿者脐带血,分离获得间充干细胞,体外扩增培养。研究分为常氧组、常氧诱导组、低氧组、低氧诱导组。研究低氧诱导培养的脐带血间充质干细胞组与对照组比较在细胞生物学特征、诱导分化能力等方面的差异。结果在5%含氧量条件下细胞的增生能力不同程度的提高;在诱导成神经细胞的过程中,低氧诱导的间充质干细胞向神经细胞的分化能力增强。神经细胞表面标记Nestin、NF-M表达阳性。与常氧诱导的脐带血间充质干细胞组比具有显著性差异（P〈0.05）。结论低氧条件可以提高脐带血间充质干细胞向神经细胞分化的产率。     

人脐带来源的基质细胞分化为神经细胞

目的探索人脐带组织来源的基质细胞向神经细胞分化的可能性,为神经移植探寻新的细胞来源。方法采用组织块培养法培养人脐带基质细胞,酶消化法对细胞进行传代,应用免疫细胞化学的方法对细胞进行鉴定。结果从脐带组织成功培养出基质细胞,这种细胞可以随机分化为平滑肌细胞,表达平滑肌肌动蛋白;丹参注射液诱导基质细胞向神经细胞分化,分化的神经元样细胞具有典型的神经细胞的形态,早期表达巢蛋白、β-管蛋白和神经元特异性烯醇化酶,后期表达神经微丝200;在合适的诱导条件下,分化的神经元样细胞的比例在90％左右,分化的细胞中星型胶质细胞的比例在1％左右,无髓鞘基础蛋白的表达,说明无少突胶质细胞产生。结论脐带组织来源的基质细胞可以表达神经细胞的标志物,在体外能够分化为形态复杂的神经元样细胞,这种细胞有可能成为神经移植的种子细胞。     

干细胞移植联合电针治疗对脊髓损伤修复的影响

目的研究人脐血干细胞移植联合电针刺激治疗脊髓损伤过程中对于类胰岛素样生长因子-1（IGF-1）表达的影响。方法将SD大鼠利用随机数字表法随机分成3组,所有大鼠均为脊髓横断损伤。脊髓损伤（SCI）组,干细胞移植（UCBSC）组,干细胞移植＋电针刺激（UCBSC＋EA）组,每组均为12只。UCBSC、UCBSC＋EA组在损伤处注射脐血干细胞,SCI组以等量PBS缓冲液代替,UCBSC＋EA组每天固定时间取损伤处上、下部位的＂大椎＂＂命门＂进行电针刺激。各组均在损伤后的7天、14天和28天于损伤处取材,观察神经元细胞的形态、数量及IGF-1表达。结果常规HE组织学检查发现横断处灰质内神经元细胞变性、减少,并伴星形胶质细胞增生,细胞体肥大。免疫组化显示,损伤后IGF-1表达均上调,UCBSC、UCBSC＋EA两组表达进一步上调,IGF-1的表达在前14天显著上调,14天后表达放缓。Western Blot结果显示,与单纯的人脐带血移植（UCBSC）相比较,UCBSC＋EA更能促进IGF-1的表达,且有统计学意义（P〈0.05）。RT-PCR电泳结果显示UCBSC＋EA组,IGF-1mRNA的表达明显高于其他两组,有显著性差异（P〈0.05）。结论 UCBSC＋EA在大鼠脊髓损伤处可更有效分泌神经营养因子IGF-1,弥补脊髓损伤后维持神经元细胞生存所匮乏的营养因子,促进神经元细胞存活。     

脐血间质干细胞移植后梗死心肌细胞的凋亡及意义

目的探讨脐血间质干细胞移植对梗死心肌残存心肌细胞凋亡的影响。方法无菌条件下采集成年杂种妊娠犬脐血,体外分离、纯化、培养、扩增脐血间质干细胞,经5-氮杂胞苷(5-aza)体外诱导向肌源性细胞分化,DAPI荧光标记,经左冠状动脉前降支灌注移植入成年杂种犬急性心肌梗死模型区域,2、4、8周取心肌标本,采用HE染色及TUNEL法检测犬心肌梗死模型中脐血间质干细胞移植后心肌细胞的凋亡情况。结果免疫组化法检测结果表明,培养的细胞为脐血间质干细胞,在5-aza诱导作用下可向肌源性细胞定向分化,2、4、8周后在移植区域观察到带荧光的心肌纤维和细胞核,排列方向与残留心肌组织基本一致,荧光标记的肌纤维相互连接。经TUNEL法检测可见在脐血间质干细胞移植组和对照组心肌梗死区域均有凋亡的心肌细胞分布,但移植组凋亡细胞明显低于非移植组;HE染色有相似的阳性率,阳性细胞多具有凋亡的形态特征。结论脐血间质干细胞移植梗死心肌除能形成心肌再生外,尚能减少心肌梗死后梗死区域的心肌细胞凋亡,达到延缓心室重构的目的。应用TUNEL法检测心肌细胞凋亡有较强的实用性。     

脐血干细胞移植对帕金森病大鼠神经功能恢复的影响

目的:观察脐血干细胞移植对帕金森病(PD)大鼠神经功能恢复的影响.方法:PD大鼠模型分成实验组(n=10)和对照组(n=10).将第三代脐血间充质干细胞(MSCs)用Hoechst33258标记后植入实验组大鼠纹状体内,对照组注射PBS.此后每周腹腔注射阿朴吗啡以观察神经功能恢复情况,并在2周,4周,8周用免疫荧光双标法检测MSCs的存活,迁移以及胶质纤维酸性蛋白(GFAP),神经元特异性烯醇化酶(NSE),酪氨酸羟化酶(TH)和突触素的表达.利用高效液相色谱-电化学检测仪(HPLC-ECD)检测纹状体多巴胺含量.结果:脐血MSCs移植后大鼠的旋转行为与对照组相比有明显改善(P＜0.05);MSCs可在大鼠脑内存活,随时间延长,迁移范围扩大,分布于纹状体,胼胝体和皮质;GFAP,NSE,TH都有表达,突触素无表达.多巴胺水平与对照组相比有明显提高(P＜0.05).结论:脐血MSCs有望成为治疗PD的种子细胞,为神经退行性变提供一种治疗方法.     

不同细胞因子对脐血CD34+细胞扩增的影响

目的探讨不同细胞因子促进脐血CD34 细胞扩增的效应,为下一步的临床应用奠定基础。方法采用EasySep免疫磁珠阳性选择系统分离脐血中CD34 细胞,在无血清、无基质细胞培养体系中添加不同细胞因子培养2周,分组:A组,SCF FL TPOB组,SCF FL TPO IL-3C组,SCF FL TPO G-CSF。结果CD34 细胞数目于培养后7d达到峰值,3组间差异无显著性;B组扩增至14d时细胞总数达(384.40±17.48)倍,显著高于另外2组。扩增7d后的脐血细胞经体外培养可形成造血集落。结论体外扩增脐血CD34 细胞理想的细胞因子组合为SCF TPO FL,以7d为宜。