人Endostatin在毕赤酵母菌中的表达及其抑癌活性研究

目的：在毕赤酵母中获得有活性的分泌型重组Endostatin。方法：一步法抽提胎肝总RNA,RT－PCR扩增endostatin全基因,用T－A克隆技术的构建克隆载体;双酶切回收550bp的endostatin基因,亚克隆入酵母表达载体。重组质粒分别以PCR,酶切及测序鉴定。电转化法将线形化的重组表达DNA转导入GS115感受态细胞,SDS－PAGE电泳筛选阳性重组子,G25及Heprin亲和层析柱初步纯化重组蛋白,MRR法测定重组endosatatin对血管内皮细胞增殖的抑制作用。结果：RT－PCR获得550bp的特异扩增条带,T－A克隆后,PCR挑选阳性重组子,测序证实序列正确。亚克隆后的表达载体,PCR可得550bp的特异条带,EcoRI,Not I双酶切获得550bp和3kb的条带,与预期一致,DNA测序证明核苷酸序列100％的正确,SDS－PAGE证实重组菌较空白有一明显条带,Heparin亲和层析后,1mol/L NacL洗脱的蛋白峰大体外可转异性抑制血管内皮细胞的增殖。结论：在毕赤酵母菌中成功地获得了分泌表达的活性endostatin蛋白。     

蜜蜂毒中蜂毒素的分离纯化方法及含量测定

目的：从蜜蜂毒中分离纯化蜂毒素（melittin),建立以SDS-聚丙烯酰 胺凝胶电泳(SDS－PAGE）及HPLC进行蜂毒素定性定量分析的方法。方法：用Sephadex G-25、Sephadex G-50、Sephadex G-75三步层析法从蜜蜂毒中分离纯化蜂毒素,以SDS－PAGE定性,以HPLC进行含量测定。结果：样品经SDS－PAGE测定为单一条带,相对分子质量约3000。HPLC含量测定,平均回收率为95．97％,相对标准差（RSD）为1．07％。结论：以上述分离纯化法可制得高纯度的蜂毒素,检测方法准确、可靠、简单。     

重组大鼠TSHα亚基在大肠杆菌中表达的实验研究

目的：通过构建重组大鼠TSHα链原核表达系统及表达产物的纯化工作,获得重组GST-—rrTSHα融合蛋白,以备作为免疫原制备抗大鼠TSHα链的抗体。方法：提取大鼠垂体组织总RNA,RT—PCR扩增大鼠TSHa链编码序列,构建pGEX-3X／TSHα融合表达质粒转化人大肠杆菌中进行诱导表达。亲和层析纯化重组蛋白并以SDS—PAGE及Western Blot进行鉴定。结果：DNA序列分析表明重组pGEX-3X／TSHα质粒含有读码框正确的髑H仅链编码序列,纯化产物的SDS—PAGE及Western Blot结果表明所获得的目的蛋白与预期分子量相符且可与抗GST抗体发生免疫识别。结论：成功获得重组GST—rrTSHα融合蛋白,为下一步的抗体制备奠定了基础。     

安徽省3种常见蜚蠊的可溶性蛋白质组成分析

目的 应用十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）对安徽省3种常见蜚蠊的可溶性蛋白质区带进行测定,为蜚蠊分类提供科学依据。方法 应用冻融匀浆法制备3种蜚蠊的可溶性蛋白液,进行SDS－PAGE,用考马斯亮蓝G－250染色后,观察、计算各蛋白质区带的分子量。结果 黑胸大蠊的蛋白条带数目♂为29条,♀为31条;美洲大蠊的蛋白条带数目♂为28条,♀为30条;德国小蠊的蛋白条带数目♂为25条,♀为28条。通过比较发现3种蜚蠊的蛋白质区带数目和位置有差别;德国小蠊主要蛋白质区带的益与两种大蠊相差明显,♀♂之间也有差别。结论SDS－PAGE可作为蜚蠊分类的手段之一。     

人胎脑和SD大鼠脑中β—NGF的提取

目的 研究拟获得快速高效的β－NFG（β－神经生长因子）纯化方法,并为其生物特征研究和临床应用奠定基础。方法 通过低温高速离子、离子交换层析、透析等过程,从人胎脑和SD大鼠脑中分离纯化β－NGF,用SDS－PAGE分析其分子量和纯度,并经PC12细胞突起生长试验鉴定其生物学活性。结果 从人胎脑和SD大鼠脑中分离纯化得到的β－NGF提取物在SDS－PAGE图上均呈单一条带,它们都能很好地促进PC12细胞长出突起,且人胎脑β－NGF提取物促进PC12细胞长出突起的能力和人重组β－NGF差别无显著性。结论 实验获得了纯度高且生物活性良好的β－NGF。在分离纯化的其他参数不变时,分离纯化过程的总时间和温度对β－NGF的得率和生物学活性有明显影响。     

酸枣仁与缅枣仁的蛋白质分析

目的：初步探讨酸枣仁与缅枣仁的蛋白质差异。方法：用凯氏定氮法测定蛋白质的含量；用酸水解法测定蛋白质的氨基酸组成；用十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）和毛细管区带电泳（CZE）分析蛋白质的组分。结果：酸枣仁与缅枣仁的蛋白质含量分别为36．13％和41．58％；除缅枣仁蛋白质的缬氨酸和蛋氨酸明显高于酸枣仁外，蛋白质的其他氨基酸的组成差别不明显；SDS－PAGE图谱明显不同的是，酸枣仁有相对分子质量为39800的蛋白质，缅枣仁为50100的蛋白质；CZE图谱的区别是，酸枣仁为3．1min的峰，缅枣仁含有一个迁移时间为4．8min的峰。结论：缅枣仁的蛋白质含量较酸枣仁略高，且缬氨酸和蛋氨酸的含量明显高于酸枣仁。两种枣仁的SDS－PAGE和CAE图谱均有明显的差异存在。     

抗癌胚抗原单抗与生物素及链霉亲和素偶联物的制备及性能鉴定

目的 研究抗癌胚抗原（CEA）单抗与生物素及链霉亲和素（streptavidin,SA)偶联物的制备方法。方法 将CEA单抗按抗体与生物素活化酯物质的量之比为1：15－1：50进行生物素化。抗CEA单抗与SA的偶联采用3－（2－吡啶二巯基丙酸）－N－琥珀酰亚胺酯（SPDP）化学偶联法制备。抗CEA单抗偶联物的生物活性及免疫活性分别采用间接ELISA方法和放射免疫分析法进行测定。结果 生物素化单抗每分子抗体中约偶联3分子生物素,具有良好的SAI结合活性,经SDS－PAGE电泳证实为单一蛋白条带,仍保留95％的免疫活性。SA每分子中含有1－2个疏基,而抗CEA单抗每分子中含有2－3个3－（2－吡啶二基丙酸）－N－琥珀酰亚胺酯间接ELISA方法证实偶联物具有良好的生物素结合活性,SDS－PAGE电泳显示单抗－SA偶联物相对分子质量为210000左右,仍保留着原单抗活性的70％左右。结论 所制备的两类抗CEA单抗偶联物基本保持完整的特异性结合肿瘤CEA的性质,可为进一步的预定位显像和治疗应用提供可靠的靶向载体。     

BMP-4cDNA的克隆表达及活性的初步测定

目的：利用原核基因工程生产有诱骨活性的骨形态发生蛋白－4（BMP－4），方法：应用RT－PCR技术，从成熟人的胎盘组织中扩增出长0．34Kb编码入骨形态发生蛋白－4成熟肽的基因序列，经测序证实后，装入表达载体pET-22b，诱导表达后SDS－PAGE显示在14kd处有一明显的表达条带，经初步鉴定，证实表达蛋白部分位于裂菌处理后的上清中，部分以包涵体的形式存在于沉淀中，将沉淀中的包涵体蛋白纯化，变性和复性处理，和上清中的蛋白分别经真空冷冻干燥后，植入小鼠的肌肉内检测蛋白活性。结论：第14d和21d，组织切片可见骨细胞和骨基质的形成，结论：大肠杆菌表达的BMP－4的经复性处理后具有诱骨活性。     

重组变形链球菌V+蛋白的表达和纯化

目的：探讨变形链球菌表面蛋白可变区（V＋）基因在大肠杆菌中高效诱导表达及其表达产物的进一步纯化。方法：将V＋基因以C端融合6个组氨酸的形式在E.coli BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达。His6融合表达产物经金属离子（Ni^2 )融体亲和层析分离纯化，SDS－PAGE电泳和Western blot印迹分析表达产物。结果：SDS－PAGE分析确定有与His6融合表达产物（His6-rV )理论相对分子质量一致的诱导表达条带，其表达量占全菌蛋白的20％左右，表达产物以可溶形式存在。进一步纯化目的蛋白，纯度可达90％。Western blot实验表明表达产物具有良好的抗原性。结论：His6融合表达载体可以高效地表达和纯化重组V＋蛋白。     

吗啡成瘾大鼠的前额叶皮质蛋白质组的初步研究

比较吗啡成瘾与正常大鼠前额叶皮质（prefrontal cortex,PFC）蛋白质双向电泳图谱,可找和鉴定吗啡成瘾人鼠PFC中的差异表达蛋白质。方法：以固相pH梯度等电聚焦为第一向和垂直SDS—PAGE为第二向,分别对正常对照火鼠和吗啡：成瘾大鼠的PFC蛋白质样品进行二维分离,2-DE图谱经ImageMaster2DPlatinumv5．0软件分忻,选取4个簋异蛋白点用荩质辅助激光解吸附离子化飞行时间质谱（MALDI—TOF—MS）进行鉴定。结果：通过对2-DE图谱蛋白斑点的匹配及对比分析,与吗啡成瘾相关的差异表达蛋白斑点为87个;经质谱鉴定出2个有意义的差异表达的蛋白斑点：核小均一核糖核蛋∪、β—肌动蛋白。结论：吗啡成瘾组与正常对照组大鼠PFC蛋白质组存在差异;初步鉴定出了2种大鼠前额叫‘皮质中与旷5啡成瘾州关的差异蛋白,其表达的变化可能通过多种途经影响PFC神经元功能,为我们研究阿片类物质依赖作用机制提出了新的思路相方向。     

神经损伤相关基因tropic1808在大鼠腓肠肌组织中的表达及其克隆

目的:探讨tropic1808基因在SD大鼠腓肠肌组织中的表达及其基因序列情况。方法:采用Westernblot方法在成年SD大鼠腓肠肌组织中可见阳性反应蛋白条带。进而根据登录基因设计一系列引物从腓肠肌组织总RNA逆转录第一链中扩增tropic1808基因,经Southern验证。RT-PCR产物经巢式PCR扩增出一个特异条带,并对该片段测序分析。结果:与tropic1808基因100%同源。结论:在成年SD大鼠腓肠肌组织中存在tropic1808基因,但其表达丰度较低。     

PKM2在新生鼠缺血缺氧性脑病中的表达变化*

目的：观察新生鼠缺血缺氧性损伤后,丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase M2, PKM2)在大脑皮层中的表达变化。方法：选取9 d SD新生鼠40只,按随机数字表法分为假手术组(10只)和缺血缺氧性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy, HIE)模型组(30只)。采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, TTC)染色法检查两组的脑组织梗死面积;Western Blot法检测PKM2在大脑皮层的表达水平变化;组织免疫荧光染色检测PKM2在大脑皮层中的定位;将原代神经元经缺氧缺糖(oxygen glucose deprivation, OGD)处理后,通过细胞免疫荧光染色检测PKM2的入核情况。结果：TTC染色结果显示,HIE模型组新生鼠的大脑右侧半球发生梗死;PKM2在大脑皮层的神经元中表达;在OGD刺激之后PKM2的表达在神经元中出现入核现象。结论：新生鼠在缺血缺氧损伤后,PKM2可能通过O-乙酰氨基葡萄糖糖基化对大脑皮层神经元的应激性过程起到一定作用。     

髓鞘相关蛋白Nogo-A在纯化细胞核中的表达

目的：检测Nogo-A蛋白在纯化后的大鼠脊髓和小脑细胞核中的表达。方法：通过差速离心法得到大鼠脊髓和小脑样本的各亚细胞成分,利用非离子性去污剂NP-40纯化细胞核组分,采用Western blot方法检验核纯度并检测Nogo-A在各亚细胞成分中的表达。结果：纯化的细胞核抽提物中检测到特异的Nogo-A反应条带。结论：Nogo-A在纯化的细胞核中仍有明确表达,进一步证明了Nogo-A蛋白在中枢神经元的细胞核中有定位,并提示Nogo-A很可能以全长形式入核。     

不同缺铁期大鼠耳蜗肌动蛋白的含量及分布

目的 :观察不同缺铁饲养期对大鼠耳蜗肌动蛋白含量及分布的影响 ,探讨铁缺乏致聋的发病机制。方法 :应用 SDS-PAGE蛋白电泳、双波长薄层扫描分析、免疫组织化学以及听性脑干诱发电位检测 ,观察比较铁缺乏 8周、12周的大鼠及正常大鼠耳蜗肌动蛋白含量与分布的变化。 结果 :与正常对照大鼠比较 ,铁缺乏引起的感音神经性聋大鼠耳蜗肌动蛋白相对含量明显下降 (P<0 .0 1) ,免疫组化反应减弱 ;但不同缺铁期间耳聋大鼠耳蜗肌动蛋白变化比较无显著性差异 (P>0 .0 5 )。 结论 :耳蜗内肌动蛋白相对含量减少和 (或 )免疫组化反应减弱与铁缺乏致聋存在密切关系 ;缺铁时间长短对大鼠耳蜗肌动蛋白含量及免疫组化反应无明显影响。     

AKT及JNK激酶在大鼠脑缺血预处理后线粒体中的表达

目的：观察脑缺血预处理后大鼠海马CA1区神经元线粒体内JNK和AKT的激活,并使用AKT,JNK抑制剂进一步探讨其对线粒体结构功能的影响.方法：制作大鼠四动脉结扎脑缺血模型,Western Blot方法分析海马CA1区线粒体内AKT,JNK的磷酸化水平和蛋白表达,利用透射电子显微镜技术观察海马CA1区超微结构.结果：Western Blot结果显示p-AKT于缺血再灌注30 min达高峰,而预处理后再灌注6 h开始升高,1,3 d达高峰.JNK在缺血后再灌注30 min和3 d呈现两个激活高峰,而预处理后再灌注6 h显著升高,1,3 d明显低于正常组,且与缺血再灌注相同时间点相比显著降低.AKT,JNK的蛋白表达无明显变化.透射电子显微镜观察显示正常组及溶剂对照组神经元超微结构无明显变化,缺血组与AKT抑制剂组可见大量神经元损伤,与缺血组相比预处理组及JNK抑制剂组神经元损伤显著减轻.结论：脑缺血预处理可诱导AKT,JNK在海马CA1区线粒体内的差异激活,并通过增强AKT活性、抑制JNK磷酸化而保护线粒体的结构和功能,从而保护缺血性神经元.     

核仁蛋白PES1在乳腺癌细胞中的表达及siRNA干扰核仁蛋白PES1对乳腺癌细胞周期的影响

目的 探讨特异性siRNA干扰核仁蛋白PES1对乳腺癌细胞周期的影响.方法 以Western Blot和免疫细胞化学法对PES1的表达和定位进行检测,用流式细胞仪检测细胞周期的变化.结果 PES1在细胞核内高表达,经siRNA干扰后,乳腺癌细胞G2期发生阻滞现象.结论 核仁蛋白PES1在调控乳腺癌细胞周期中起着重要作用;siRNA干扰核仁蛋白PES1对乳腺癌细胞周期存在影响.     

Proliferation in rat gastric mucosal cells induced by chronic ethanol feeding through the ROS/BMK1 pathway

Objective： To investigate the correlation between the gastric mucosal cell proliferation and low-concentration alcohol intake in a chronic drinking rat model, and to investigate the possible role of ROS/BMK1 pathway in this process. Methods： SD rats were randomly divided into 4 groups： control group, administered with tap water; ethanol group, with 6% ethanol in the drinking water; quercetin group, with quercetin （100 mg/kg） by intragastric gavage twice a day; ethanol＋quercetin group, administered with quercetin combined with 6% ethanol. The cell proliferation in rat gastric mucosa was analyzed by flow cytometery and proliferating cell nuclear antigen （PCNA） immunohistochemical staining. Activation of ERKs and BMK1 was evaluated by the expression and phosphorylation of these kinases using Western Blot analysis. Results： Compared to the controls, the cell proliferation in gastric mucosa of rats exposed to the ethanol for 7 d was enhanced, and the activation of BMK1 was also increased in this period. Otherwise quercetin, as a free radical scavenger, attenuated increased cell proliferation and activation of BMK1 in rat stomach treated with ethanol. However, no changes of ERKs expression and phosphorylation occurred in the rats in all groups. Conclusion： These results suggested that the ROS and BMK1 activation may be a central mechanism, which underlies cell proliferation in rat gastric mucosa stimulus with the chronic low-concentration ethanol.     

弓形虫表面抗原P22、P30复合基因在原核细胞中表达的研究

目的：对含有P22，P30复合基因的重组菌进行IPTG诱导表达，进而检测复合基因的融合表达产物的免疫活性。方法：用IPTG对工程菌进行诱导表达，表达产物行SDS－PAGE蛋白凝胶电泳及Western-Blot免疫印记检测，结果：蛋白电泳结果显示，阳性重组菌比阴性菌在66．5KDa位置上明显多一条带，此条带可与P30抗体结构并使免疫印记显示阳性结果。结论：含有P22、P30基因片段的质粒组体经诱导表达出融合蛋白，其内的组分蛋白P30具有与其相应抗体结合的能力。     

老化对磷酸烯醇型丙酮酸激酶基因转录作用的影响

使用６￣２６月龄Ｆｉｃｈｅｒ３４４禁食雄性大鼠肝脏研究了老化对磷酸烯醇型丙酮酸激酶（ＧＴＰ）（ＰＥＰＣＫ．ＥＣ．４．１．１．３２）基因表达的影响，结果表明６￣２６月龄大鼠肝脏提取物中的ＰＥＰＣＫ活力约下降５０％，且与年龄相关的ＰＥＰＣＫ活性的下降与ＰＥＰＣＫ ｍＲＮＡ水平的下降相平行。因此，ＰＥＰＣＫ活性的下降可能是因用于进行转译作用的ｍＲＮＡ的转录作用下降，且６月龄到２６月龄大鼠肝脏的ＰＥＰＣＫ     

细胞穿透肽PEP-1介导人过氧化氢酶转导入在体大鼠心肌组织

目的：观察PEP-1介导CAT转导人心肌组织的能力,检测转导的CAT是否具有天然活性．方法：用基因工程手段表达并纯化出PEP-1-CAT和CAT融合蛋白．以生理盐水为对照,分别从SD大鼠尾静脉注射500μg PEP-1-CAT和CAT融合蛋白,在0．5,1,2,4,8,24h时将其处死,取其心脏,免疫荧光及Western Blot检测CAT的转导能力,用试剂盒检测心肌CAT的酶活性．结果：SDS—PAGE和Western Blot证实目的蛋白PEP-1-CAT和CAT得到了高表达,且纯度在90％左右．生理盐水组及CAT组,荧光显微镜下均未见到绿色荧光,Western Blot亦未检测到目的蛋白;PEP-1-CAT各组均可观察到绿色荧光,且8h时强度最大,同时Western Blot也检测到了目的蛋白,8h时量最多;酶活性检测显示,CAT组与生理盐水对照组差别无统计学意义,而PEP-1-CAT组随着时间的延长,心肌组织中CAT的活性逐渐增加,在8h时达到峰值,为对照组的4．20倍．结论：PEP-1能够介导CAT以天然活性方式转导入大鼠心肌组织,且其转导呈时间依赖性．