重组水蛭素Ⅲ的质量控制标准研究

通过测定重组水蛭素Ⅲ的质粒中目的基因序列、重组水蛭素Ⅲ分子质量、C末端序列以及菌体蛋白和DNA残留量，对重组水蛭素Ⅲ的质量进行研究。结果：重组质粒经Nhe Ⅰ、HindⅢ双酶切和基因序列测定，表明工程菌所携带的质粒上含有完整的信号肽基因、Nhe Ⅰ酶切位点、水蛭素HV3基因和HindⅢ酶切位点；还原性SDSPAGE结果表明在14000 u处有单一条带，为重组水蛭素Ⅲ二聚体；测定样品分子C端序列为E—D—Y—A—D—E—P—I—P—E—F，与重组水蛭素Ⅲ的理论值一致；重组水蛭素Ⅲ样品中的残留菌体蛋白和DNA含量分别是0．02％和每剂量样品中残留DNA含量低于2．8ng。结论：从基因水平、蛋白水平和杂质的角度证明重组水蛭素Ⅲ产品符合质量控制标准。     

重组水蛭素的临床应用及实验室监测

水蛭素是作用很强的凝血酶特性抑制剂,具有抗凝、抗血栓等药理作用。重组水蛭素是国内外正在开发的新一代高效特异性抗凝、抗栓药物,此文概述了重组水蛭素在急性冠状综合征、溶栓疗法、深静脉血栓治疗等中的临床应用及其实验室监测,为我国重组水蛭素的开发及其临床研究提供参考。     

水蛭素及重组水蛭素的研究概况

目的综述水蛭素、重组水蛭素的药理作用与临床应用研究进展,为其临床应用提供参考。方法依据近年采国内外文献,进行分析、归纳和总结。结果与结论水蛭素、重组水蛭素是迄今发现的活性最强的特异性凝血酶抑制剂,通过与凝血酶特异性结合而产生强有力地抑制血液凝固的作用,在心、脑血管系统疾病等方面的抗凝、抗血栓的应用广泛,药物开发前景广阔。     

重组水蛭素抗血栓作用研究进展

水蛭素是从医用水蛭中分离出的一种多肽，它具有抗凝、抗血栓等药理作用。重组水蛭素为其基因工程产物，它与天然水蛭素的药理作用基本相同。本文综述重组水蛭素抗血栓作用的研究进展。     

重组水蛭素的表达纯化及活性检测方法进展

作为直接凝血酶抑制剂，重组水蛭素在临床上的应用已越来越重要。文章综述了重组水蛭素的表达、分离纯化及其理化性质和活性检测方法的进展。     

水蛭素的给药途径及其相关剂型研究进展

作为一种抗凝防栓良药，水蛭素（hirudin）特别是重组水蛭素的研究日益深入。针对水蛭素存在的一些缺陷，如半衰期短、临床应用时还存在一定的出血危险、预防动脉血栓的效果并不理想等，一些新的水蛭素衍生物、重组水蛭素模拟肽都在研发中，同时对水蛭素的不同给药途径／方式及新剂型的研究也在深入开展。现结合水蛭素的药动学／药效学特征、药理作用等方面的研究对水蛭素（包括重组水蛭素）的不同给药途径，尤其是非注射给药途径如口服、肺部、鼻腔、眼部给药等，以及相关剂型如大分子结合物注射给药缓释系统、壳聚糖一藻酸盐或PEG．藻酸盐微囊、鼻腔喷雾剂、缓释微丸、PLGA微球等的研究进展进行综述，以期为水蛭素的进一步临床应用提供科学依据。     

Lepirudin—抗凝血重组水蛭素

水蛭秦是抗凝血多肽，原先是从水蛭（Ｈｉｒｕｄｏ ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ）涎腺中获得的。在弄清其多肽结构后，人们用基因技术生产各种水蛭素，并进行临床研究。Ｌｅｐｉｒｕｄｉｎ是一种重组水蛭素，这在疗效和特异性方面性与水蛭水水蛭素没有本质区别。１９９７年春，Ｌｅｐｉｒｕｄｉｎ（Ｒｅｆｌｕｄａｎ＾Ｒ）被批准用于免疫介导、肝素诱发的血小板减少（Ⅱ型）和血栓栓塞性并发症患者抑制凝血，从而提供了新一类抗凝剂代表     

抗体夹心酶免疫吸附法测定重组E.coli水蛭素HV3研究

将重组E. coli水蛭素HV3和BSA交联后免疫豚鼠和家兔,DEAE-纤维素柱层析纯化IgG.用这两种抗体和酶标二抗羊抗兔IgG-HRP建立三抗体夹心酶联免疫吸附法,测定重组E. coli水蛭素HV3的含量.本测定方法的线性范围为0～2 ng/ml,灵敏度为0.04 ng/ml.建立的三抗体夹心酶联免疫吸附法测定重组E.coli水蛭素HV3具有良好的精密度、回收率、灵敏度和特异性.     

重组水蛭素的表达和纯化及临床应用进展

重组水蛭素为基因工程的产物,与天然水蛭素有相同的功效,为新一代高效安全的抗凝、防栓药物.文中综述了重组水蛭素的表达、纯化及临床应用的研究.     

水蛭素及其衍生物研究进展及展望

天然水蛭素是含有65—66个氨基酸残基的无糖基化单链多肽,分子质量约为7 000 u,由医用水蛭的唾液中分离得到,是凝血酶的特异性抑制剂,在临床治疗血栓疾病中有着重要意义。近年来多种水蛭素的衍生物被成功的开发出来,本文就重组水蛭素的研究进展进行了综述,并对其应用前景进行了展望。     

PCR方法在水蛭素基因克隆方面的新应用

目的应用PCR方法获得水蛭素基因。方法在传统PCR方法的基础上进行了改进 ,根据已知天然水蛭素基因序列 ,设计了一对 12 3nt且 3′端具有 15nt互补序列的单链DNA ,通过低温复性使其互补结合后 ,进行延伸反应 ,得到微量双链水蛭素基因。再以该基因作为模板设计一对引物 ,进行常规PCR扩增反应。结果获得水蛭素基因。结论此法对于获得象水蛭素基因这类序列已知、片段不太长 ,且不易得到的基因提供了一种可行方法     

口服重组水蛭素抗凝、抗血栓作用的实验研究

目的:探讨口服重组水蛭素的抗凝、抗血栓的作用.方法:将24只Beagle犬,随机分为水蛭素大、中、小剂量组剂量分别为(600,300,150 AUT/kg)和空白对照组,每组6只.各试验组动物均经口给药,分别于给药前、达稳态前和达稳态后取血1～4 mL,测定凝血时间(CT)、血浆凝血酶原时间(PT)、凝血酶凝固时间(TT)、纤维蛋白原(FBG)、活化部分凝血活酶时间(APTT);同时采用下腔静脉结扎法制作血栓模型,计算深静脉血栓形成百分率和血栓重量.结果:各用药组CT,PT,TT,APTT值与空白对照组均有差异或显著差异(P＜0.05或P＜0.01),给药对FBG没有明显影响;深静脉血栓形成百分率和血栓重量也有差异或显著差异.结论:口服重组水蛭素具有很强的特异性凝血酶抑制作用,同时具有抗凝、抗血栓作用,可用于防治实验性深静脉血栓形成.     

Construction and in vitro testing of a novel fab-hirudin-based fusion protein that targets fibrin and inhibits thrombin in a factor xa-dependent manner

Fibrin targeting of the thrombin inhibitor hirudin via chemical coupling is effective in vitro and in vivo. However, since chemical coupling has limitations, a recombinant approach was taken to improve the fibrin-targeting ability of hirudin. Additionally, to activate hirudin selectively at the target area and thereby limit side effects in an in vivo setting, the authors aimed to construct an inactive precursor molecule that is converted into an active thrombin inhibitor only upon cleavage by factor Xa. Using PCR, the coding region for hirudin was fused to parts of the genomic DNA of the IgG heavy chain that was cloned from the antifibrin antibody-producing hybridoma cell line 59D8. Additionally, a factor Xa recognition site was introduced between the antibody and the hirudin sequence. The fusion construct was then transfected into a heavy-chain loss variant of the hybridoma cell line 59D8. After selection of stable hybridoma clones, the expressed fusion protein was evaluated for its molecular size (57 kd) and its binding ability to the fibrin-specific peptide Bbeta 15-22. The cleavage of the fusion protein by factor Xa was demonstrated by HPLC. The recombinant anticoagulant revealed antithrombin activity only after cleavage by factor Xa. Thus, the newly designed hirudin fusion protein revealed the anticipated functions in vitro. Further experiments are needed to prove whether this precursor anticoagulant allows a highly clot-specific and efficient thrombin inhibition in vivo.     

多拷贝水蛭素基因在毕赤酵母中的分泌型表达

目的:通过多拷贝克隆技术实现水蛭素(Hirudin)基因在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达.方法:利用基因重组技术,从pPIC9-Hirudin中扩增α-facor-Hirudin插入到载体pA0815中,并构建pA0815-(α-Hirudin)n多拷贝重组质粒,转化毕赤酵母GS115后进行诱导表达,并鉴定表达产物活性.结果:PCR证实成功构建了水蛭素多拷贝毕赤酵母表达载体pA0815-(α-Hirudin)n,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳证实能成功高效分泌重组水蛭素,活性测定表明表达的水蛭素有良好的抗凝血活性.结论:成功构建了分泌型水蛭素多拷贝质粒,筛选出多拷贝稳定整合表达菌株,成功表达出具有抗凝血活性的1 600 ATU/mL重组水蛭素,为大规模表达纯化水蛭素蛋白及其临床应用奠定了基础.     

重组水蛭素治疗兔弥散性血管内凝血

目的:观察重组水蛭素对治疗脂多糖致兔弥散性血管内凝血模型的抗凝疗效。方法:建立兔脂多糖弥散性血管内凝血模型,18只新西兰大白兔随机分为3组,静脉注射脂多糖的同时分别予生理盐水、普通肝素和重组水蛭素,于注射脂多糖前,注射后2,4,6h检测血小板计数、活化部分凝血活酶时间、抗凝血酶Ⅲ、纤维蛋白原、血清纤维蛋白降解产物(FDP);并观察心、肺脏器的病理变化。结果:模型组兔活化部分凝血活酶时间明显延长,血小板计数和纤维蛋白原显著降低,抗凝血酶Ⅲ活性明显下降,与肝素组相比重组水蛭素组血小板和纤维蛋白原消耗减少,抗凝血酶Ⅲ活性下降程度减轻。所有实验动物血清FDP变化无统计学差异。病理检查模型组心、肝、肺、肾、脾脏可见微血栓形成,重组水蛭素组均未见微血栓形成。结论:重组水蛭素具有明显的抗凝作用,可有效治疗弥散性血管内凝血。     

重组水蛭素肠溶包衣微丸的制备及体外释放行为考察

目的研制重组水蛭素口服肠溶包衣微丸,并对其在不同pH释放介质中的释放行为进行考察,为重组水蛭素口服制剂的研究与开发提供实验依据。方法以羟丙甲基纤维素酞酸酯(HP55)为包衣材料,利用离心造粒机和流化床包衣设备制备重组水蛭素肠溶包衣微丸;采用二喹啉甲酸(BCA)法测定重组水蛭素肠溶包衣微丸的药物含量。结果所制备的重组水蛭素肠溶包衣微丸药物含量质量分数为3.513%。pH梯度释放实验结果表明,所研制的包衣微丸人工胃液中2 h药物仅释放4.98%;pH 5.8释放介质中继续释放,0.5 h释放82.13%,1 h释放95.47%;pH 7.2释放介质中继续释放,0.5 h释放97.53%,1 h释放98.33%。结论重组水蛭素肠溶包衣微丸在人工胃液中几乎不释药,可避免水蛭素被胃蛋白酶所降解;在人工肠液中药物释放快速而且完全,有利于水蛭素在肠道中的吸收。     

重组汉坦病毒核蛋白的原核表达及纯化

目的 原核表达重组汉滩型病毒(Hantaan virus,HTNV)核蛋白(recombinant HTNV nuclearprotein,rHTNNP)和重组汉城型病毒(Seoul virus,SEOV)核蛋白(recombinant SEOV nuclear protein,rSEONP),并进行纯化.方法 从HTNV PS-6株和SEOV L-99株灭活病毒液中提取总RNA,依据病毒S片段多变区基因序列两端保守序列设计引物,用逆转录PCR法扩增此S基因片段,构建原核表达质粒pET-Trx-his-HTNNP和pET-Trx-his-SEONP,并在大肠埃希菌中诱导表达.表达产物经凝胶电泳初步鉴定和镍柱亲和层析纯化后,用双向免疫扩散试验检测其抗原特异性.结果 重组表达质粒经菌落PCR分析和测序证明构建正确.表达的rHTNNP和rSEONP相对分子质量约为26 000,表达量分别约占菌体总蛋白的30％和20％,主要以可溶性形式表达,且纯度可达约70％.双向免疫扩散试验证实,这2种重组蛋白具有较好的抗原性.结论 成功构建了表达rHTNNP和rSEONP的原核表达质粒,并获得了较高纯度的rHTNNP和rSEONP,为汉坦病毒型别鉴定试剂盒的开发奠定了基础.     

A recombinant peptide, hirudin, potentiates the inhibitory effects of stealthy liposomal vinblastine on the growth and metastasis of melanoma

The metastasis of tumor cells is one of the major obstacles to successful clinical therapy. A treatment strategy by incorporating a specific inhibitor of thrombin, recombinant hirudin with stealthy liposomal vinblastine, was used in this study for inhibiting the metastasis of tumor cells and enhancing the efficacy of anti-tumor agents. In vitro cytotoxicity, cell adhesion to extracellular matrix (ECM) proteins, and cell invasion and migration assays were performed on human A375 melanoma cell line. In vivo measurement of coagulation parameters, inhibition of tumor growth, and inhibition of metastasis were assessed in female BALB/c mice. In vitro, vinblastine or stealthy liposomal vinblastine alone was effective to inhibit the growth of A375 cells. On the contrary, hirudin had no influence on either cytotoxicity when treating with hirudin alone or hirudin plus vinblastine. In addition, in vitro results showed that hirudin had no impact on the adhesion of tumor cells to extracellular matrix proteins, and metastasis and invasion of tumor cells. In mice, hirudin significantly inhibited the activity of thrombin. Furthermore, administered at the initial implantation of murine B16 melanoma cells, hirudin evidently delayed the growth of tumor, and depressed the occurrence of experimental lung metastasis. A subsequent administration of stealthy liposomal vinblastine resulted in further inhibiting growth and metastasis of tumor, indicating that hirudin plus stealthy liposomal vinblastine exhibited a significant anti-metastasis effect and slightly potent effect against tumor growth as compared with stealthy liposomal vinblastine alone. In conclusion, administration of recombinant hirudin followed by giving stealthy liposomal vinblastine may be beneficial for inhibiting the growth and metastasis of melanoma in vivo. The likely mechanism could be associated with inhibition of thrombin after administration of hirudin.     

蝮蛇蛇毒类凝血酶的研究

为研制蝮蛇抗栓酶的换代产品，开发单一组分的类凝血酶制剂。采用离子交换和亲和层析等现代纯化方法，从东北白眉蝮蛇蛇毒中分离出了单一组分的类凝血酶。半成品经高效液相色谱凝胶柱测定，纯度大于90％，最高可达97.94％，分子量38200D，SDS－PAGE电泳测定为一条带，分子量为42100D，活性为1137BU／mg，比活性为1705BU／mg·pro，不含出血毒和神经毒，冻干成品制剂全部符合注射用品标准。