成人急性淋巴细胞白血病患者p73基因异常表达及临床意义

目的 研究p73基因在成人急性淋巴细胞性白血病(ALL)发病机制中的作用及其异常表达的临床意义.方法 30例ALL患者及15例正常人骨髓样本,DNA和RNA抽提后用RT-PCR检测p73基因的表达、甲基化特异性PCR(MSP)检测p73基因第一外显子甲基化状态,并结合临床资料进行分析.结果 9例(30%)ALL患者为p73基因阴性表达,且均存在甲基化,而ALL阳性表达者仅1例存在甲基化;正常对照骨髓均为阳性表达.p73基因的阴性表达与ALL患者的高年龄(≥60岁)、高白细胞数(≥30×109/L)及对治疗反应延迟(>4周取得完全缓解)有关.结论 p73基因异常表达可能在成人ALL的发病机制中起一定作用,有一定的预后意义;其甲基化可能是p73基因在ALL中表达沉默的主要机制.     

喉癌MTS1/P16基因缺失及异常甲基化的研究

目的:研究MTS1/P16基因在人喉癌组织及相应癌旁组织中的变化。方法:采用多重PCR法检测69例患者喉癌组织及相应癌旁组织中MTS1/P16基因的缺失情况;对未检出缺失的标本用甲基化敏感内切酶SmaI消化后再扩增,检测其异常甲基化。结果:在69例患者癌旁组织中未检测到MTS1/P16基因缺失及异常甲基化。69例患者喉癌组织中有17例(24.64%)标本MTS1/P16基因缺失,余52例未检测到MTS1/P16基因缺失的喉癌组织标本有8例(15.38%)检出异常甲基化。结论:MTS1/P16基因变异可能在喉癌的发生、发展中起一定作用。     

喉癌MTSl／P16基因缺失及异常甲基化的研究

目的：研究MTSl／P16基因在人喉癌组织及相应癌旁组织中的变化。方法：采用多重PCR法检测69例患者喉癌组织及相应癌旁组织中MTSl／P16基因的缺失情况；对未检出缺失的标本用甲基化敏感内切酶Smal消化后再扩增，检测其异常甲基化。结果：在69例患者癌旁组织中未检测到MTSl／P16基因缺失及异常甲基化。69例患者喉癌组织中有17例（24．64％）标本MTSl／P16基因缺失，余52例未检测到MTSl／P16基因缺失的喉癌组织标本有8例（15．38％）检出异常甲基化。结论：MTSl／P16基因变异可能在喉癌的发生、发展中起一定作用。     

乳腺癌NOEY2基因启动子区甲基化的研究

目的检测NOEY2基因在乳腺癌发生不同阶段的甲基化状态及其在乳腺浸润性导管癌(IDC)中的mRNA表达水平,探讨NOEY2基因启动子区异常甲基化与乳腺癌发生发展的关系。方法收集2010年1月—2012年1月手术切除乳腺的女性患者标本,其中IDC组46例,乳腺普通型导管增生(UDH)组30例,癌旁正常乳腺组织(NBT)组20例,乳腺原位导管癌(DCIS)组20例,乳腺非典型导管增生(ADH)组13例,采用甲基化特异性PCR(MSP)检测NOEY2基因的甲基化率及水平,分析其与临床病理参数的关系;采用实时定量PCR检测30例IDC中NOEY2基因的mRNA相对表达量,分析NOEY2基因甲基化对其mRNA表达的影响。结果 IDC组的完全甲基化率高于NBT及UDH组(P<0.01);NOEY2基因完全甲基化与乳腺癌患者的临床分期、组织学分级有关(P<0.05),而与年龄、肿瘤大小、ER、PR、HER2无相关性(P>0.05);完全甲基化的IDC标本NOEY2 mRNA表达量低于部分甲基化的IDC标本(P<0.05);IDC中NOEY2基因的甲基化水平与NOEY2基因mRNA表达量呈负相关(r=-0.659,P<0.05)。结论 NOEY2基因启动子区异常高甲基化及其导致的mRNA表达下调在乳腺癌发生发展过程中起重要作用。     

乳腺癌 NOEY2基因启动子区甲基化的研究

目的：检测 NOEY2基因在乳腺癌发生不同阶段的甲基化状态及其在乳腺浸润性导管癌(IDC)中的mRNA 表达水平,探讨 NOEY2基因启动子区异常甲基化与乳腺癌发生发展的关系。方法收集2010年1月—2012年1月手术切除乳腺的女性患者标本,其中 IDC 组46例,乳腺普通型导管增生(UDH)组30例,癌旁正常乳腺组织(NBT)组20例,乳腺原位导管癌( DCIS) 组20例,乳腺非典型导管增生( ADH)组13例,采用甲基化特异性 PCR (MSP)检测 NOEY2基因的甲基化率及水平,分析其与临床病理参数的关系;采用实时定量 PCR 检测30例 IDC 中NOEY2基因的 mRNA 相对表达量,分析 NOEY2基因甲基化对其 mRNA 表达的影响。结果 IDC 组的完全甲基化率高于 NBT 及 UDH 组(P <0．01);NOEY2基因完全甲基化与乳腺癌患者的临床分期、组织学分级有关(P <0．05),而与年龄、肿瘤大小、ER、PR、HER2无相关性(P >0．05);完全甲基化的 IDC 标本 NOEY2 mRNA 表达量低于部分甲基化的IDC 标本(P <0．05);IDC 中 NOEY2基因的甲基化水平与 NOEY2基因 mRNA 表达量呈负相关( r =-0.659,P <0．05)。结论 NOEY2基因启动子区异常高甲基化及其导致的 mRNA 表达下调在乳腺癌发生发展过程中起重要作用。     

大肠癌患者TPEF基因甲基化状态分析

目的 分析大肠癌患者含表皮生长因子和卵泡抑索结构域的跨膜蛋白（TPEF）基因甲基化状态，寻找新的早期诊断大肠癌分子标志物。方法 常规方法提取大肠癌标本DNA，采用甲基化特异性PCR技术分析TPEF基因甲基化状态。结果 32例大肠癌手术切除标本，24例检测到异常TPEF基冈甲基化（75％），而10例正常组织标本无一例检测到异常甲基化。结论 大肠癌患者TPEF基因甲基化为一频繁发生事件，可望成为大肠癌早期诊断的一个标志物。     

胃癌组织中p16基因甲基化水平以及mRNA表达的关系

目的探讨胃癌组织中抑癌基因p16基因甲基化水平与基因表达的关系。方法选取抚顺市中心医院2005至2008年普外切除胃癌标本50例,应用逆转录PCR(RT-PCR)方法及甲基化特异性PCR(MSP)方法分别检测胃癌标本抑癌基因p16的表达及甲基化情况,并探讨二者关系。结果①胃癌原发灶标本中p16基因甲基化率为28%(14/50)。②发生甲基化的胃癌标本mRNA表达量为(0.12±0.05),未发生甲基化的胃癌标本mRNA表达量为(0.77±0.13),下调明显(P<0.01)。结论 p16基因的异常甲基化是胃癌发生、发展过程中的频繁事件。p16基因启动子区CpG岛过甲基化是此基因在胃癌中表达缺失或下调的原因之一,在胃癌的发生发展中起一定作用,可能成为胃癌的早期诊断及治疗靶点基因之一。     

散发性乳腺癌组织BRCA1基因启动子甲基化与蛋白表达的相关性

目的：探讨BRCA1基因启动子甲基化对BRCA1蛋白表达的影响，与散发性乳腺癌发病之间的关系。方法：采用甲基化特异性PCR（MS-PCR）检测51例散发的乳腺浸润性导管癌和10例乳腺良性组织的BRCA1基因启动子甲基化状态，免疫组织化学SP法检测相应组织的石蜡标本BRCA1蛋白表达水平。结果：10例乳腺良性组织中均未检测到BRCA1启动子的异常甲基化，结合免疫组织化学检测，BRCA1蛋白均在细胞核阳性表达，其中70％为强阳性表达；在51例散发性乳腺浸润性导管癌组织中检测到7例BRCA1启动子发生异常甲基化，甲基化比例为13．73％（7／51）；其余44例（44／51，86．27％）未检测到BRCA1启动子甲基化。     

电子支气管镜联合TFPI-2基因甲基化检测对早期肺癌的诊断价值

目的 评价电子支气管镜联合血浆、痰液及支气管肺泡灌洗液(BALF)中组织因子途径抑制物-2(TFPI-2)基因启动子甲基化状态检测对早期肺癌的诊断价值.方法 对可疑早期肺癌患者行电子支气管镜细胞学及病理活检检查,同时对患者的血浆、痰液及BALF三种标本采用甲基化特异性PCR(MSP)方法检测TFPI-2基因甲基化表达情况.结果 48例确诊早期肺癌患者TFPI-2基因异常甲基化阳性率在血浆、痰液及支气管镜灌洗液中分别为39.6％(19/48)、37.5％(18/48)、47.9％(23/48),而在肺部良性病变中只有1例患者的血浆标本检测到了TFPI-2基因异常甲基化,其余标本检测均为阴性(P<0.05).经电子支气管镜确诊20例,敏感度、特异度和准确性分别为41.7％、100％和63.2％.电子支气管镜与TFPI-2基因甲基化联合检测后敏感性、特异性和准确率分别为87.5％、96.4％、90.8％.结论 电子支气管镜检查联合血浆、痰液及支气管肺泡灌洗液TFPI-2基因甲基化检测能提高早期肺癌的检出率,对肺癌的早期诊断有临床应用价值.     

骨关节炎患者关节软骨TIMP-3启动子区甲基化水平的初步研究

目的探讨关节软骨中组织金属蛋白酶抑制因子-3（TIMP～3）基因启动子区甲基化与其蛋白表达的相关性,并分析TIMP一3基因CpG岛异常甲基化与骨关节炎（OA）的关联性。方法应用甲基化特异性的聚合酶链反应（MSP）技术和免疫组织化学SP法分别检测14例健康人的正常关节软骨细胞和35例骨关节炎（OA）患者软骨细胞TIMP-3基因启动子区甲基化和蛋白表达情况。结果OA患者和健康人关节软骨中TIMP-3基因启动子区均有甲基化修饰,其阳性率分别为74.3％（26／35）和35．7％（5／14）,0A组TIMP-3基因启动子区甲基化率明显高于健康组（P〈0．05）。14例健康人中,软骨细胞TIMP-3蛋白表达阳性10例（71．4％）,而35例OA患者中,软骨细胞TIMP-3蛋白表达阳性11例（31．4％）。24例OA患者软骨细胞蛋白表达阴性的标本中．TIMP-3启动子区甲基化阳性21例（87．5％）;26例TIMP-3启动子区甲基化阳性的标本中,蛋白表达阴性21例（80．8％）,TIMP-3启动子区甲基化与蛋白表达呈显著负相关（P〈0．05）。结论启动子区CpG岛高甲基化是OA患者关节软骨细胞TIMP-3表达失活的主要机制之一,其可能参与了OA的发生和发展。     

PCR-SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分支杆菌rpoB,katG,ahpC基因突变的研究

目的：应用PCR－SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分支杆菌rpoB,katG及ahpC基因突变,评价此方法用于结核分杆菌利福平（RFP）及异烟肼（INH）耐药性试验的意义。方法：以结核分支杆菌H37Rv为对照,30例耐RFP（单耐或多耐）、21例耐INH（单耐和多耐）的结核分枝杆菌临床分离株及10例敏感菌株;39例菌阳肺结核患者及30例非结核 性肺部疾病患者痰标本,采用PCR－SS－CP技术检测痰标本和菌株中的结核杆菌rpoB,katG,ahpC基因突变,并与药敏试验对照。结果：PCR－SSCP检测痰标本中结核分支杆菌rpoB,katG及ahpC基因突变的阳性率分别为79％（31／39）、46％（18／39）及5％（2／39）.结论：PCR－SSCP可望成为直接检测临床痰标本中结核分枝杆菌耐利福平及耐异烟肼的快速方法。     

慢性粒细胞白血病bcr/abl基因检测在造血干细胞移植过程中的临床意义

目的探讨慢性粒细胞白血病（CML）bcr/abl基因检测的临床意义,以及移植后治疗效果及预后监测等方面的价值。了解慢性粒细胞白血病融合基因表达、染色体改变及细胞学的改变与临床诊断和治疗的关系。方法采用实时定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测15例CML患者移植前、后bcr/abl融合基因的表达;染色体制备采用骨髓短期培养法,G显带,分析核型。结果对照组bcr/abl基因表达、Ph染色体均为阴性;15例患者移植前：bcr/abl基因表达阳性率为100%（15/15）,表达量范围4.7×104～3.2×108copies/L;Ph染色体分析结果中,13例为Ph（＋）/bcr（＋）,2例为Ph（-）/bcr（＋）。细胞学分析结果 ：呈CML的细胞学改变。移植后1个月bcr/abl融合基因转阴率为80%,2个月转阴率达93%,3个月转阴率达100%。Ph染色体均为阴性。另外,0.5～3年内有13%（2/15）的患者bcr/abl基因表达呈阳性,6%（1/15）的患者Ph（＋）,有复发的阳性指标。结论 bcr/abl基因表达水平的定量检测及动态观察,对CML的临床诊断、移植后疗效判断及预后的监测具有重要意义.     

Effect of methylation-associated silencing of the death-associated protein kinase gene on nasopharyngeal carcinoma

Death-associated protein kinase (DAPK) is a Ca/calmodulin-regulated serine/threonine kinase and a positive mediator of apoptosis. Loss of expression of the DAPK gene by aberrant promoter methylation may play an important role in cancer development and progression. The aim of this study was to investigate the frequency of gene promoter methylation of DAPK in nasopharyngeal carcinoma (NPC) and the effect of 5-Aza-2'-deoxycytidine (5-Aza-CdR), a demethylating agent, on CNE cells, a human nasopharyngeal carcinoma cell line, and on xenografts of CNE cells. Methylation-specific PCR and RT-PCR were used to determine the promoter methylation status and mRNA expression of the DAPK gene in NPC. Furthermore, CNE cells were treated in vitro and in vivo with 5-Aza-CdR to explore the effect of demethylating agents on DAPK mRNA expression and tumor growth. Hypermethylation of the DAPK gene promoter was found in 35 (76.1%) of 46 NPC samples. There was no significant difference in the promoter hypermethylation rate among samples from patients with different TNM stages. No promoter hypermethylation of the DAPK gene was found in all six chronic inflammatory nasopharyngeal tissue specimens. DAPK mRNA expression was not detected in NPC tumor specimens with promoter hypermethylation. However, DAPK mRNA expression was observed in unmethylated NPC tumors and in the chronic inflammatory nasopharyngeal tissue specimens. Promoter hypermethylation of the DAPK gene was found and no DAPK mRNA expression was detected in CNE cells. DAPK mRNA expression in CNE cells and xenografts could be restored by treatment with 5-Aza-CdR. The CNE cell xenografts of nude mice treated with 5-Aza-CdR were obviously smaller in tumor volume than those of nude mice treated with PBS. These results demonstrate that loss of DAPK expression could be associated with promoter region methylation in NPC. 5-Aza-CdR may slow the growth of CNE cells in vitro and in vivo by reactivating the DAPK gene silenced by de novo methylation.     

实时荧光PCR在人乳头瘤病毒临床检测中的应用

目的分析和探讨实时荧光PCR技术在人乳头瘤病毒（HPV）中的检测价值。方法随机选取2010年10月～2011年10月于本院妇产科接受诊治的人乳头瘤病毒感染患者102例,分别使用第二代杂交捕获法（HCⅡ）和实时荧光PCR对102例患者的标本进行检测,结合患者的病理资料对两种检测方法的结果进行比较分析。结果病理资料显示本组病例中宫颈上皮内瘤变（CIN）的有38例,慢性宫颈炎和鳞状上皮病变的36例,HC1I和实时荧光PCR对CIN的HPV阳性检出率分别为86．84％和94．74％,对慢性宫颈炎和鳞状上皮病变的阳性检出率分别为36．11％和58．33％：HCⅡ的HPV总阳性检出率为62．75％,实时荧光PCR为71．57％,两组比较差异具有统计学意义（P〈0．05）,两种方法的总符合率为82．35％;两种手段在高危型宫颈病变的检测具有较好的相关性,实时荧光PCR的灵敏性和特异性要略好于HCⅡ。结论实时荧光PCR和第二代杂交捕获法是临床上检测人乳头瘤病毒的有效方法,实时荧光PCR具有较好的灵敏性和特异性,为宫颈类疾病的早发现和治疗提供可靠的依据。     

结直肠癌中Kiss-1基因启动子甲基化与Kiss-1基因表达的关系

目的：研究结直肠癌中Kiss-1基因启动子甲基化状态对Kiss-1基因表达的影响。方法：应用甲基化特异性PCR （MSP）方法检测73例结直肠癌、正常结直肠组织和人结直肠癌细胞HCT116、SW480、W1116、LoVo中Kiss-1基因启动子甲基化状态,应用realtime-PCR、Western-blot技术检测相应组织和细胞中Kiss-1基因mRNA和蛋白质（Metastine）的表达量。结果：结直肠癌中Kiss-1基因甲基化阳性率（82.19%）高于正常组织（6.31%）（PSW480〉SW1116〉HCT116,差异有统计学意义（p〈0.05）。结论：结直肠癌中Kiss-1基因启动子甲基化可能引起Kiss-1基因表达下调。     

急性髓系白血病CD123表达及其与FLT3-ITD突变的临床意义

目的:探讨急性髓系白血病(AML)患者中CD123表达及其与FLT3-ITD突变同步检测的临床意义。方法:采用流式细胞仪检测32例AML患者CD123表达,聚合酶链反应(PCR)检测FLT3-ITD突变。结果:32例AML中24例CD123表达阳性,阳性率75.0%,对照组表达阴性。CD123+患者诱导化疗完全缓解(CR)率37.5%,低于CD123-患者(75.0%)(P<0.05)。CD123+患者18个月生存率20.8%,低于CD123-患者(62.5%)(P<0.05)。32例AML中有6例FLT3-ITD突变阳性,阳性率18.8%,其中4例伴有CD123表达阳性,均未获完全缓解,生存期6～8个月。结论:CD123可能作为诊断急性髓系白血病独立参考依据之一及评估预后指标。CD123表达阳性及FLT3-ITD突变同时存在的AML患者生存期更短,预后更差。FLT3-ITD突变阳性患者CD123表达阳性率增高,FLT3-ITD突变在CD123+白血病干细胞最终形成中的意义值得深入探讨。     

凋亡抑制基因在急性白血病及骨髓增生异常综合征中的研究

目的探讨急性白血病及骨髓增生异常综合征患者骨髓凋亡抑制基因MCL-1、livin、aven的表达及临床意义。方法选取2012年9月~2013年12月本院收治的113例初发急性白血病患者,32例骨髓增生异常综合征患者及20例对照组患者（缺铁性贫血12例、血小板减少性紫癜8例）的新鲜骨髓液标本,采用RT-PCR方法检测MCL-1、livin、aven基因mRNA的表达水平及表达率。结果 AL组和MDS组MCL-1、livin、aven mRNA表达水平及阳性表达率分别高于对照组,差异有统计学意义（P〈0.05）。MCL-1与livin基因mRNA的表达呈正相关（r=0.586,P〈0.05）,MCL-1与aven基因的表达呈正相关（r=0.603,P〈0.05）,liven基因与aven基因表达无相关性（r=0,P〉0.05）。结论 3种凋亡抑制基因MCL-1、livin、aven基因mRNA在急性白血病及骨髓增生异常综合征中表达均增高。     

应用形态学、核型、免疫学和分子生物学方法联合检测急性髓细胞性白血病M_(2b)的研究

对20例急性髓细胞性白血病（AML）M2b亚型进行了形态学、免疫学、细胞遗传学和分子生物学方法（MICM）的联合检测。结果显示，形态学分型确诊率为90％（18／20），免疫学分析示80％（16／20）有髓系抗原表达，具有其典型特征者为40％（8／20）。染色体异常t（8；21）检出率为95％（19／20），采用RTPCR技术检测全部病例均显示AWL1－ETO融合基因阳性，提示在MICM联合诊断中，融合基因检测对AML－M2b的诊断，治疗及微小残留病监测有重要意义。