羧甲基壳聚糖钙与骨髓基质细胞生物相容性的初步实验

目的  通过体外小鼠骨髓基质细胞培养,从细胞形态和细胞增殖方面评价新型生物材料羧甲基壳聚糖钙的细胞生物相容性。方法  合成羧甲基壳聚糖钙,进行红外光谱分析,并用DMEM制备浸提液。分别用含羧甲基壳聚糖钙浸提成分的培养液 (实验组)、DMEM 培养液(阴性对照组)和含6.4g／L苯酚培养液 (阳性对照组)培养骨髓基质细胞,通过倒置相差显微镜观察和MTT比色法评价细胞生长及增殖情况。结果  红外光谱分析提示,羧甲基壳聚糖与钙离子发生了络合反应。镜下观察,细胞培养1、2、3d,实验组与阴性对照组细胞数量明显增加,细胞形态正常;阳性对照组细胞数量明显减少,细胞固缩甚至崩解。MTT比色法,实验组与阴性对照组吸光度(A)值间无统计学差异(P>0.05),实验组各时间点的毒性分级为0级;阳性对照组A值明显低于其他组(P<0.01),毒性分级为4级。结论  羧甲基壳聚糖钙复合材料对小鼠骨髓基质细胞有良好细胞生物相容性,是一种可用于组织工程的新型生物材料。     

狗牙周膜细胞与壳聚糖-磷酸三钙三维培养的实验研究

目的：建立狗牙周膜细胞（PDLCs）体外三维立体培养模型,探讨以狗PDLCs为种子细胞,以壳聚糖-磷酸三钙复合体为支架材料应用于牙周组织工程的可行性。方法：冷冻干燥法制备壳聚糖-磷酸三钙多孔复合支架材料,组织块法培养狗牙周膜细胞,取第4代细胞传代扩增后接种到三维支架上,体外继续培养。免疫组化方法鉴定细胞起源;MTT法检测支架对狗PDLCs增殖的影响;取培养3、6?d的细胞-支架复合物的标本,用倒置相差显微镜和扫描电镜观察细胞的形态及在支架上的粘附、生长情况。结果：免疫组化显示,狗PDLCs抗波形丝蛋白阳性,抗角蛋白阴性,证实为中胚层来源。MTT法检测结果显示,支架材料对狗PDLCs的生长、增殖与空白对照组相比差异均无统计学意义(P＞0．05)。扫描电镜示壳聚糖-磷酸三钙复合体具有良好的多孔网状结构,狗PDLCs在支架上贴附牢固,伸展充分,增殖旺盛并分泌大量的细胞外基质。结论：壳聚糖-磷酸三钙具有良好的粘附性和细胞相容性,狗PDLCs与之复合培养生长良好,表明以自体PDLCs为种子细胞、以壳聚糖-磷酸三钙为支架材料进行的牙周组织工程是可行的。     

丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石骨组织工程支架材料的体外细胞毒性评价

目的 探讨丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石生物支架与兔骨髓间充质干细胞的体外细胞毒性.方法 采用丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石构建的生物支架与兔骨髓间充质干细胞体外共培养,用材料的细胞毒性、细胞黏附率、细胞增殖活力指标以MTT法、倒置显微镜及电镜观察来评价.结果 细胞在支架材料上黏附、生长良好,分裂增殖活跃,细胞毒性检测CTG均为0级,实验组与时照组细胞黏附率比较无统计学差异（P＞0.05）,实验组与对照组细胞增殖活力随着时间增加,细胞在支架增殖速度增快.第1、3、5、7天实验组与对照组比较有统计学差异（P＜0.05）.扫描电镜观察发现细胞培养7天后生长良好,分裂正常,与支架材料黏附紧密.结论 支架材料对细胞无毒性,具有很好的细胞相容性.     

壳聚糖对转染hBMP2基因的NIH3T3细胞相容性研究

目的：研究壳聚糖对转染人骨形成蛋白2（BMP2）基因的NIH3T3细胞生物学行为的影响，评价该多聚糖对转基因细胞的相容性。方法：用阳离子聚合物试剂将pcDNA3．1-BMP2真核表达质粒转染NIH3T3细胞．G418筛选克隆．收集扩大培养后接种于2％壳聚糖膜表面，在倒置光学显微镜、扫描电镜的辅助下，观察细胞的黏附和生长情况。用MTT法检测增殖情况，并行碱性磷酸酶活性检测。结果：壳聚糖能够促进转基因细胞在其表面的黏附和形态保持，增殖指数增高（P〈0．05），碱性磷酸酶活性两组无显著差异（P〉0．05）。结论：壳聚糖具有良好的细胞相容性，能够促进转基因细胞的增殖。不影响细胞的成骨分化，可作为牙周组织工程的载体材料。     

兔脱钙骨基质材料复合骨髓间充质干细胞的体外培养

目的:制备兔脱钙骨基质材料,研究脱钙骨基质作为软骨组织工程支架材料的可行性。方法:参照Ursit方法制得兔脱钙骨基质材料,扫描电镜观察脱钙骨基质的结构,将兔骨髓基质干细胞与兔脱钙骨基质体外复合培养,第2、4、6、8、10、12天时行MTT法测定及扫描电镜观察。结果:兔脱钙骨基质支架材料外观均呈乳白色,SEM观察脱钙骨基质呈天然的高密度孔隙网架结构,平均孔隙率为(65.86±5.15)%;平均孔径大小为(124.82±42.79)μm;兔脱钙骨基质材料接种于骨髓基质干细胞后可见大量骨髓基质干细胞粘附,随培养时间延长,骨髓基质干细胞增殖明显,MTT法检测显示复合培养8d骨髓基质干细胞增殖达稳定状态。结论:兔脱钙骨基质支架材料具有天然孔隙网架结构,利于细胞的粘附生长,具有良好的生物相容性,是一种较好的软骨组织工程支架材料。     

BG/PHBV复合多孔支架材料与成骨细胞体外复合培养

目的用生物活性玻璃BG/聚羟基烷酸酯PHBV复合多孔支架材料与骨髓基质细胞来源的成骨细胞体外复合培养了解其生物相容性,为骨组织工程支架材料选择提供依据。方法:将体外培养的兔骨髓基质细胞诱导分化的成骨细胞,与BG/PHBV复合多孔支架材料体外复合培养,对复合体进行形态学、扫描电镜、细胞增长能力的测定,评价细胞与材料的相容性。结果:骨髓基质细胞有较强的向成骨细胞分化和繁殖能力成骨细胞与BG/PHBV复合多孔支架材料体外复合培养8d,分布于支架材料的成骨细胞迅速分化增殖,分泌细胞外基质并形成钙结节。结论:骨髓基质细胞是骨组织种子细胞的良好来源BG/PHBV复合多孔支架材料与成骨细胞具有良好的生物相容性,是构建组织工程骨的一种理想支架材料。     

新型纳米仿生骨植入材料的生物相容性的初步研究

【目的】研究新型纳米仿生骨植入材料的生物相容性。【方法】采用骨髓基质细胞体外培养技术,通过MTT法检测细胞相对增殖度,对材料的细胞毒性进行分级评价,并采用直接接触培养法,观察细胞在材料上的黏附与散布。【结果】材料的细胞毒性分级在0～1之间,骨髓基质细胞可紧密附着于材料表面,黏附生长,并有突起向材料的连通微孔内伸展。【结论】新型纳米仿生骨植入材料对骨髓基质细胞无毒性作用,符合医用生物材料的安全要求。     

新型纳米仿生骨植入材料的生物相容性的初步研究

  【目的】 研究新型纳米仿生骨植入材料的生物相容性? 【方法】 采用骨髓基质细胞体外培养技术,通过MTT法检测细胞相对增殖度,对材料的细胞毒性进行分级评价,并采用直接接触培养法,观察细胞在材料上的黏附与散布? 【结果】 材料的细胞毒性分级在0～1之间,骨髓基质细胞可紧密附着于材料表面,黏附生长,并有突起向材料的连通微孔内伸展?【结论】 新型纳米仿生骨植入材料对骨髓基质细胞无毒性作用,符合医用生物材料的安全要求?     

组织工程膀胱细胞外基质生物相容性的实验研究

目的 制备兔膀胱细胞外基质材料,检测其生物相容性,探讨其作为组织工程泌尿道修复重建支架材料的可行性.方法 联合应用渗透溶液法-酶消化法-去垢剂洗涤法制备兔膀胱细胞外基质,将体外培养的兔膀胱移行上皮细胞与其复合培养,观察细胞在材料表面的黏附、生长、增殖情况;MTT法检测材料浸提液对膀胱移行上皮细胞的细胞毒性;将材料植入兔背部皮下检测其组织相容性.结果 兔膀胱细胞外基质冻干后呈白色半透明薄膜状,扫描电镜观察材料一面呈纤维网状结构,另一面呈平坦致密结构,两面均无细胞残留.膀胱移行上皮细胞能够在材料表面正常黏附、生长、增殖,细胞形态良好.MTT法检测材料细胞毒性分级为0级或1级.皮下植入实验中动物无异常反应,材料能在体内逐渐降解并引导新生组织长入.结论 本研究制备的兔膀胱细胞外基质已完全除去组织中的细胞成份,同时保留了细胞外基质的纤维网状结构,具有良好的细胞相容性和组织相容性,可以作为组织工程泌尿道修复重建的支架材料.     

牙囊细胞与纳米晶羟基磷灰石/胶原复合材料体外相容性研究

目的 探讨大鼠牙囊细胞(DFCs)与纳米晶羟基磷灰石/胶原复合材料(nHAC)的相容性,为二者在牙周组织工程中的应用提供依据.方法 将大鼠DFCs与nHAC在体外复合培养,通过倒置显微镜、扫描电镜观察细胞与材料的复合情况,用MTT法、碱性磷酸酶活性检测法检测材料对细胞增殖分化的影响.结果 DFCs可以在nHAC材料表面及孔隙中良好的黏附、增殖和分化,复合培养5d后nHAC对DFCs的增殖分化表现出一定的促进作用.结论 DFCs与nHAC具有良好的生物相容性.     

心肌细胞培养方法和活细胞噻唑兰法测定

目的:介绍心肌细胞培养方法和研究比色分析法测定活心肌细胞.方法:接种不同数量细胞培养后行噻唑兰(MTT)比色分析;正常培养、含不同浓度维拉帕米培养的细胞行MTT代谢比色分析,并测乳酸脱氢酶(LDH)活性.结果:比色值与接种细胞数量、细胞释放的LDH活性呈高度相关(r=0.996、-0.986,P<0.01).结论:MTT比色分析法可用于测定活心肌细胞.     

种植合金CPTi和Ti-6Al-4V对内皮细胞增殖的影响及在细胞培养液中腐蚀情况分析

 目的 MTT法体外评价CPTi和Ti-6Al-4V牙科种植体材料对人脐静脉血管内皮细胞（HU）增殖的影响,并检测这两种材料在细胞培养液中的腐蚀情况。方法 将HU细胞以2×104/mL密度接种于CPTi和Ti-6Al-4V金属表面,电镜观察细胞接种初期的形态,3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）法检测细胞接种后4 h、1 d、2 d、3 d、7 d、10 d和14 d所测的OD值,X射线光电子能谱分析（XPS）法分析2种金属在细胞培养液浸泡前后的表面层组元。结果 采用SPSS13.0软件分析,细胞接种后4 h、1 d、2 d、3 d、7 d、10 d和14 d所测的OD值表明2种材料没有统计学差异（P<0.05 ）; 接种后6 h电镜下可以观察到细胞在CPTi和Ti-6Al-4V表面的形态基本类似,没有明显的形态和数量差别出现;XPS结果显示2种合金表面都有不同厚度的钝化膜形成,CPTi表面的钝化膜要比Ti-6Al-4V的厚一些。结论 CPTi和Ti-6Al-4V对HU细胞的增殖没有影响,在培养基中也没有发生腐蚀。     

软骨脱细胞基质多孔支架与骨髓基质干细胞体外构建组织工程软骨的研究

目的 探讨关节软骨脱细胞基质多孔支架(CEDIS)与骨髓基质干细胞(BMSCs)体外培养组织工程软骨的可行性.方法 粉碎人关节软骨,脱细胞处理后差速离心法收集细胞外基质悬液,采用冷冻干燥技术制备三维多孔支架.扫描电镜观察其微观结构,并进行组织学观察,生化成分定量检测其胶原、氨基葡聚糖(GAG)、DNA含量,牛物力学方法测量其干性及覆水状态下压缩弹性模量;分离培养犬骨髓基质干细胞,TGF-β1成软骨诱导,PKH26标记,接种到支架上体外继续诱导培养,荧光显微镜及扫描电镜观察培养3 d后细胞在支架内的黏附、分布情况.结果 制备的CEDPS支架无细胞碎片残留,软骨细胞外基质特异性染色阳性,具有相互贯通的三维孔隙结构;支架生化成分定量检测:总胶原含量为(708.2±44.7)μg/mg,GAG含量为(254.7±25.9)μg/mg,DNA含量为(0.021±0.007)μg/mg;支架纵向压缩弹性模量E=(1.226 ±0.288)MPa,覆水后压缩弹性模量E=(0.052±0.007)MPa.荧光显微镜、电镜检查结果表明细胞广泛均匀的分布在支架内部,呈圆形或椭圆形,在支架上增殖显著,细胞基质分泌明显.结论 CEDPS支架在生化组成和结构上与软骨细胞外基质成分类似,去细胞彻底,具有良好生物力学特性,是一种较为理想的软骨组织工程支架载体;成软骨诱导的BMSCs与CEDPS支架在体外可初步构建类软骨样组织.

Abstract：

Objective To develop a novel cartilage ECM-derived porous scaffold(cEDPs)and investigate the attachment,proliferation and distribution of bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs) cultured in vitro within the scaffolds.Methods Cartilage microfilaments were prepared after pulverization and gradient centrifugation and prepared into suspension after acellularization treatment.The scaffolds were examined by histological staining,scanning electron microscope(SEM),biochemical and biomechanical analysis.After labeling with PKH26,the canine BMSCs were seeded onto the scaffolds.The attachment,proliferation and differentiafion of cells were observed by inveaed fluorescent microscope and SEM.Results On histology,most extracellular matrices were retained in the scaffold after the removal of cell fragments.Safranin O staining and immunfluorescence examination with collagen Ⅱ antibodies provided positive results.Biochemical analysis showed that the collagen content was(708.2 4±44.7)μg/mg,glycosaminoglycan(254.7 ±25.9)μg/mg and DNA(0.021±0.007)μg/mg.Mechanical testing showed the compression moduli(E)were(1.226±0.288)and(0.052±0.007)MPa ander dry and wet conditions respectively.Inverted fluorescent microscope and SEM showed moderate cell adhesion.chondrocyte-like morphology and matrix synthesis around cells. Conclusion The CEDPS retains most extracellular matrices after a thorough decellularization so as to possess an excellent microstructure with ideal biomechanical characteristics and a good biocompatibility. Thus it is a suitable candidate as an alternative cell-carrier for cartilage tissue engineering. Chondrogenic BMSCs and CEDPS may be used to construct cartilage-like tissue in vitro.     

猪脱细胞主动脉瓣叶不同方法预处理后种植内皮细胞的比较研究

目的:猪脱细胞主动脉瓣叶经不同的方法预处理后,种植新生牛主动脉内皮细胞(BAECs),观察细胞的增殖状态。方法:猪脱细胞主动脉瓣叶分别经纤维连接蛋白(Fn,50 μg/ml)预铺、胎牛血清(FCS)浸泡、无血清DMEM浸泡预处理12 h,采用间隔24 h、3次种植的方法种植 BAECs,于种植后第4天、第7天进行细胞计数,并行MTT法和~3H-TdR掺入量检测比较细胞的增殖状态。同时于第7天取瓣叶进行组织学检测,观察瓣叶表面内皮细胞覆盖情况。结果:种植后第4天和第7天,采用Fn预铺、FCS浸泡预处理的脱细胞瓣叶,其细胞计数、MTT的光密度和~3H-TdR掺入值明显高于无血清DMEM预处理组(P<0.01)。瓣叶经H-E染色,可见Fn预铺、FCS浸泡预处理组内皮细胞的覆盖情况优于无血清DMEM浸泡组。结论:Fn或FCS预处理能明显增加内皮细胞在脱细胞瓣叶表面的黏附和增殖,有利于组织工程心脏瓣膜的体外构建。     

地塞米松对体外培养人牙周膜成纤维细胞增殖的影响

目的：研究地塞米松（DEX）对体外培养人牙周膜成纤维（PDLF）细胞增殖的影响,寻找体外培养人PDLF(hPDLF)细胞的优化条件,为牙周组织再生的研究工作奠定基础。方法：体外分离培养的hPDLF细胞随机分为5组,分别用5种含10%胎牛血清的DMEM细胞培养基培养5～8代:①空白对照组（无DEX）;②含5 mg•L^-1DEX;③含10 mg•L^-1 DEX;④含20 mg•L^-1 DEX;⑤含50 mg•L^-1 DEX。以MTT法测定DEX对hPDLF细胞增殖率的影响;采用倒置相差显微镜观察hPDLF细胞在添加不同浓度DEX的胎牛血清培养基中培养后的细胞形态学改变。结果：将hPDLF细胞接种于24孔板后的第3天,细胞出现汇合现象。细胞在孔底呈鳞片状。采用DEX条件DMEM细胞培养液培养,可见 细胞逐渐变成多层,细胞形态变小,突起变钝。MTT法检测结果表明含不同浓度DEX的DMEM培养基中培养的hPDLF细胞数均高于对照组（P<0.05）;不同浓度的DEX对hPDLF细胞增殖均有影响(P<0.05）,且随着浓度增加,hPDLF细胞增殖能力逐渐增高。结论：DEX能使体外培养的hPDLF细胞表现很强的增殖活性。     

牙周病患牙根面的不同处理对牙周膜成纤维细胞生长的影响

目的:研究牙周病患牙累及的牙根面经EDTA脱矿和富血小板血浆(PRP)单独及联合处理后对人牙周膜成纤维细胞附着、增殖的影响。方法:以因牙周病不能保留而拔除的患牙制备的牙根片为对照组,PRP和EDTA脱矿单独及联合处理患牙根片为实验组,用细胞计数法及四甲基偶氮唑盐(MTT)比色实验分析人牙周膜成纤维细胞在病变根面上的附着和增殖。结果:未处理组的根片上有少量的细胞附着;根片经PRP或EDTA脱矿单独处理能明显增加细胞的附着(P<0.05);二者联合处理促附着效果明显增强(P<0.01)。未处理组根片上生长的细胞随时间延长数量反而下降;经PRP或EDTA单独处理的根片上的细胞有少量的增殖(P>0.05);二者联合处理细胞增殖明显(P<0.05)。结论:EDTA根面脱矿和PRP能有效促进人牙周膜成纤维细胞在牙周病患牙根面上的附着和增殖。     

牙龈卟啉单胞菌脂多糖对牙周韧带细胞在牙骨质片附着和增殖的影响

目的 研究牙骨质片经不同浓度牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Pg-LPS)处理后对牙周韧带细胞(PDLC)附着和增殖的影响.方法 用含不同浓度(0,1,10)μg/mL的Pg-LPS培养液培养PDLC于牙骨质片,24、72 h后用MTT法检测PDLC在牙骨质片上的附着、增殖的细胞数量,同时行扫描电镜观察.结果 高浓度10 μg/...     

西兰花多肽对C6胶质瘤细胞的诱导凋亡作用

目的：研究西兰花多肽对大鼠C6胶质瘤细胞生长的影响,初步探讨西兰花多肽对肿瘤细胞的诱导凋亡作用。方法：提取、分离及纯化西兰花多肽;培养大鼠C6胶质瘤细胞,用不同剂量（0、0.01、0.10、1.00和10.00 mg•L^-1）西兰花多肽作用24 、48和72 h后,应用倒置显微镜观察细胞凋亡情况,MTT方法检测药物作用后细胞的生长情况。结果：西兰花粗多肽有4个主要洗脱峰,其中第2峰收集液多肽（组分Ⅱ）含量最高,用于后续活性研究。西兰花多肽作用大鼠C6胶质瘤细胞后,倒置显微镜下观察到明显的凋亡小体,尤其以西兰花多肽10.00 mg•L^-1组最为明显。MTT结果,药物作用48 h时,西兰花多肽10 mg•L^-1组细胞增殖活性（0.127±0.011）明显降低,与对照组（0.501±0.035）比较差异有统计学意义（P<0.01）。药物作用72 h时,西兰花多肽各剂量组均表现为对细胞的抑制作用,与对照组（0.753±0.022）比较,细胞增殖活性西兰花多肽1.00 mg•L-1组（0.583±0.082）和10.00 mg•L^-1组（0.073±0.001）明显降低（P<0.01）。结论：西兰花多肽可诱导C6胶质瘤细胞发生凋亡反应,并且随着药物剂量升高和作用时间延长,凋亡效应增强,提示西兰花多肽具有良好的诱导肿瘤细胞凋亡的作用。     

Egr-1通过上调NDRG1诱导骨髓间充质干细胞成骨分化

目的 探究早期生长因子1(Egr-1)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖和成骨分化的影响.方法 采集成年男性骨髓组织,分离培养原代BMSCs并在显微镜下观察其形态,流式细胞术鉴定BMSCs表面标志物;pcDNA3.1/Egr-1转染BM-SCs,MTT检测BMSCs的增殖,茜素红钙染色试剂盒检测细胞基质内钙结节的形成,ALP活性测定试剂盒检测细胞内ALP的活性,实时定量qPCR和Western blot分别检测细胞内EgR-1、Runx2、NDRG1 mRNA和蛋白表达;Egr-1 siRNA转染BMSCs,检测细胞内ALP活性、Egr1、Runx2和NDRG1 mRNA及蛋白表达.结果 离体培养的BMSCs高表达CD90和CD29,而CD34和CD45呈阴性表达;pcDNA3.1/Egr-1转染对BMSCs增殖无明显作用,却能促进细胞基质内钙结节的形成,上调ALP活性和Egr-1、Runx2、NDRG1的表达,而Egr-1 siRNA则作用相反.结论 Egr-1通过上调NDRG1诱导BMSCs的成骨分化.