p66Shc-线粒体信号通路在氧化低密度脂蛋白诱导的巨噬细胞凋亡中的作用

【立论依据】 氧化低密度脂蛋白(oxLDL)可经线粒体途径诱导巨噬细胞凋亡并影响动脉粥样硬化斑块稳定性,但具体的分子机制尚未阐明。近有研究显示:在人内皮细胞,oxLDL可通过激活蛋白激酶C-β(PKCβ)与c—Jun氨基末端激酶(JNK)从而使衔接蛋白p66^Shc发生磷酸化;另有文献报道:磷酸化的p66^Shc可转位到线粒体引起线粒体损伤。本实验旨在探讨p66^Shc-线粒体信号通路在oxLDL诱导的人巨噬细胞凋亡中的作用。 【设计思路】 本实验分两部分:第一部分拟证明oxLDL可促进巨噬细胞中p66^Shc的磷酸化及线粒体转位;第二部分拟证明p66^Shc磷酸化及转位在oxLDL诱导的线粒体损伤、线粒体凋亡途径中起重要作用。 【实验内容】 采用序列超速离心法分离健康人新鲜血浆LDL,继而用CuSO4氧化制备oxLDL;体外培养THP-1细胞(人外周血单核细胞)并用佛波酯诱导为巨噬细胞,蛋白质印迹法检测oxLDL对p66^Shc及胞浆和线粒体中磷酸化p66^Shc(Ser36)蛋白表达的影响;而后将细胞分为对照组、oxLDL组及oxLDL+SiRNAp66^Shc组,用流式细胞仪及荧光显微镜检测线粒体膜电位、线粒体内超氧阴离子及细胞凋亡的变化,蛋白质印迹法检测线粒体凋亡途径相关蛋白的表达。 【材料】 采用含10%FBS的高糖1640培养液培养细胞;采用Rhodamine 123染色检测线粒体膜电位,MitoSOX Red试剂盒染色检测线粒体内超氧阴离子,AnnexinV FITC 试剂盒双染检测细胞凋亡;采用p66^Shc、phospho-p66^Shc( Ser36)、细胞色素C、caspase-9等抗体检测相关蛋白的表达。 【可行性】 我们前期预实验结果显示oxLDL可加速p66^Shc磷酸化和线粒体损伤,且两者呈正相关,这为该假说的成立提供了有力证据;实验负责人跟随导师进行科研工作两年,已熟练掌握相关实验技术;本实验承担单位泰山医学院动脉粥样硬化研究所具备实验所需全部仪器设备,实验条件完善。 【创新性】 本实验首次研究p66^Shc在oxLDL诱导的人巨噬细胞线粒体凋亡中的作用,可进一步阐明p66^Shc与AS发生发展的关系,从而为AS的防治锁定新靶点。     

晚期糖基化终产物诱导内皮细胞通透性增高的机制

【立论依据】 晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)可通过[Ca²⁺]通道诱导细胞凋亡,而AGEs是否也能通过该通道诱导内皮细胞通透性增高尚不清楚,若我们能够证实,将对于糖尿病防治及其并发症的控制具有重大指导意义。 【设计思路】 用EGTA抑制外钙内流,研究[Ca²⁺]在AGEs介导的肌动蛋白骨架的改变,通透性的增高以及moesin磷酸化中所起的作用。 【实验内容】 探讨AGEs介导肌动蛋白丝F-actin改变的剂量和时间效应;证实 EGTA对AGEs介导内皮细胞骨架肌动蛋白改变的抑制作用;探讨AGEs引起内皮细胞通透性增高的时间和剂量效应;证实AGEs介导内皮细胞通透性的改变是[Ca²⁺]依赖性的;探讨AGEs引起moesin蛋白磷酸化的时间和剂量效应;验证AGEs引起moesin蛋白磷酸化是[Ca²⁺]依赖性的。 【材料】 激光共聚焦显微镜,跨上皮细胞电阻检测仪,倒置显微镜,垂直电泳仪,Transwell培养皿,低温离心机,Petri Dish培养皿,HUVECS细胞株,胰蛋白酶,Moesin抗体及磷酸化Moesin抗体,罗丹明-鬼笔环肽,胎牛血清,磷酸盐缓冲液,0.5% TritonX-100,4%多聚甲醛固定液,FITC标记的右旋糖干,EGTA标准溶液,细胞裂解液,封闭缓冲液,Tris盐缓冲液,TBST缓冲液,电泳加样缓冲液,Tris溶液。 【可行性】 本项目假设有类似文献支持,有一定的理论基础。本研究团队近年来一直在休克微循环实验室从事AGEs和内皮细胞通透性方面的工作。经过多次试验,已掌握一定的技术手段和研究数据。我们的预实验结果已经显示AGEs刺激脐静脉内皮细胞呈浓度和时间效应,且EGTA能有效地抑制了AGEs在第8小时诱导的通透性的增高。 【创新性】 本研究将首次阐述AGEs是否依赖于[Ca²⁺]导致内皮细胞通透性的增高,目前国内外还未有论文涉及此话题,研究结果将进一步揭示AGEs在糖尿病并发症、动脉粥样硬化相关疾病的机制。     

TRPC通道在阿尔茨海默病(AD)大鼠的蛋白表达及其功能研究

【立论依据】 阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease, AD)也称老年痴呆症,是发生在老年人的一种中枢神经系统退行性疾病。临床表现为进行性记忆力丧失、认知功能减退以及人格改变。AD的发病病因和机制至今尚不清楚。瞬时受体电位阳离子通道(TRPC)是一类非选择性Ca²⁺通道,广泛表达于平滑肌细胞、内皮细胞和中枢神经系统,主要维持细胞内、ER和线粒体的Ca²⁺水平。在神经系统,主要参与神经增殖和退行性变。单核苷酸多态性(SNP)研究表明,TRPC4通道参与到阿尔茨海默病的发病中,但目前TRPC通道在阿尔茨海默病动物模型神经组织中的表达和功能机制尚不清楚。 【设计思路】 本项目采用寡聚型Aβ早期AD大鼠模型,对TRPC家族通道在神经系统的表达进行分析,给予TRPC通道激活剂和阻断剂,观察分离神经细胞的钙代谢变化及AD大鼠的行为学改变,探讨TRPC通道在AD发病过程中的作用。 【实验内容】 (1)大鼠海马区注射Aβ寡聚体构建早期的阿尔茨海默病模型;Morris水迷宫检测大鼠的神经元损伤和学习记忆功能障碍及病理学改变。(2) 分离海马区的神经元细胞,利用RT-PCR和蛋白质印迹法检测TRPC家族通道在神经组织中的表达。(3)分离海马区的神经元细胞,给予TRPC通道的激活剂和阻断剂,利用激光扫描共聚焦显微镜技术,检测神经细胞的胞内钙离子浓度变化。(4)给予在体AD大鼠模型TRPC通道的激活剂和阻断剂,观察大鼠的行为学改变。 【材料】 Morris水迷宫设备、激光扫描共聚焦显微镜。 【可行性】 研究室拥有本实验所需的设备和大鼠AD模型制备技术。学生拥有基本的分子生物学实验技能。 【创新性】 目前TRPC通道在阿尔茨海默病动物模型神经组织中的表达及其功能机制尚不清楚,未见有相关报道;试验结果可以为以TRPC通道为靶点的阿尔茨海默病的药物治疗提供理论基础。     

人胚胎干细胞诱导分化角膜内皮细胞

【目的】 体外模拟角膜内皮细胞(corneal endothelial cell, CEC)的发育过程,利用生长因子和细胞外基质构建微环境,制备适当的条件培养基诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cell, hESC)分化为CEC。 【方法】 用丝裂霉素C处理胚鼠成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts, MEFs),接种于明胶预包被培养皿内做饲养层细胞。hESCs接种于MEFs饲养层,传代并免疫荧光鉴定。分割hESCs克隆团块,用拟胚体(embryonic bodies, EBs)培养基悬浮培养形成球形的EBs。用丝裂霉素C处理角膜基质细胞,接种于明胶预包被培养皿内做饲养层细胞。EBs接种于膜基质细胞饲养层,将SV-40转染的人晶状体上皮细胞接种于transwell小室与EBs共培养,EBs逐渐分化形成类角膜内皮细胞。环钻钻取新鲜猪眼球中央角膜片,脱细胞处理后,机械切取脱细胞猪角膜基质(acellular porcine cornea matrix, APCM),即获得APCM支架。倒置显微镜下剖切APCM后板层,甘油脱水。将hESCs来源的类角膜内皮细胞接种于APCM后弹力层表面构建CEC植片,培养7 d。 【结果】 hESCs培养6 d后可于饲养层上形成类圆形克隆团,在悬浮培养基中悬浮培养形成EBs。EBs于角膜基质成纤维细胞饲养层上与人晶状体上皮细胞系共培养,EB面积逐渐增大,中央部分形态发生变化,形成单层排列的多边形细胞。免疫荧光检测,可表达类角膜内皮细胞标记物Na⁺/K⁺ ATPase。类角膜内皮细胞接种于APCM支架培养,H-E染色证实后弹力层表面形成单层类角膜细胞结构。 【结论】 目前已经完成了hESC、人角膜基质成纤维细胞和人晶状体上皮细胞系的培养。实现了hESCs向角膜内皮细胞的诱导分化。完成了APCM的制备和鉴定。并成功以hESC和APCM构建了组织工程角膜内皮植片。植片的功能有待动物实验进一步研究。     

TSC1基因对调节性T细胞发育分化的免疫调控作用

【目的】 本研究利用TSC1的T细胞特异缺失小鼠探讨TSC1对T细胞尤其是调节性T细胞(Treg)发育的免疫调控效应。 【方法】 主要应用T细胞特异性TSC1基因敲除小鼠(Lck-cre; TSC1loxp/loxp)及细胞分子免疫学技术, 阐明TSC1基因对CD4⁺ Treg发育分化及其免疫功能的重要调控作用和规律。 【结果】 (1)TSC1基因缺失小鼠,其胸腺CD4⁺CD8^-T (CD4SP),CD8⁺CD4^-T(CD8SP),CD4^-CD8^-T(DN)和CD4⁺CD8⁺T(DP)细胞百分率无显著差异;(2)TSC1基因缺失小鼠CD4⁺Foxp3⁺Tregs百分率和细胞绝对数均明显增加;(3)小鼠外周免疫器官(脾脏)的CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T细胞百分率和绝对数均无显著差异;(4)小鼠胸腺中CD4⁺CD25⁺Foxp3^-T细胞百分率和绝对数有下降的趋势;(5)小鼠胸腺中Treg其他亚型如CTLA-4以及GITR型均有所增加。 【结论】 TSC1缺失可以影响nTreg的发育和分化,而对iTreg发育和分化无明显影响,并且TSC1对于nTreg的调节可能是通过调控其前体发育分化而实现的。     

同型半胱氨酸经PRMTs调控E2F1 差异甲基化介导内皮细胞凋亡和平滑肌细胞增殖的作用机制研究

【立论依据】 动脉粥样硬化(AS)是以退行性和增生性病变为特征的复杂性疾病,高同型半胱氨酸血症(HHcy)是其独立危险因子。内皮细胞(ECs)和血管平滑肌细胞(VSMCs)是HHcy致AS形成的基本细胞类型,但两者的病理变化却截然相反:ECs主要表现为凋亡、损伤和功能障碍;而VSMCs则主要表现为增殖、基质合成和分泌亢进;有研究提示E2F1可因修饰位点不同而分别调控细胞的凋亡和增殖,是决定细胞增殖或凋亡的"开关",但其在Hcy致ECs凋亡和VSMCs增殖并存中的具体作用未见报道。 【设计思路】 E2F1是既能促增殖亦能促凋亡的关键靶基因,Hcy经PRMTs修饰E2F1 不同位点导致血管ECs凋亡和VSMCs增殖并存从而引起As。 【实验内容】 复制HHcy AS模型,验证模型是否成功;分析血管组织中ECs凋亡和VSMCs增殖的变化,并在体外培养ECs和VSMCs上验证;检测E2F1在血管和两种细胞中的表达,在HHcy致ApoE^-/-鼠AS模型和ECs/VSMCs共培养的基础上确定E2F1在Hcy致ECs凋亡和VSMCs增殖并存中的作用。分别在ECs和VSMCs及共培养的细胞内过表达和沉默PRMTs,检测E2F1修饰后产物的变化,并以流式细胞术等观察ECs凋亡和VSMCs增殖情况,探讨不同细胞类型中E2F1 精氨酸甲基化的作用及调控机制。 【材料】 ApoE^-/-鼠;核酸提取试剂盒;细胞培养系统;限制性内切酶; DNA甲基化试剂盒;PCR试剂盒;PCR仪;高速冷冻离心机;恒温摇床紫外凝胶成像系统;琼脂糖电泳系统等。 【可行性】 本课题经导师组老师仔细论证并完成了一部分实验,证实研究方案具有较高的可行性;本课题依托我校心脑血管疾病实验室,该室主要从事表观遗传学修饰在Hcy致AS作用机制研究,研究经验丰富,实验技术成熟稳定,具备本课题所需的平台和设备;课题组成员作为生物技术班的学生,已在实验室工作了一年时间,为本课题的顺利实施提供保障。 【创新性】 首次揭示以"Hcy经PRMTs调控E2F1精氨酸甲基化修饰致ECs凋亡和VSMCs增殖中的潜在差异"为核心的基因表达调控通路。     

TGF-α对角膜内皮细胞的保护作用及机理研究

【立论依据】 成人角膜内皮细胞缺乏增殖能力,损伤后只能由邻近细胞的扩大移行来填补缺损区,当损伤至一定程度时,可导致视力下降直至失明。经本课题组研究首次发现TGF-α既可促进角膜内皮细胞增殖,又可维持其正常功能,提示TGF-α可用于角膜内皮损伤类疾病的治疗。 【设计思路】 阐明TGF-α角膜内皮保护作用的机制,并以此为基础治疗角膜内皮损伤类疾病。 【实验内容】 (1) TGF-α角膜内皮保护作用的机制研究:以原代培养的大鼠角膜内皮细胞制造划痕损伤模型,通过蛋白质印迹实验、免疫荧光染色、实时定量PCR、流式细胞术等方法,①检测TGF-α受体EGFR表达量及其循环途径的改变;②检测其与EGFR结合后下游信号通路的激活;③检测角膜内皮细胞周期时相及相关周期蛋白的变化。(2)TGF-α角膜内皮保护剂体内疗效评价:以超声乳化机建立角膜内皮细胞损伤动物模型,通过不同剂型、剂量的TGF-α进行给药处理,①使用裂隙灯、共聚焦显微镜及内皮细胞计数仪等评估角膜内皮细胞的形态、数量及功能;②以形态学及免疫组化方法检测角膜内皮细胞增殖及功能特异性蛋白表达状况;③以基因芯片的方法检测TGF-α对受损角膜内皮细胞基因表达谱的改变及影响。 【可行性】 (1)理论可行性:本项目指导教师和导师组老师是长期从事眼科研究的资深教授,且本项目已进行部分实验,论据充分。(2)技术保障:本课题技术路线合理成熟,相关手段课题组成员在都已熟练掌握并灵活应用。(3)实验设备保障:项目依托单位为厦门大学眼科研究所,是福建省重点研究室,拥有一批先进的实验设备及相关技师可辅助本课题开展。 【创新性】 (1)本研究首次发现TGF-α可促进角膜内皮细胞增殖,且维持其功能,其作用及机制的研究将有利于深入了解角膜内皮细胞的再生,并可能获得理论上的突破。(2)有关角膜内皮细胞保护剂的研发尚属空白,国内外均未见报导,本课题将提供新的治疗角膜内皮细胞损伤的途径及药物。     

补阳还五汤对高血压前期大鼠T淋巴细胞亚群的影响

[目的]通过观察补阳还五汤对高盐所致高血压前期大鼠T淋巴细胞亚群比例及γ-干扰素（INF-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的影响,探讨补阳还五汤在调节高血压前期T细胞免疫中的作用机制。[方法]选取7周龄盐敏感大鼠（DS）与盐抵抗大鼠（SS）各20只,SS大鼠随机分为正常组和正常给药组,DS大鼠随机分为模型组和治疗组。各组大鼠适应性喂养后,改用高盐饲料喂养,同时监测大鼠尾动脉收缩压,待其血压值升高至120~139/80~89 mmHg （1 mmHg=0.133 kPa）这一范围时,确定为高血压前期大鼠模型,并以补阳还五汤灌胃治疗。治疗结束后大鼠腹主动脉取血,以流式细胞术检测全血中T淋巴细胞CD4⁺与CD8⁺的百分率,并计算CD4⁺/CD8⁺的比值。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）方法检测血清中INF-γ、TNF-α的含量。[结果]补阳还五汤可以下调CD4⁺T淋巴细胞及CD8⁺T淋巴细胞百分率,上调CD4⁺/CD8⁺的比值,降低TNF-α、INF-γ的含量。[结论]补阳还五汤可能是通过下调CD4⁺T淋巴细胞与CD8⁺T淋巴细胞的百分率以及INF-γ、TNF-α细胞因子的表达,改善高血压前期机体T细胞免疫功能及其炎症反应,延缓高血压前期的发展进程。     

虾青素对脊髓压迫性损伤脱髓鞘病变的治疗作用及其机制的研究

【立论依据】 在临床上,脊髓压迫性损伤(CSCI)十分常见,但目前尚缺乏有效的治疗方法。在CSCI过程中脊髓血液循环障碍,缺血使细胞内产生大量ROS,自由基同膜脂质不饱和脂肪酸作用致膜脂质过氧化,一方面导致内质网应激,激活内质网caspase12, caspase12在无Cyt-C的参与下激活下游的caspase9和caspase3,级联反应发生;另一方面内质网应激释放大量Ca²⁺,引起胞浆Ca²⁺超载,而大量Ca²⁺从胞浆进入线粒体导致其膜的结构及通透性改变,其结果是Cyt-C的过度释放,进而激活caspase9和caspase3,级联反应发生,引起少突胶质细胞凋亡。研究表明,CSCI中少突胶质细胞(OL)凋亡是诱发脱髓鞘病变的重要原因之一,而脱髓鞘病变是CSCI继发性损伤的重要病理改变之一。因此,如何抑制少突胶质细胞凋亡,是控制CSCI病情发展的关键。虾青素是目前发现的最强的天然抗氧化物质,具有强大的自由基清除和抗凋亡能力,但关于虾青素对CSCI脱髓鞘病变的影响尚未见报道。 【设计思路】 本实验通过自制脊髓压迫器,建立脊髓压迫性损伤大鼠模型,对虾青素抗OL凋亡及其机制进行研究。 【实验内容】 (1)建立CSCI大鼠模型,根据BBB评分法进行神经行为学评定。(2)LFB染色观察脱髓鞘病变,并用神经纤维髓鞘计数法计数。(3)分别利用TUNEL和化学发光法检测OL凋亡数量和自由基含量的变化。(4)利用荧光双标分别检测少突胶质细胞中Cyt-C、caspase-12和caspase-3的表达变化,利用Ca²⁺荧光剂测量细胞内游离Ca²⁺的浓度,激光共聚焦检测线粒体内Ca²⁺的浓度,在分子生物学层面上对CSCI中OL的凋亡机制以及虾青素的作用途径进行研究。 【材料】 雄性SD大鼠,脊髓压迫器,高纯度虾青素等。 【可行性】 (1)本课题组成功研制脊髓压迫器,并取得专利ZL:200520009289X;稳定性高,可靠性强。(2)LFB染色显示虾青素治疗组脱髓鞘病变显著低于CSCI组,初步证明虾青素可明显减轻CSCI后所导致的脱髓鞘病变。 【创新性】 (1)首次将虾青素应用于CSCI的研究和治疗,并取得初步成果;(2)对少突胶质细胞凋亡的内质网途径和线粒体途径进行研究,并把两条途径联系起来。     

大鼠大脑皮质星形胶质细胞α2A型肾上腺受体的表达研究

目的 验证大鼠大脑皮质星形胶质细胞中的α2A肾上腺素能受体（α2A-AR）的表达情况,并与α2B肾上腺素能受体（α2B-AR）、α2C肾上腺素能受体（α2C-AR）相比较。方法 获取目的基因α2A-AR、α2B-AR、α2C-AR的RNA反转录,与内参基因β-actin一起进行实时荧光定量PCR。重复6组,所得数据进行统计学分析并运用2^-△△Ct的方法进行计算。结果 大鼠大脑皮质星形胶质细胞中确实表达了α2A-AR,并且α2A-AR的相对表达量是α2B-AR的2^4.53倍,是α2C-AR的2^7.98倍。结论 α2A-AR可能为大鼠大脑皮质星形胶质细胞接受儿茶酚胺类神经递质调控的主要受体。     

尼古丁对血管内皮细胞自噬的影响

目的 初步探讨尼古丁对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endotheliel cell,HUVEC）自噬的影响。方法 采用蛋白免疫印迹（Western blot）技术分别检测尼古丁不同浓度（0、6×10^-8、6×10^-7、6×10^-6和6×10^-5mol/L）和不同时间（浓度为6×10^-6mol/L时,分别干预0、1.5、3、6和12h）作用后,人脐静脉内皮细胞中自噬标志性蛋白微管相关蛋白轻链3Ⅱ（LC3Ⅱ）蛋白表达水平的变化,以确定尼古丁的最佳刺激浓度和最佳刺激时间。依据尼古丁最佳条件将体外培养的HUVE细胞随机分组：对照组、尼古丁处理组,Western blot法检测LC3Ⅱ、多聚泛素结合蛋白p62/SQSTM1（p62）和溶酶体相关膜蛋白-2（LAMP-2）的蛋白表达,Annexin Ⅴ-FITC/PI双染流式细胞术（flow cytometry,FCM）检测细胞凋亡率。结果 体外实验显示,LC3Ⅱ蛋白表达呈浓度和时间依赖性,且尼古丁浓度为6×10^-6mol/L、时间为6h时,LC3Ⅱ蛋白表达最多（P<0.01）。与对照组相比,尼古丁处理组LC3Ⅱ、p62蛋白表达显著增加（P<0.05）,LAMP2蛋白表达减少（P<0.05）,细胞凋亡率升高（P<0.01）。结论 尼古丁可以引起自噬体与溶酶体融合障碍,使自噬降解异常,导致内皮细胞自噬功能紊乱,促进细胞凋亡。     

人工寒潮促发大鼠脑卒中发病前脑血管内皮细胞 粘附分子的变化

 【目的】 探讨人工寒潮促发大鼠脑卒中发病前脑血管内皮细胞粘附分子(CAM)的变化&#65377;【方法】 110只SD大鼠制成双肾双夹肾血管性高血压大鼠模型,分为寒潮和非寒潮两大组,再按血压水平各分为正常血压组&#65380;160 ~ 199&#65380;200 ~ 219和 ≥ 220 mmHg等4个亚组,寒潮箱处理3 d后(每亚组6只大鼠)取视交叉平面脑片,连续切片,每8张取1张切片作免疫组化检测血管内皮的VCAM-1&#65380;ICAM-1&#65380;P-选择素水平,视交叉平面剩余切片及其余脑片连续切片,HE染色,了解是否有卒中病灶&#65377;发生脑卒中者被剔出统计学分析&#65377; 【结果】 在 < 220 mmHg的各血压亚组,寒潮组各级脑血管的VCAM-1&#65380;ICAM-1&#65380;P-选择素的免疫组化阳性信号均比非寒潮组高;在 ≥ 220 mmHg血压亚组,寒潮组各级脑血管的上述指标的免疫组化阳性信号均比非寒潮组低;在非寒潮组,各级脑血管的三个指标的免疫组化阳性信号均随血压升高而升高;在寒潮组,各级脑血管的三个指标的免疫组化阳性信号也随血压升高而升高,然而在血压 ≥ 220 mmHg时转为降低&#65377; 【结论】 长期持续的高血压损害了脑血管内皮的调控功能,在寒潮等外因的诱导下易致脑卒中&#65377;     

大鼠脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养血脑屏障体外模型的建立

[目的]建立大鼠脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养血脑屏障体外模型。[方法]采用原代培养脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养方法建立血脑屏障体外模型。[结果]星形胶质细胞与脑微血管内皮细胞共培养可提高血脑屏障特异性酶——γ-谷胺酰胺转肽酶、碱性磷酸酶的表达,提高脑微血管内皮细胞跨细胞间电阻。[结论]成功建立脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养血脑屏障体外模型,而且较单层内皮细胞模型更接近在体状态。     

PQQ对鱼藤酮脑内注射PD模型大鼠的保护作用及机制研究

【目的】 本课题拟通过单侧前脑内侧束注射鱼藤酮(复合物I抑制剂)建立大鼠帕金森病(PD)模型,通过尾静脉注射给药后观察吡咯喹啉醌(PQQ)的保护作用及相关机制,为将其开发为防治PD的药物提供可靠的基础实验依据。 【方法】 建立大鼠鱼藤酮左侧MFB注射模型(坐标:前囟后2.8 mm,中线左旁开2.0 mm,硬膜下8.0 mm),注射12 μg,体积4 μL,速度0.5 μL/min,注射完毕后留针5 min,缓慢退针。鱼藤酮注射后第2天开始通过尾静脉注射给予不同剂量PQQ,在手术后8周通过阿扑吗啡(apomorphine)诱导的旋转实验等观察PQQ对PD模型鼠行为学指标的影响;通过TUNEL和尼氏染色分析大脑皮层和黑质纹状体部位细胞凋亡的情况;采用caspase酶活性分析测定酶活性,蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白的表达变化;分离胞质蛋白和线粒体蛋白,检测CytC和Smac的亚细胞定位改变以及线粒体呼吸链复合物活性;通过实时定量PCR检测Ndufs等基因的表达情况;通过流式细胞仪分析ROS的生成;提取不同脑区蛋白,测定GSH、SOD和MDA的含量;免疫组化观察DA、TH和VMAT的表达及定位;HPLC检测DA含量的变化。通过以上行为学指标、形态学分析、凋亡相关检测、线粒体功能测定、ROS水平检测以及神经递质合成和转运的研究,分析PQQ在PD模型大鼠体内的保护作用及相关机制。 【结果】 术后8周腹腔内注射APO可诱发PD模型大鼠以健侧后肢为支点向健侧旋转,PQQ给药能显著减少旋转次数,并减少中脑黑质多巴胺能神经元的丢失,抑制细胞凋亡的发生。PQQ能提高线粒体呼吸链复合物的活性和Ndufs的表达,增加抗氧化能力,促进TH和VMAT的表达,抑制DA在细胞内的重新分布。 【结论】 PQQ对鱼藤酮诱导的大鼠PD模型具有保护作用,作用可能与其保护线粒体功能、对抗氧化应激和促进DA的转运相关。     

基于1H核磁共振谱分析的自发性高血压大鼠尿液代谢特征

目的 采用¹H核磁共振谱分析结合偏最小二乘分析（PLS-DA）方法研究自发性高血压大鼠和Wistar大鼠尿液的成分谱差异,寻找可能的生物标记物。方法 选取自发性高血压大鼠和Wistar大鼠,连续4周收集尿液,以¹H-NMR分析两组大鼠的尿液成分,使用PLS-DA方法进行模式识别,通过OPLS-DA的相关系数寻找差异标记物。结果 PLS-DA方法处理高血压大鼠和Wistar大鼠的¹H-NMR谱数据显示,两组¹HNMR谱数据可以在得分图中明显区分,且代谢趋势在连续4周测定均非常稳定,说明自发性高血压大鼠有着特定的代谢模式,通过OPLS相关系数分析出体内部分氨基酸代谢产物和葡萄糖等能量代谢物质明显异于正常大鼠。结论 ¹H-NMR结合PLS-DA模式识别的代谢组学方法具有研究复杂条件下机体病理生理变化的优势,为了解高血压大鼠的代谢特征提供了科学依据.     

硫化氢抑制高血压中枢炎症的作用研究

【立论依据】 延髓头端腹外侧区(RVLM)、孤束核(NTS)和室旁核(PVN)是中枢调节交感活动的主要核团。研究提示,高血压患者的血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和血管紧张素受体1(AT1R)的含量明显上升,AngⅡ诱发的神经炎症使小胶质细胞激活,而小胶质细胞激活后分泌的炎症因子如肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-1(IL-1)和白介素-6(IL-6)能直接或间接地增强交感神经元兴奋性,引起血压升高。硫化氢(H₂S)作为一种新型气体信号分子具有广泛的生物学作用。外周的研究提示,H₂S降低血压的效应与舒张血管平滑肌有关,而H₂S的中枢血压调节作用与炎症有关,但具体的作用机制尚不清楚。因此,本课题总体研究目标是明确H₂S是否通过抑制AngⅡ诱发的中枢神经炎症而抑制高血压的交感亢进和降低血压。 【设计思路】 对原发性高血压大鼠(SHR)腹腔注射GYY4317(H₂S缓释剂),观察H₂S对交感活动和血压心率的影响。测定TNF-α、IL-1和IL-6的含量,明确心血管活动是否与抑制中枢炎症有关,并由细胞水平探究H₂S是否通过降低AT1R或AngⅡ抑制神经炎症。 【实验内容】 (1)观察H₂S对SHR的血压和交感活动影响:测定血压和心率及NE含量; 测定肾交感神经活动。(2)观察H₂S对SHR的神经炎症的效应:测定RVLM、PVN和NTS的炎症因子含量。(3)通过小胶质细胞明确H₂S抗炎机制:检测AngⅡ和AT1R的状态及水平;检测P38/MAPK的水平。 【材料】 SHR大鼠; WKY大鼠; 小胶质细胞;GYY4317等药品。 【可行性】 (1)课题组两人于2012年开展实验,已掌握PCR和整体实验等技术,具备完成课题能力。(2)第二军医大学生理教研室具有实验所需的设备,可保证实验的顺利实施。(3)王伟忠教授长期从事心血管活动中枢调控机制研究,可给与理论和技术的指导。 【创新性】 (1)本课题从神经炎症和中枢Ras系统参与高血压交感亢进出发,首次探索H₂S通过中枢Ras系统对神经炎症的影响机制,明确其在改善高血压交感亢进的意义。(2)H₂S作为一种新型的气体信号分子,表现出明显抗炎和降压效应,但具体作用通路,特别是中枢降压途径尚未明确,本课题着眼于H₂S在慢性动物实验、急性动物实验和细胞实验的抗炎机制,探索H₂S对血压调控的作用途径。     

PINK1低表达诱导线粒体自噬障碍致糖尿病缺血心肌易损及机制

【立论依据】 糖尿病患者发生缺血性心脏病(IHD)后心肌损伤程度明显高于非糖尿病患者,但其具体机制尚待阐明。线粒体自噬是细胞通过自噬机制选择性清除线粒体的过程,对于维持线粒体功能和细胞生存至关重要。新近研究表明,线粒体激酶PINK1可通过线粒体融合蛋白Mfn2募集并结合E3泛素连接酶Parkin,介导线粒体自噬。然而,PINK1在糖尿病心肌中的表达变化及其介导的Mfn2-Parkin通路在心肌缺血损伤中的作用尚不清楚。 【设计思路】 本课题拟在整体和细胞水平研究PINK1在糖尿病心肌中是否低表达、并引发线粒体自噬障碍,进而增加糖尿病缺血心肌易损性。 【实验内容】 (1)高脂饲料(45%脂肪含量)喂养C57BL/6小鼠16周,建立2型糖尿病(T2DM)小鼠模型。(2)在对照和T2DM小鼠构建心肌缺血(MI)模型,观察缺血心肌损伤、心肌PINK1-Mfn2-Parkin信号变化、线粒体自噬及线粒体功能。(3)分离乳鼠心肌细胞,高糖/高脂培养,利用腺病毒转染过表达PINK1或RNAi技术剔除PINK1表达,研究PINK1介导的线粒体自噬与心肌细胞缺氧损伤的关系。 【材料】 C57BL/6小鼠,SD乳鼠,线粒体膜电位测试盒,TUNEL凋亡检测试剂盒,蛋白质印迹、RNA干扰、腺病毒转染所需试剂等。 【可行性】 我们成功制备了T2DM小鼠模型;预实验结果提示,与对照组相比,T2DM小鼠心肌PINK1表达减少,且MI后心肌线粒体自噬水平显著降低,心肌缺血损伤加重(P<0.05)。过表达PINK1可有效增加高糖/高脂培养心肌细胞的线粒体自噬,减少缺氧心肌细胞凋亡(P<0.05)。以上结果强烈提示,PINK1的低表达通过影响线粒体自噬加重糖尿病心肌易损性的假设是可行的。本课题涉及的实验方法在前期研究中已熟练运用,为顺利完成奠定了基础;且实验室具备所需实验条件,所有实验试剂均可在国内购得。 【创新性】 PINK1-Mfn2-Parkin介导的线粒体自噬对于糖尿病心肌易损性的作用未见报道。预实验结果证实,PINK1低表达诱导线粒体自噬障碍致糖尿病缺血心肌易损性增加,增加心肌PINK1表达可显著改善糖尿病心肌抗缺血损伤的能力。如能彻底阐明该问题,可为减轻糖尿病IHD患者的心肌损伤提供全新的干预靶点和实验依据。     

三七皂苷Fc对高糖损伤血管内皮细胞保护作用

目的 探讨三七皂苷Fc对体外高糖诱导大鼠血管内皮细胞损伤的保护作用。方法 体外培养大鼠血管内皮细胞（RAOEC）,加入30mmol/L D-葡萄糖造成细胞损伤。加入不同浓度三七皂苷Fc进行干预,采用CCK-8法测定细胞活性,筛选出最适用药浓度。将细胞均匀接种于6孔板内,分为4组,即正常对照组、高糖组、正常对照+Fc组、高糖+Fc组,用Hochest33342荧光染色法对各实验组进行细胞凋亡的检测;采用细胞划痕实验检测各组细胞的伤口修复情况;采用Western blot法观察各组过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）的蛋白表达。结果 高糖+Fc组内皮细胞凋亡率明显低于高糖组,而修复率却明显高于高糖组,差异均有统计学意义（P<0.05）;高糖+Fc组PPAR-γ蛋白表达量明显高于高糖组,差异有统计学意义（P<0.05）。结论 三七皂苷Fc可抑制高糖引起的血管内皮细胞凋亡,并促进高糖状态下血管内皮细胞的增殖修复。其作用机制可能与三七皂苷Fc促进高糖状态下血管内皮细胞的PPAR-γ蛋白表达有关。     

组织激肽释放酶1改善大鼠心脏缺血/再灌注损伤后线粒体功能障碍

目的 探讨组织激肽释放酶1（KLK1）对心脏缺血/再灌注损伤大鼠线粒体功能的影响及其机制。方法 通过KLK1重组腺病毒感染实现大鼠心脏KLK1过表达,然后采用冠状动脉左前降支结扎和再灌注的方法建立大鼠心脏缺血/再灌注损伤模型,检测梗死区面积和心脏缺血危险区细胞凋亡情况;分离大鼠心脏缺血危险区心肌组织线粒体,检测线粒体功能（线粒体过氧化物生成量、线粒体膜电位、线粒体ATP生成量）。分离新生大鼠心肌细胞,通过KLK1重组腺病毒感染实现KLK1过表达,然后建立心肌细胞缺氧/复氧损伤模型,对心肌细胞缺氧/复氧损伤模型应用缓激肽1型受体（B1R）阻断剂R715或缓激肽2型受体（B2R）阻断剂HOE140处理,利用MTT法检测细胞活力,并观察线粒体功能的变化。结果 在大鼠心脏缺血/再灌注损伤模型中,KLK1过表达能减轻心肌缺血/再灌注损伤,使心肌梗死区面积减小、缺血危险区细胞凋亡减少（P均<0.01）;改善心脏缺血/再灌注损伤后线粒体功能障碍,降低过氧化物生成量、增加线粒体膜电位和线粒体ATP生成量（P均<0.01）。在离体大鼠心肌细胞缺氧/复氧模型中,KLK1过表达能减轻心肌细胞损伤（P<0.05）、改善线粒体功能障碍（P<0.05,P<0.01）,并且其作用可被B2R阻断剂HOE140抑制。结论 KLK1能改善心脏缺血/再灌注损伤后线粒体功能障碍,这可能是其具有心脏保护作用的重要机制。     

凋亡抑制蛋白ILP-2对乳腺癌细胞MCF-7氧化应激损伤的保护作用

【立论依据】 文献表明氧化应激会损伤体内核酸等生物大分子物质而促进肿瘤的发生发展;凋亡抑制蛋白ILP-2在生长中的乳腺癌有高表达,由此,我们猜想乳腺癌中高表达的ILP-2可能与氧化应激的损伤作用存在联系 【设计思路】 实验以乳腺癌细胞株MCF-7制备氧化应激的细胞模型,研究氧化应激状态下MCF-7内ILP-2的表达情况;RNAi ilp-2基因表达,分析ILP-2与氧化应激损伤之间的关系 【实验内容】 利用H2O2对乳腺癌细胞株MCF-7进行氧化应激造模,流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测细胞内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS),分光光度法检测丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)水平;通过瞬时转染敲低MCF-7 ilp-2表达,利用RT-PCR和蛋白质印迹法检测基因和蛋白质表达情况;干扰细胞ilp-2表达并同时进行氧化应激处理,通过MTT、Scratch、FCM等方法检测细胞的存活状态 【材料】 乳腺癌细胞株MCF-7,H2O2,转染试剂,RNeasy Mini Kit,QuantiFast Probe Assay,RIPA 裂解液,一抗,二抗,ROS试剂盒,GSH试剂盒,MDA试剂盒,MTT试剂盒等。 【可行性】 该研究内容所需技术在生物分子研究领域已经非常成熟,所需设备完善,可操作性强 【创新性】 首次研究ILP-2促癌细胞生长作用与氧化应激损伤之间的关系,为进一步阐明ILP-2的作用机制奠定基础。