腺病毒载体介导的早幼粒细胞性白血病生长抑制因子诱导胆囊癌细胞凋亡的实验研究

目的　探讨腺病毒载体介导的早幼粒细胞性白血病(promyelocyticleukemia ,PML)生长抑制因子抑制胆囊癌细胞系(GBC- SD)的生长作用。方法　用重组绿色荧光蛋白的腺病毒(Ad GFP)感染胆囊癌细胞系,检测其对胆囊癌细胞株的感染力及Ad- PML对细胞体外生长的影响。用DNAladdering和TUNEL法检测细胞凋亡,用流式细胞仪检测细胞周期。结果　腺病毒滴度为10 0MOI时被感染的胆囊癌细胞可达10 0 % ;PML能明显抑制GBC SD细胞体外生长(P <0 .0 5 ) ;Ad PML感染后GBC SD细胞出现DNA降解带,凋亡细胞数量明显增加(P <0 .0 1) ;但细胞周期无明显改变。结论PML能显著抑制GBC- SD细胞的体外生长,PML通过诱导胆囊癌细胞凋亡发挥其生长抑制作用。     

抗Fas单克隆抗体诱导人胃癌细胞系SGC-7901细胞凋亡的研究

目的 探讨抗Fas单克隆抗体诱导胃癌细胞凋亡的规律及在胃癌治疗中的意义。方法 应用细胞形态观察、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞光度术检测抗Fas单克隆抗体对胃癌细胞SGC-7901增殖周期的影响以及对细胞杀伤作用的方式，并检测了SGC-7901细胞表面bcb2的表达情况。结果 抗Fas单克隆抗体有阻滞细胞周期、通过诱发凋亡而抑制肿瘤细胞生长的作用。经抗Fas单克隆抗体处理后，SGC-7901细胞表面bcl-2蛋白表达无明显变化。结论 抗Fas单克隆抗体可以诱导胃癌细胞系SGC-7901细胞凋亡，抗Fas单克隆抗体诱导胃癌细胞凋亡与bcl-2表达无关。     

arresten对人胃癌细胞SGC-7901裸鼠移植瘤生长的抑制作用的研究

目的探讨arresten抑制人胃癌细胞SGC-7901裸鼠移植瘤生长的作用。方法构建包含arrestenc DNA的分泌型真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-ss-arresten,并以脂质体法将重组质粒转染至SGC-7901细胞。蛋白印迹法（Western blot）检测SGC-7901是否分泌表达arresten,同时,通过生长曲线绘制及生长周期测定的方法了解上述转基因措施本身对SGC-7901细胞的体外生物学特性的影响。将转基因的SGC-7901细胞株接种至裸鼠皮下,使其在接种局部表达arresten,观察肿瘤生长情况。结果成功构建了分泌型真核表达载体pcDNA3．1（＋）-ss-arresten,并获得了可分泌表达arresten的人胃癌SGC-7901细胞株。质粒转染对SGC-7901细胞增殖特性无影响。转基因SGC-7901细胞的裸鼠移植瘤生长缓慢。结论arresten抑制人胃癌SGC-7901移植瘤的生长,其途径可能是通过抑制其滋养血管的生长而实现。     

复方苦参注射液诱导胃癌细胞凋亡的机制

目的探讨复方苦参注射液对胃癌SGC-7901细胞凋亡的影响及其可能机制。方法体外培养胃癌细胞系SGC-7901，四甲基偶氮唑盐（MTT）法测定药物对SGC-7901细胞生长的抑制作用；透射电镜下观察肿瘤细胞的超微结构变化；应用流式细胞术（FCM）检测肿瘤细胞凋亡情况和Fas、FasL蛋白的表达；分光光度法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）-3活性的变化。结果不同浓度复方苦参注射液对SGC-7901细胞生长均有一定的抑制作用。0．5g／L、1．0g／L和1．5g／L复方苦参注射液组SGC-7901细胞凋亡率分别为39．80％、58．11％和79．00％，呈明显的量效关系；复方苦参注射液组以早期凋亡细胞为主，氟尿嘧啶对照组以晚期凋亡细胞为主。Fas蛋白表达及FasL蛋白表达与凋亡均呈显著正相关：Fas蛋白表达及FasL蛋白表达之间呈显著正相关。复方苦参注射液组caspase．3酶活性随着药物浓度而升高，且酶活性变化与细胞凋亡率变化呈正相关。结论复方苦参注射液可有效诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡，其机制可能与上调Fas／FasL蛋白表达、激活caspase-3酶有关。     

腺病毒载体介导的PML生长抑制因子用于胆囊癌基因治疗的实验研究

目的 探讨腺病毒介导的PML基因对胆囊癌细胞（GBC-SD）的生长抑制作用。方法 用原位杂交和免疫组织化学法分别检测PMI，重组腺病毒的转导效率、GBCSD中PMI，mRNA和蛋白的表达量及表达时间，MTT法检测PML基因转染后GBC-SD的生长状况，观察转染PML基因后GBC-SD的致瘤能力的变化。结果 腺病毒滴度为100MOI时被感染的胆囊癌细胞可达100％，Ad-PML感染的GBC-SD能高效表达PML-mRNA和PML蛋白，表达时间可持续2周以上，PML对GBC-SD体外生长具有明显抑制作用，Ad-PML感染的GBC-SD不能在裸鼠体内形成肿瘤。结论 腺病毒介导的PML基因能在GBC-SD细胞中稳定、高效表达，并能显著抑制GBC-SD细胞的体外生长及其在裸鼠体内的致瘤性，PML有可能用于胆囊癌的基因治疗。     

双链蛋白聚糖对胃癌细胞生长作用研究

目的:研究双链蛋白聚糖(biglycan,BGN)对人胃癌细胞系SGC-7901的细胞增殖、周期及凋亡等生长作用影响。方法:构建重组质粒pIRES2-EGFP/BGN,转染胃癌细胞株SGC-7901,获得胃癌稳转细胞株SGC-7901/BGN。通过细胞增殖实验(CCK-8法)、平板克隆实验、流式细胞技术,分别检察BGN过表达对SGC-7901细胞增殖、克隆形成、周期及凋亡的影响。结果:SGC-7901/BGN组胃癌细胞较SGC-7901/空载组生长明显抑制(P<0.01),细胞培养板形成的克隆数明显减少[(209.7±12.6)比(326.0±15.1)];同时过表达BGN可促进胃癌细胞的凋亡[(10.7±1.5)%比(5.3±1.1)%],且将细胞周期阻止在G1期[(55.7±2.1)%比(37.6±1.8)%]。结论:胃癌细胞过表达BGN可抑制胃癌细胞的增殖、克隆形成。BGN可能通过将细胞周期阻滞在G1期、诱导细胞凋亡,从而发挥其生长抑制的生物学效应。     

靶向沉默SPHK1基因诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡

目的探讨用小干扰核酸（SmallinterferingRNA,siRNA）靶向沉默神经鞘氨酸激酶1（sDhingosinekinasel,SPHKl）基因敲除后对胃癌SGC-7901细胞凋亡的影响。方法人工化学合成SPHKlsiRNA和对照siRNA,分别转染胃癌SGC-7901细胞。Westernblot法检测SPHKl、Bcl-2和Bax蛋白的表达;流式细胞术（FlowCytometry,FCM）检测细胞凋亡的变化。结果SPHKlsiRNA转染胃癌SGC-7901细胞后,SPHKl蛋白表达明显下调;与对照组相比,SPHKlsiRNA转染组Bcl一2蛋白表达下调了55％（P〈0．01）,Bax蛋白表达差异无统计学意义,Bcl-2／Bax比值下调54％（P〈0．05）;SPHKlsiRNA转染组早期凋亡细胞明显增多（P〈0．01）,晚期凋亡细胞无明显变化。结论SPHKl特异性siRNA可阻断SGC-7901细胞SPHKl蛋白的表达,并通过影响Bcl-2通路诱导细胞凋亡。     

整合素连接激酶反义寡核苷酸对胃癌细胞的作用

目的探讨全硫代修饰整合素连接激酶(integrin-linkedkinase,ILK)反义寡核苷酸(antisenseoligonucletide,ASODN)导入胃癌细胞株SGC-7901后对胃癌细胞的作用。方法(1)应用脂质体将ILK的ASODN导入胃癌细胞系SGC-7901,以RT-PCR及Western印迹方法检测作用后胃癌细胞ILK的mRNA和蛋白水平的变化;(2)应用MTS法及流式细胞术评价ILK的ASODN导入细胞后对其体外增殖和凋亡的影响。结果(1)转染后胃癌细胞ILK的蛋白表达水平明显下降,但mRNA水平无明显变化;(2)胃癌细胞生长受到明显抑制,抑制效应具有浓度依赖性,并可明显诱导细胞产生凋亡。结论ILK反义寡核苷酸导入胃癌细胞株SGC-7901后可以降低细胞内ILK的蛋白表达水平,并可体外抑制胃癌细胞增殖,诱导胃癌细胞凋亡。     

抑癌基因WTX对胃癌SGC-7901细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响

目的:探讨WTX基因对人胃癌SGC-7901细胞生物学行为的影响。方法:将WTX重组质粒或空载体质粒用Attractene法转染SGC-7901细胞,以无处理SGC-7901细胞为空白对照,检测不同时间e GFP标记的转染效率;RT-PCR法检测WTX m RNA水平;CCK-8法测定细胞增殖情况;流式细胞技术检测转染效率、凋亡及细胞周期的变化。结果:转染WTX基因48 h后,e GFP表达最强,转染效率达(33.10±4.16)%;与空白对照组和空载体组比较,WTX转染组WTX m RNA表达明显升高;细胞增殖能力明显降低,S期细胞明显增多,而G1期和G2/M期细胞减少(均P<0.05)。各组细胞均未见明显的细胞凋亡。结论:WTX可通过诱导S期阻滞抑制胃癌细胞SGC-7901生长,但不影响细胞凋亡。     

新型血管生成抑制人内皮细胞抑制素-血管内皮细胞生长抑制因子151治疗胃癌的实验研究

目的研究重组腺病毒表达的人内皮细胞抑制素-血管内皮细胞生长抑制因子151(hENDO-VEGI151)融合蛋白对胃癌的抑制作用.方法构建携带hENDO-VEGI151融合基因的重组腺病毒载体,脂质体介导法包装重组腺病毒Ad IL-3/hENDO-VEGI151.体外检测融合基因的表达及融合蛋白的生物学活性.应用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型及荷人胃癌裸鼠模型,进一步观察融合蛋白对活体血管生成的影响和融合基因治疗活体胃癌的疗效.结果用TCID50法测定携带融合基因的重组腺病毒滴度为4.2×1011TCID50/ml;用聚合酶链反应(PCR)、逆转录(RT)-PCR和免疫组织化学方法证实融合基因可被转导入SGC-7901细胞内并稳定高效地转录和表达;Western blot显示融合蛋白可被分泌到胞外发挥作用;融合蛋白可强烈抑制ECV-304细胞生长及鸡胚绒毛尿囊膜新生血管形成.Ad IL-3/hENDO-VEGI151治疗可强烈抑制裸鼠体内种植瘤生长,明显下调肿瘤微血管密度,促进胃癌细胞凋亡.结论 hENDO-VEGI151是一条新型强效的肿瘤血管生成抑制基因,其表达产物可能通过作用于肿瘤新生血管形成的不同环节强烈抑制新血管生成和肿瘤生长,值得进一步研究.     

索拉菲尼对人胃癌细胞SGC-7901增殖、凋亡和P-ERK表达的影响

目的：探讨多分子靶向药物索拉菲尼（sorafenib）对体外人胃癌细胞SGC-7901增殖、凋亡的影响及对癌细胞P-ERK表达的影响,并探讨其可能机制。 方法：以MTT法检测索拉菲尼对SGC-7901细胞的杀伤抑制作用;免疫细胞化学法检测胃癌细胞内P-ERK蛋白的表达;流式细胞仪检测胃癌细胞凋亡的变化情况。 结果：索拉菲尼对胃癌细胞生长增殖具有抑制作用,随药物浓度的增加作用也增强,呈剂量—时间双效应关系(P<0.05);经索拉菲尼处理的SGC-7901细胞的P-ERK表达明显下降(P<0.05);细胞凋亡率增高(P<0.05)。 结论：sorafenib在体外对SGC-7901细胞具有明显的抑制作用,主要机制为抑制其P-ERK表达,从而抑制其增殖和促进凋亡。     

硫利达嗪对胃癌细胞生长的抑制作用与机制研究

目的:探讨硫利达嗪对胃癌细胞体外生长的抑制作用及其机制。方法:不同浓度的硫利达嗪作用于胃癌SGC-7901细胞24 h后,分别用MTT法与流式细胞仪检测胃癌细胞的增殖与凋亡情况,以及用Western blot检测凋亡相关蛋白bax、bcl-2、caspase-3的表达情况。结果:硫利达嗪作用后,SGC-7901细胞的增殖明显抑制,凋亡率明显增加,抗凋亡蛋白bcl-2表达下调、促凋亡蛋白bax表达上调、caspcase-3蛋白表达上调,且均呈浓度依赖性(均P0.05)。结论:硫利达嗪对人胃癌细胞体外的生长有明显抑制作用,该作用可能与其并活化caspase-3依赖的凋亡途径有关。     

蛋白激酶B siRNA 转染对胃癌SGC-7901细胞生长增殖的影响

目的:探讨蛋白激酶B（PKB）基因沉默对人胃癌SGC-7901细胞增殖的作用。 方法:应用基因转染技术将蛋白激酶B家族的Akt2 siRNA转染至胃癌细胞中，采用Western blot、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞术MTT等方法观察和检测Akt2 siRNA转染后对转染组细胞生长和增殖的影响。结果:与对照组比较，转染Akt2 siRNA组的胃癌SGC-7901细胞生长、增殖速度明显减缓（P＜0.01）， Akt2 siRNA组较对照组细胞的Akt2蛋白表达水平显著下调（P＜0.01）;转染组出现梯状凋亡条带;细胞周期显示转染组细胞聚集在G2/M期。 结论:应用RNAi使蛋白激酶B基因沉默能使人胃癌SGC－7901细胞的生长受到抑制，胃癌细胞增殖速度减缓，其作用机理可能通过诱导细胞凋亡和抑制PI3/K信号传导通路而实现。Akt2有望成为胃癌基因治疗的新靶点。     

榄香烯对胃癌细胞p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路的影响

目的 探讨榄香烯对人胃癌SGC-7901细胞株增殖的影响,以及与p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信号通路的关系.方法 用不同浓度的榄香烯处理胃癌SGC-7901细胞,MTT法检测细胞增殖情况;光镜和透射电镜观察形态学改变;Western blot方法检测P38和磷酸化P38(P-P38)的表达.结果 榄香烯抑制胃癌细胞SGC-7901增殖,并呈浓度和时间依赖性;在光镜和透射电镜下可以观察到典型的细胞凋亡形态学改变;经0.08 mg/ml榄香烯作用4 h后,胃癌SGC-7901细胞中p38MAPK通路被激活,p-P38表达与对照组相比升高3.72倍,差异有统计学意义(P＜0.01),而P38总蛋白量未发生明显变化.预先应用p38MAPK通路抑制剂SB203580作用24 h与单用榄香烯作用组比较,p-P38表达下降54.12%,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 榄香烯可以抑制胃癌细胞SGC-7901的增殖,诱发细胞凋亡,其机制可能与p38MAPK通路有关.     

VEGF-ASODN转染对胃癌细胞VEGF和survivin表达的影响

目的:观察血管内皮细胞生长因子反义寡核苷酸（VEGF-ASODN）转染胃癌细胞SGC-7901对血管内皮生长因子（VEGF）和生存素（survivin）表达的影响。方法:人工合成硫代磷酸化VEGF-ASODN。实验分为5组：对照组，错义组，实验1组(转染浓度为100 ng∕mL),实验2组（转染浓度为400 ng∕mL）及实验3组（转染浓度为700 ng∕mL）。转染后实时荧光定量RT-PCR检测细胞RNA起始拷贝数; ELESA法检测细胞及培养上清液VEGF 蛋白含量; Western-blot法检测细胞生存素蛋白表达量; 流式细胞仪检测细胞凋亡; 细胞生长曲线检测转染对细胞生长的影响。结果:3个实验组VEGF mRNA水平和VEGF蛋白表达量及培养上清液VEGF 蛋白含量均明显降低，survivin蛋白的表达水平随转染浓度的升高而降低，转染VEGF-ASODN能使胃癌细胞凋亡增加、细胞生长减缓。结论:VEGF-ASODN转染胃癌细胞SGC-7901能显著抑制细胞VEGF的表达，促进细胞凋亡，抑制细胞增殖。     

FasL、B7-1联合基因修饰的胃癌细胞诱导抗胃癌主动免疫的研究

目的 探讨FasL、B7-1联合基因转移是否具有协同的抗肿瘤效应。方法 采用重组腺病毒载体将FasL、B7-1基因导入人胃癌细胞SGC-7901,G418阳性克隆筛选,流式细胞分析,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),显示FasL和B7-1的表达,并且通过Hoechst33342染色检测胃癌细胞凋亡;将携带 FasL和 B7-1基因的胃癌细胞(命名为 SGC-7901/FB-11)接种于 C57BL/6小鼠背部皮下,观测其致瘤性能;SGC-7901/FB-11致敏的小鼠对野生型瘤细胞是否具有免疫保护作用;用SGC-7901和 SGC-7901/FB-11细胞分别经腹腔免疫小鼠,得到腹腔浸润淋巴细胞及致敏脾细胞,MTT法检测其体外杀伤实验。结果 FasL和B7-1基因在胃癌细胞中获得高表达并可诱导胃癌细胞的凋亡,双基因转染的胃癌细胞的致瘤性明显下降;SGC-7901/FB-11诱导的细胞毒T淋巴细胞(CTL)对SGC-7901的杀伤活性显著高于野生型SGC-7901诱导的CTL对相同靶细胞的杀伤活性(P<0.05);SGC-7901/FB-11诱导的 CTL对 SGC-7901/FB-11的杀伤率显著高于对野生型 SGC-7901的杀伤率(P<0.05)。结论 FasL促进胃癌细胞凋亡,B7-1促进抗胃癌CTL的增殖、活化,在效应阶段两基因发挥着重要的协同作用。