骨髓间充质干细胞移植治疗mdx鼠的实验研究

目的 研究骨髓间充质干细胞(MSCs)移植治疗对Duchenne肌营养不良(DMD)模型鼠mdx鼠病态肌肉的影响.方法 分离培养正常小鼠MSCs,局部肌肉注射移植入DMD型模型鼠mdx鼠肌肉,16周后观察mdx鼠肌肉肌力、肌肉病理学改变及dystrophin蛋白表达变化.结果 MSCs移植16周后mdx鼠肌纤维dystrophin蛋白表达增加,肌力好转,核中移明显改善.结论 MSCs移植可缓解mdx鼠肌肉病理改变,但移植效率的提高需要进一步研究.     

骨髓和脐血间充质干细胞改善肌营养不良患者肌力的临床观察

目的 观察骨髓和脐血间充质干细胞双移植方案治疗进行性肌营养不良(PMD)患者的安全性和有效性.方法 2007年6月至2008年6月对经血清酶学、肌电图、基因分析、肌肉活检、肌肉磁共振成像(MRI)确诊的82例PMD患者采用干细胞双移植方案进行治疗.采用自身治疗前后对照方法进行研究,随访3～12个月.治疗方法:①骨髓间充质干细胞(BMSC):经双侧髂后上脊穿刺采集骨髓80～150 ml,Ficoll密度梯度离心分离单个核细胞并诱导分化为BMSC.②人脐血间充质干细胞(CB-MSC):采集脐带血80～160 ml,CB-MSC制备过程同BMSC.③干细胞移植术:收集BMSC和CB-MSC,制备成1×108/ml BMSC细胞悬液和1×107/ml CB-MSC细胞悬液,分次移植于患者的四肢肌肉内和静脉内.移植后3、6、9、12个月观察患者日常生活活动能力评价(ADL)、临床分级疗效评定、酶学、肌电图、肌肉MRI变化.结果 82例患者干细胞移植后3、6、9、12个月进行临床分级疗效评定,显效31例(37.8%),有效37例(45.1%),无效14例(17.1%),总有效率为82.9%.70例患者(85.4%)肌力提高,肢端温暖、食欲改善、动作灵活、体重增加.72例患者ADL评分增加(87.8%),治疗前后结果差异有统计学意义(P<0.01).干细胞移植后LDH降低,差异有统计学意义[(475±223)u/L比(410±216)u/L,P<0.05,t=6.650],肌酸激酶[(2952±2259)u/L比(2841±2092)u/L,P=0.223,t=1.094]、肌酐[(26±12)μmol/L比(25±11)μmol/L,P=0.306,t=1.029]轻度降低,但差异无统计学意义.干细胞双移植方案实施中儿童患者依从性好,未发生不良反应及并发症.结论 干细胞双移植方案治疗进行性肌营养不良可使82.9%的患者获得临床症状改善,运动功能及肌力提高,安全性好,无排斥反应,是一种治疗进行性肌营养不良的新手段.     

骨髓和脐血间质干细胞联合移植治疗杜氏型进行性肌营养不良症269例疗效研究

目的 观察骨髓间质干细胞(BMSCs)和脐血间质干细胞(CMSCs)联合移植治疗杜氏型进行性肌营养不良症(DMD)的临床疗效.方法 2007年6月-2009年3月对269例DMD患者行自体BMSCs和CMSCs联合移植方案进行治疗,患者均使用重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF),5～10 μg/kg,2次/d,皮下注射动员骨髓干细胞4 d,于第5天行骨髓采集术,局部麻醉下从髂后上棘抽取骨髓100～180 ml.将采集的骨髓液经Ficoll密度梯度离心后,分离单个核细胞2.0×109,用Uitra cul Ture 培养液调节细胞数量为1×105/ml～1×106/ml,接种于75 mm2培养瓶中,24 h换液,7～10 d后收集全部细胞,总数为4.0×108/ml～1.5×109/ml.将BMSCs移植到患者四肢近端肌肉内.采集脐血80～160 ml,Ficoll密度梯度离心,分离单个核细胞并诱导分化为CMSCs.将CMSC(1.0～4.8)×107细胞悬液,经静脉缓慢输注,每5～7 d 1次,共3次.移植后6个月对患者的肌力、步行10 m和推轮椅10 m所需时间、肌酸激酶水平、肌电图等进行观察.结果 269例患者移植后6个月时随访,218例患者(81.0%)肌力有不同程度的增加.干细胞移植后235例患者复查心肌酶谱,其中188例(80%)患者步行10 m及推轮椅10 m所需时间明显缩短,与移植前比较差异有统计学意义(P<0.05),干细胞移植后患者肌酸激酶水平较移植前明显下降(P<0.01).51例患者复查肌电图,32例(62.7%)患者波幅不同程度增高,运动单位增多,多相波减少.47例患者复查大腿肌肉磁共振成像,肌肉影像较移植前变化不明显.结论 BMSCs和CMSCs移植治疗DMD,对肌肉组织有一定的修复作用,使DMD患者的运动功能得到改善,肌力有所提高,肌酸激酶较移植前下降.移植后复查肌电图波幅不同程度增高,运动单位增多,多相波减少.MSCs移植无不良反应,患者依从性好,是治疗DMD的新手段.     

体外培养经皮移植自体骨髓间充质干细胞治疗四肢骨不连

目的:探讨体外培养经皮移植自体骨髓间充质干细胞(MSCs)治疗四肢骨折骨不连的效果。方法:12例四肢骨折骨不连患者采用体外培养经皮移植自体MSCs治疗。结果:9例获得了骨性愈合,骨折愈合平均时间为5个月(4~7月),X线显示骨折线消失,骨痂形成。骨折愈合率为75%(9/12)。结论:体外培养经皮移植自体MSCs治疗四肢骨折骨不连创伤小、安全、并发症少,临床效果满意。     

间充质干细胞体外扩增联合自体外周血造血干细胞移植治疗恶性血液病

目的　探讨体外培养扩增临床规模的人骨髓间充质干细胞(MSCs)的可行性及其联合自体造血干细胞(APBSCs)移植治疗恶性血液病的可行性、安全性和对造血重建的影响。方法　骨髓单个核细胞(MNC)来自12例正常人及恶性血液病患者,采用无血清培养基体外培养人骨髓间充质干细胞(MSCs)。MSCs联合APBSCs移植治疗4例恶性血液病。结果　能够从所有2 6 .3±8.8ml骨髓样本中提取MSCs,其中10例成功扩增。4例患者接受扩增后MSCs联合APBSCs输注。MSCs输注无明显不良反应。中性粒细胞≥0 .5×10 9/L和血小板≥2 0×10 9/L中位时间分别为9(8～11)d和8.3(7～10 )d。结论　应用无血清培养体系可培养扩增临床规模的人MSCs。MSCs联合APBSCs共移植安全可行。快速的造血恢复提示在清髓性治疗后输注MSCs可促进造血。     

活化T细胞及IFN-γ对间充质干细胞中血红素加氧酶-1抗凋亡作用的影响

目的 探讨免疫活性细胞和免疫调节因子对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)中血红素加氧酶-1(HO-1)的影响.方法 体外培养人骨髓间充质干细胞,在IFN-γ及PHA活化的T细胞刺激下,应用RT-PCR方法检测HO-1 mRNA的表达情况.应用流式细胞术分析细胞凋亡情况.结果 正常骨髓间充质干细胞中HO-1 mRNA在IFN-γ及活化的T细胞刺激后表达下调.流式细胞术结果显示,在IFN-γ锌原卟啉-Ⅸ(Znpp-Ⅸ)、IFN-γ+Znpp-Ⅸ的刺激下,间充质干细胞出现明显的凋亡,凋亡率分别为(56.50±0.16)%、(56.85±2.27)%、(82.53±2.65)%,较正常MSCs组显著增高[(7.56±1.43)%,P<0.05].结论 免疫活性细胞及免疫调节因子使骨髓间充质干细胞中HO-1 mRNA表达下凋,进而促进MSCs凋亡.     

肝硬化患者骨髓间充质干细胞的体外培养及生长特性

目的 研究肝硬化患者骨髓间充质干细胞（MSCs）的体外扩增方法及其生长特性和特异性表面标记,为肝组织工程“种子细胞”的选择提供新的理论依据,为进一步研究自体骨髓间充质干细胞移植治疗肝衰竭时移植细胞在体内的调控机制打下基础。方法 无菌抽取4例肝硬化志愿者骨髓3～4mL,年龄30～40岁,利用密度梯度离心法联合贴壁筛选法逐步筛选MSCs,获取MSCs,倒置显微镜下逐日观察细胞生长特性,细胞计数,绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面标志CD甜、CD45。结果 原代培养细胞生长潜伏期0～9d,对数增殖期为10～19d,生长平台期为20～24d;传代细胞生长周期较原代细胞快,细胞生长潜伏期为4～24h,对数增殖期为3～12d,13～15d进入生长平台期。肝硬化患者骨髓MSCs高表达CD44,低表达CD45。结论 肝硬化患者骨髓MSCs体外生长良好,性质稳定,可以作为“种子细胞”用于自体骨髓干细胞移植和生物人工肝系统。     

经冠状动脉自体骨髓间充质干细胞移植治疗小型猪急性心肌梗死

目的评价经冠状动脉移植体外分离培养自体骨髓间充质干细胞(MSCs)治疗急性心肌梗死(AMI)的可行性及疗效.方法通过结扎冠状动脉左前降支90 min后恢复血流的方法建立AMI模型.采用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞、传代培养后,在AMI造模10～14 d后将培养扩增的自体MSCs经冠状动脉植入梗死区,应用超声心动图观察移植前后心功能变化情况,冰冻切片荧光显微镜示踪4',6-二脒-2-苯基吲哚(DAPI)标记的MSCs,Ⅷ因子免疫荧光染色测定新生血管数目.结果MSCs生长呈纺锤样,生长旺盛呈旋涡样;DAPI标记率为l00%.AMI造模10～14 d后MSCs移植数量平均为(4～6)×107个,移植术后3个月,MSCs治疗组与对照组比较,左心室射血分数(LVEF)显著升高[(54.65±3.39)%vs(43.98±4.21)%(P＜0.01)],可见DAPI标记胞核为蓝色荧光的移植细胞,MSCs治疗组与对照组比较,新生血管数目显著升高[(13.28±4.39)vs(4.27 2.28)个,(P＜0.01)].结论通过体外培养扩增在短期内可以获得相当数量的生物性状稳定的MSCs,在AMI造模10～14 d后进行经冠状动脉MSCs自体移植,促进左室功能的恢复.MSCs移植与目前广泛运用的介入治疗相结合,方法简便、经济、有效,可望改善AMI患者的预后,具有良好的临床应用前景.     

自体骨髓间充质干细胞联合外周血造血干细胞移植治疗恶性血液病

目的 探讨自体骨髓间充质干细胞与外周血造血干细胞共移植治疗恶性血液病的安全性和疗效.方法 采用无血清培养体系体外培养骨髓间充质干细胞,将骨髓间充质干细胞与外周血造血干细胞共移植治疗5例恶性血液病.结果 5例患者骨髓间充质干细胞经体外培养扩增后,与采集的自体外周血造血干细胞共同回输.WBC和Plt低谷时间分别为4～7 d和4～9 d,造血重建(ANC≥0.5×109/L和Plt≥20×109/L)时间分别为8～11 d(中位时间9 d)和7～10 d(中位时间8.3 d).除口腔、咽部轻度感染外,无其他严重的移植相关并发症.结论 体外无血清培养体系可以培养扩增临床规模的骨髓间充质干细胞,而且自体骨髓间充质干细胞与外周血造血干细胞共移植治疗恶性血液病安全,移植后造血重建快.     

MRI评价自体骨髓间充质干细胞移植治疗AMI效果的实验研究

目的探讨移植自体骨髓间充质干细胞对急性心肌梗死的治疗效果。方法选取10只2月龄小型家猪抽取骨髓,分离培养自体骨髓间充质干细胞,经外周动脉介入法制备小型猪的心肌梗死模型。造模成功后7 d经冠状动脉注入自体骨髓间充质干细胞(实验组)以及生理盐水(对照组),分别在心肌梗死后7 d和移植后1个月行核磁共振(MRI)检查,评价心功能的变化。结果移植后1个月实验组左心室射血分数(0.50±0.06)明显高于对照组(0.39±0.09)(P<0.05)。结论自体骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死可以明显改善梗死区心肌收缩功能,MRI可以显示心肌梗死的透壁程度及梗死区的范围,可以通过测量舒张末期容积与收缩末期容积来计算左室的射血分数,反映左心功能变化。     

间充质干细胞的培养特性及其相关细胞因子表达

目的:探讨体外培养间充质干细胞的方法及其生物学特性,并检测与其抑制T淋巴细胞增殖活性减轻GVHD机制的细胞因子的表达。方法:通过密度梯度离心及贴壁筛选法分离、纯化及培养间充质干细胞,观察其生物学特性,并进行免疫细胞化学染色观察间充质干细胞是否表达TGF-β1、HGF。结果:采用贴壁筛选法培养间充质干细胞原代经7天贴壁后变为梭形,经14~17天可长满瓶底,传代后3~4天即可长满,免疫分型示CD29+,CD44+,CD34-,CD45-,免疫细胞化学染色显示高度表达TGF-β1及HGF。结论:密度剃度离心结合贴壁筛选法培养间充质干细胞可获得纯度较高,生物学特性稳定的间充质干细胞;间充质干细胞可能通过TGF-β1与HGF两种细胞因子抑制T淋巴细胞增殖减轻移植后GVHD。     

大鼠骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化的初步研究

目的体外分离培养骨髓间充质干细胞,并探索表皮细胞生长因子诱导MSCs分化的潜能及条件.方法采用直接贴壁法,分离培养大鼠股骨和胫骨骨髓间充质干细胞,应用免疫细胞化学法检测细胞CD44、CD106、CD29、CD90、CD34等,对分离的细胞进行鉴定.以10～40 ng/ml的表皮生长因子处理第3代MSCs,观察细胞角蛋白的表达.用Western blot方法摸索integrin β1的表达与MSCs分化状态的关系.结果原代培养的骨髓间充质细胞CD44、CD106、CD29、CD90免疫细胞化学染色为阳性,CD34为阴性,符合骨髓间充质干细胞特征.MSCs经不同浓度的EGF体外诱导7 d后,免疫细胞化学结果显示,EGF浓度为30 ng/ml和40 ng/ml时,细胞角蛋白出现阳性表达;体外诱导14 d,呈角蛋白染色阳性的细胞比例进一步增加,同时integrin β1表达量下降.结论体外培养的MSCs在EGF诱导下,具有分化为表皮细胞的倾向,同时integrin β1可能在MSCs分化中具有一定的作用.     

人胎盘来源间充质干细胞和大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特征比较

目的:从人足月的胎盘羊膜中和Wistar 大鼠股骨及胫骨骨髓中分离、培养间充质干细胞（MSCs）,研究人胎盘来源MSCs（HPMSCs）和大鼠骨髓来源MSCs（BMSCs）的分离培养方法和生物学特征、表面标志及其多分化潜能。方法:将人足月胎盘组织通过胶原酶Ⅱ消化培养获取HPMSCs,采用全骨髓贴壁法从4周龄Wistar大鼠双侧股骨及胫骨中分离、纯化大鼠BMSCs,运用活细胞计数法检测其增殖能力,采用流式细胞术检测2种细胞表面标志物的表阳性率;
用地塞米松、维生素C和β磷酸甘油诱导其向成骨细胞分化,用茜素红染色鉴定;用胰岛素、地塞米松、IBMX和吲哚美辛诱导其向脂肪细胞分化,以油红O染色鉴定。结果:HPMSCs为梭形贴壁细胞,增殖能力较强,CD44和CD34表达阳性率分别为94.45%和1.67%;BMSCs为圆形、梭形和多角形,增殖能力强,CD44和CD34表达阳性率分别为93.11%和2.68%。2种细胞经过成脂诱导液和成骨诱导液诱导后,茜素红和油红O染色结果均为阳性,表明2种细胞均可向脂肪细胞和成骨细胞分化。结论:HPMSCs与大鼠BMSCs的生物学特征相似,同样具有多分化潜能,HPMSCs具有更强的增殖能力。     

骨髓间充质干细胞的免疫调节活性

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一种多潜能的非造血干细胞,可以向多系分化,如骨、脂肪和软骨,并优先归巢于损伤组织,有利于组织修复。体外研究显示它们不诱导免疫应答,对识别、清除同种异体抗原的免疫细胞具有抑制作用。在动物实验中,骨髓间充质干细胞可以诱导外周免疫耐受并向损伤处迁移,抑制致炎细胞因子的释放,促进损伤组织修复。这种独特作用说明它们在细胞治疗和自身免疫性疾病治疗中发挥了积极作用。     

人羊膜间充质干细胞的研究进展

人羊膜间充质干细胞(hAMSC)具有来源丰富、分离简单的优点。hAMSC在组织修复中具有支持造血、再生、免疫调节、抗纤维化等作用。本文对羊膜间充质干细胞在各个系统疾病治疗的研究进行了综述,旨在为羊膜间充质干细胞的应用提供参考。     

大鼠骨髓间充质干细胞向成肌细胞诱导分化的研究

目的研究5-氮杂胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成肌细胞方向分化的最佳诱导浓度及诱导后细胞的活性,以得到稳定分化的成肌细胞.方法应用不同浓度的5-氮杂胞苷进行定向诱导分化,3H-TdR掺入试验检测诱导后细胞的活性状况,筛选出最佳的时相-浓度结合点,通过免疫组化鉴定分化结果.结果在10μmol/L5-氮杂胞苷诱导培养后15d细胞活性较好,免疫组化技术鉴定其已向成肌细胞方向分化.结论10μmol/L5-氮杂胞苷可成功诱导其向成肌细胞分化.为临床上以细胞注射治疗女性压力性尿失禁提供实验依据.     

人骨髓间充质干细胞的培养及性质鉴定

目的 分离培养并鉴定人胚胎骨髓间充质干细胞。方法 抽取流产胎儿股骨骨髓,梯度离心,取含有骨髓间充质干细胞的低密度血小板层进行培养;免疫细胞化学法鉴定细胞膜抗原和细胞基质中的蛋白属性;酶细胞化学法测定细胞碱性磷酸酶活性。结果 培养的细胞呈现纺锤形外观;细胞膜抗原 PDGFR、CD29、CD44有阳性表达,IGF-1R、CD34、CD45呈阴性表达,细胞基质中纤维粘连蛋白、胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ有表达,而胶原蛋白Ⅱ和层粘蛋白没有表达;碱性磷酸酶检测呈阴性反应。结论 培养的细胞不是骨髓中的造血干细胞或骨髓基质中的成纤维细胞,是处于未分化阶段的骨髓间充质干细胞。     

人骨髓间充质干细胞的分离及鉴定

［摘 要］ 目的：建立分离并鉴定人骨髓间充质干细胞（HMSC）的方法。 方法：联合应用Percoll（1.073 g•L^-1）密度梯度离心和贴壁筛选的方法分离HMSC进行体外培养,利用免疫细胞化学、细胞化学和电镜等技术手段对体外培养的HMSC进行鉴定。 结果：HMSC具有独特的表型特征,即CD29、CD44阳性和CD34、CD45阴性。细胞糖原反应（PAS）阳性、苏丹黑反应（SB）阴性。电镜观察结果提示细胞较幼稚。 结论：利用密度梯度离心和贴壁筛选的方法可以分离HMSC,联合应用免疫细胞化学、细胞化学和电镜等技术手段鉴定HMSC的方法有效。     

端粒酶活性在骨髓间充质干细胞中的表达

目的：探讨骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells MSCs)端粒酶活性的表达并检测其部分生物学特性。方法：取正常成人骨髓用含10%新生牛血清的LG-DMEM培养液培养、扩增。流式细胞仪行细胞表面抗原检测，细胞化学染色鉴定其生物学特性，观察其在地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C特定培养条件下向成骨细胞分化的能力，采用TRAP（Telomerase repeat amplification protoco1 assay)-银染法测定其端粒酶的活性。结果：分离培养获得的贴壁细胞，碱性磷酸酶染色阳性。流式细胞仪检测CD34、CD45呈阴性表达，CD29、CD44呈阳性表达。经向成骨细胞诱导3周后，可得到成骨细胞，经茜素红染色得到证实。TRAP-银染法证实MSCs表达一定的端粒酶活性。结论：体外分离培养的MSCs可以向成骨分化，表达一定的端粒酶活性，具有干细胞的特性。     

心肌细胞介导骨髓间充质干细胞的心肌样分化

目的探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在不同培养条件下定向分化过程中的生物学特性变化及其机制.方法贴壁法分离大鼠MSCs,培养至第6代.实验分3组:条件培养基组,用新生鼠心肌细胞培养上清液制成的条件培养基处理MSCs48 h 2次,其间间隔48 h;混合培养组,新生鼠心肌细胞和MSCs按1:1的比例混合培养1周;对照组,MSCs常规培养.检测各组MSCs中心肌细胞结构功能蛋白:心肌肌联蛋白(titin)、肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MHC)、心肌组织缝隙连接的特异性组成蛋白质Connexin43(Cx43)的表达情况.结果①条件培养基可诱导MSCs心肌样分化,表达心肌细胞骨架蛋白titin的Z带及A带部分,Cx43大量表达,但在检测期内未观察到MHC的表达;②MSCs在混合培养中与心肌细胞形成连接,表达titin,部分细胞内可检测到类似肌小节的结构,Cx43集中分布于细胞相邻的界面;③对照组中的部分MSCs可少量表达Cx43及titin.结论源于心肌细胞的各种因素可促使MSCs心肌样分化,分化的程度取决于作用信号的性质.