α7nAChR基因敲除HIV-1gp120转基因小鼠模型的构建

目的 通过构建双基因编辑小鼠模型（α7R-/-/gp120+）,为探索α7乙酰胆碱受体（α7 nAChR）介导gp120中枢神经毒性的作用和机制提供研究基础。方法 α7 nAChR基因敲除小鼠（α7R-/-）与HIV-1 gp120转基因小鼠（gp120+）杂交（F0）,从产生的F1小鼠中,选取基因型为α7R+/-/gp120+的小鼠进一步交配,得到F2小鼠。PCR法鉴定和筛选F3小鼠基因型,免疫组化分析双转基因动物模型蛋白表达;体外实验使用gp120蛋白和α7 nAChR抑制剂处理小胶质细胞,ELISA检测各组IL-1β与TNF-α表达情况。结 果 F3小鼠的PCR结果符合预期,其中有2只双基因编辑成功的小鼠。免疫组化结果显示双基因编辑小鼠（α7R-/-/gp120+）的脑组织缺乏α7 nAChR的同时高表达gp120蛋白。体外实验结果表明Gp120可促进小胶质细胞分泌IL-1β与TNF-α,而抑制α 7nAChR后IL-1β与TNF-α表达明显降低（P<0.001）。结论 α7R-/-/gp120+双基因修饰小鼠成功构建,且具有稳定遗传的特点,可为后续探索α7 nAChR介导gp120中枢神经毒性的作用和机制提供重要的动物模型。     

Tg（CD4-EGFP）；LFA-1^-/-基因工程小鼠模型的构建

目的构建并繁殖T细胞表达绿色荧光蛋白的LFA-1基因敲除小鼠[Tg（CD4-EGFP）;LFA-1^√-]。方法将CD4-EGFP转基因小鼠与LFA-1基因敲除小鼠杂交并将其子代相互杂交,提取小鼠尾部DNA,用PCR法鉴定基因型。根据孟德尔定律,可得到Tg（CD4-EGFP;LFA-1^√-）小鼠。结果Tg（CD4-EGFP）;LFA-1。小鼠的构建、饲养繁殖均获得成功。结论成功获得了T细胞表达绿色荧光蛋白的LFA-1基因敲除小鼠。     

支架蛋白JLP基因敲除小鼠的构建及其肾脏表型的初步观察

目的 繁殖和鉴定支架蛋白JLP基因敲除小鼠,对其肾脏表型进行初步观察。方法 将JLP基因敲除杂合小鼠进行配种繁殖,提取子代小鼠的组织DNA,用PCR技术检测小鼠的基因型,并用Western blot法验证基因敲除效果。通过PAS病理染色等观察肾脏微观结构。结果 成功繁殖并获得子代小鼠,子代小鼠有3种基因型,包括纯合子（JLP+/+、JLP-/-）和杂合子（JLP+/-）。PCR检测基因型的方法方便且结果准确。结论 笔者成功建立了JLP基因敲除小鼠模型,能够进一步探究发现JLP基因对生物体的作用及机制。     

Change of anxious behavior and hypothalamic-pituitary-adrenal axis in serotonin transporter knockout mice under stress

目的 研究5-羟色胺转运体( serotonin transporter,SERT)敲除小鼠焦虑行为及ACTH和皮质酮分泌变化.方法 将基因型为SERT+/-的雌雄小鼠交配产子,并把鉴定后子代小鼠按基因型(SERT+/+、SERT+/-、SERT -)分为对照组和EPM组,每组15只.利用高架十字迷宫作为应激原刺激小鼠,观察各组小鼠的焦虑行为,并测定各组小鼠的ACTH和皮质酮分泌.结果 ①基因型PCR成功鉴定SERT+/+、SERT+/-和SERT-/-的小鼠.②SERT+/-和SERT - -小鼠的开臂停留时间、开臂停留时间百分比、进入开臂的次数和进入开臂的次数百分比较SERT+/+均显著降低(P＜0.05,P＜0.01).③EPM刺激下,SERT+/-和SERT-/-小鼠ACTH分泌的增加显著高于SERT+/+(P＜0.05),SERT-/-小鼠皮质酮分泌的增加显著高于SERT+/+ (P ＜0.05).结论 SERT敲除小鼠在应激条件下易产生焦虑,并且ACTH和皮质酮分泌显著升高.     

波形蛋白对EV71感染小鼠脑组织引起NLRP3炎性小体活化的影响

目的观察肠道病毒71型（EV71）感染的小鼠中枢神经系统中波形蛋白（VIM）介导NLRP3炎性小体的活化。方法取3~ 5 d龄的VIM基因敲除型乳鼠（VIM-/-）40只,随机分为EV71感染实验组和空白对照组,20只/组,实验组每只腹腔注射浓度为1× 108半数组织培养感染剂量（TCID50）病毒液10 μL,空白组腹腔注射无菌PBS 10 μL,再将同品质的野生型乳鼠（WT）40只以同样 方式分组处理。观察小鼠感染状态1周,提取小鼠脑脊液（CSF）和脑组织全蛋白、RNA及组织切片,通过Western blot、ELISA、 RT-PCR检测小鼠中枢神经系统的炎症小体激活状况,以及免疫组化技术考察小鼠中枢神经系统的损伤。结果与空白组比 较,VIM-/-实验组小鼠在感染EV71 后CSF 和脑组织中NLRP3 炎症小体及其下游产物IL-1β、caspase-1 含量无明显变化;而 WT实验组小鼠相较VIM-/-型实验组的NLRP3、IL-1β和caspase-1含量显著升高（P<0.05）;同时WT型实验组IL-1β和caspase-1 的mRNA拷贝数亦明显高于VIM-/-型实验组小鼠（P<0.05）;VIM-/-感染EV71 的脑组织神经元受损程度较WT小鼠明显轻微 （P<0.05）。结论EV71通过感染小鼠脑组织诱发VIM基因介导的NLRP3炎症小体活化,释放IL-1β和caspase-1,这可能是中枢 神经系统炎症和神经元损伤的原因之一。     

5-羟色胺转运体敲除小鼠在应激下焦虑行为和HPA轴的改变

目的研究5-羟色胺转运体(serotonin transporter,SERT)敲除小鼠焦虑行为及ACTH和皮质酮分泌变化。方法将基因型为SERT+/-的雌雄小鼠交配产子,并把鉴定后子代小鼠按基因型(SERT+/+、SERT+/-、SERT-/-)分为对照组和EPM组,每组15只。利用高架十字迷宫作为应激原刺激小鼠,观察各组小鼠的焦虑行为,并测定各组小鼠的ACTH和皮质酮分泌。结果①基因型PCR成功鉴定SERT+/+、SERT+/-和SERT-/-的小鼠。②SERT+/-和SERT-/-小鼠的开臂停留时间、开臂停留时间百分比、进入开臂的次数和进入开臂的次数百分比较SERT+/+均显著降低(P<0.05,P<0.01)。③EPM刺激下,SERT+/-和SERT-/-小鼠ACTH分泌的增加显著高于SERT+/+(P<0.05),SERT-/-小鼠皮质酮分泌的增加显著高于SERT+/+(P<0.05)。结论 SERT敲除小鼠在应激条件下易产生焦虑,并且ACTH和皮质酮分泌显著升高。     

Mafb基因敲除小鼠的构建及其尿道下裂表型初步分析

目的 利用成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)/重组CRISPR相关核酸酶9(CRISPR-associated protein 9, Cas9)构建Mafb基因敲除小鼠,初步研究该基因缺失对尿道发育的影响。方法 根据CRISPR/Cas9技术原理构建Mafb基因杂合子（Mafb+/-）F1代小鼠,裂解鼠尾提取DNA,PCR法扩增目的基因片段,琼脂糖凝胶电泳判定基因型结果。使Mafb+/- F1代小鼠与野生型（wild type, WT）C57BL/6J小鼠交配繁殖。将获得的Mafb+/-小鼠间进行交配,获得Mafb基因敲除纯合子（Mafb-/-）雄性胎鼠。免疫荧光验证Mafb-/-胎鼠阴茎组织中Mafb基因表达情况;扫描电镜及石蜡切片HE染色观察Mafb-/-胎鼠阴茎组织形态,免疫荧光检测胎鼠阴茎组织尿道缝处细胞E-Cadhrin和α-SMA的表达情况。结果 成功构建、繁育Mafb+/-小鼠,保持种群数量并得到Mafb-/-雄性胎鼠,PCR法成功鉴定基因型。免疫荧光结果显示Mafb-/-胎鼠阴茎组织中几乎不存在Mafb蛋白表达,且相较于WT型,尿道缝处细胞E-Cadhrin蛋白表达明显降低,α-SMA蛋白表达明显增高;扫描电镜及HE染色显示Mafb-/-雄性胎鼠为尿道下裂表型。结论 成功构建 Mafb基因敲除小鼠模型,确定其敲除可导致小鼠出现尿道下裂表型,发现尿道缝处细胞中E-Cadhrin和α-SMA的表达差异,为进一步研究该基因在尿道下裂发生机制中的作用提供基础。     

条件性胰岛β细胞CASK基因敲除小鼠的构建及鉴定

目的：构建条件性胰岛β细胞钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶（calcium/calmodulin?dependent serine protein kinase,CASK）基因敲除小鼠,为研究CASK基因在糖尿病发生中的机制提供动物模型。方法：将CASKloxp/- 雌鼠与CASKloxp/Y雄鼠杂交,获得基因型为CASKloxp/loxp雌鼠、CASKloxp/Y雄鼠;再让条件性胰岛β细胞特异性表达Cre重组酶雄鼠与CASKloxp/loxp雌鼠杂交获得CASKloxP/YMIP?Cre雄鼠和CASKloxP/-MIP?Cre雌鼠。CASKloxP/YMIP?Cre基因型小鼠即为本实验所需要构建的模型小鼠。小鼠生后1~2周剪尾,通过PCR鉴定小鼠基因型,4~5周龄时腹腔注射他莫昔芬诱导Cre重组酶表达后,利用实时荧光定量PCR、蛋白质印迹技术验证CASK基因敲除效果。结果：从引进这两种小鼠开始,繁殖10个月,共获得基因型为CASKloxP/YMIP?Cre的雄鼠28只,PCR 结果证实小鼠基因型符合CASKloxP/YMIP?Cre。实时荧光定量PCR、蛋白质印迹结果显示CASKloxP/YMIP?Cre小鼠胰岛CASK表达量明显下降。结论：利用 Cre/loxp系统,成功构建了条件性胰岛β细胞CASK基因敲除小鼠,为在动物水平研究CASK基因在糖尿病发病机制中的作用提供了研究平台。     

利用基因打靶技术构建血管内皮特异性Stk24/25双基因敲除小鼠

目的:构建Stk24/Stk25双基因敲除小鼠模型,并对其基因型及敲除效率进行测定。方法:使用基因打靶技术构建基因敲除小鼠,利用PCR及凝胶电泳技术对亲代及子代小鼠进行基因型鉴定;并利用ＲT-qPCＲ测定目的基因在小脑血管内皮细胞中mＲNA转录水平的表达情况。结果:通过PCR技术成功检测出小鼠子代基因型Cdh5cre+/Stk24fl/fl/Stk25fl/fl纯合子小鼠,经鉴定血管内皮基因敲除Stk24、Stk25后表达量分别下降了27%（t=2.874,P=0.0207）和30%（t=17.21,P<0.001）。结论:采用基因打靶技术成功构建了Stk24/Stk25双基因敲除小鼠。     

gp120转基因小鼠制备及初步鉴定

目的构建HIV-1B’亚型gp120转基因载体,制备gp120转基因小鼠。方法扩增gp120全长序列,根据读码框架定向连接到pSEAP2-control外分泌性真核表达载体上,插入GFAP启动子,回收含启动子-gp120-增强子的功能片段制备转基因小鼠,PCR和RT-PCR验证基因整合与mRNA转录。结果酶切鉴定与测序验证均证明构建了受GFAP启动子调控的gp120转基因载体,蛋白印迹分析显示其分泌性和组织特异性都很高;RT-PCR证实转基因小鼠存在gp120mRNA转录。结论成功构建了gp120转基因载体,并生产了founder小鼠。     

IFN-γ与HIV-1gp120融合蛋白的表达及其免疫调节作用

目的：研究gamma干扰素（IFN-γ）对人类免疫缺陷病毒（HIV-1）gp120蛋白免疫小鼠后效果的调节作用。方法：利用分子生物学技术，构建表达中国流行株HIV-1gp120N端片段基因的原核质粒pet44b-gp120，及共表达HIV-1gp120N端片段基因与IFN-γ基因的原核质粒pet44b-gp120／IFN-γ，在E．coli BL21（DE3）细胞中进行低温诱导蛋白表达，然后经纯化后免疫BALB／c小鼠。实验设皮下注射gp120／IFN-γ组、gp120组和PBS三组，以检测HIV-1gp120诱导的T细胞增殖能力，CTL杀伤作用以及Th1型细胞因子（IL-2，IFN-γ）和Th2型细胞因子（IL-4，IL-10）的表达情况。结果：通过PAGE和Western blot检测，证实上述两种蛋白在DE3细胞中得到表达。免疫学实验表明，针对HIV-1gp120的特异性T淋巴细胞增殖作用、特异性CTL杀伤作用，以及Th1型细胞因子IL-2和IFN-γ表达在三组之间均有显著性差异（P〈0．05），gp120／IFN-γ组高于gp120组，gp120组高于PBS组（P〈0．05）。反映体液免疫反应的Th2型细胞因子IL-4和IL-10的表达在三组之间没有显著性差异（P〉0．05）。结论：协同应用IFN-γ基因可明显加强HIV-1gp120基因的细胞免疫反应。     

采用CRISPR/Cas9技术构建新品系HBeAg转基因小鼠

目的培育一种HBeAg转基因小鼠新品系。方法克隆乙型肝炎病毒HBeAg基因;采用CRISPR/Cas9技术,通过同源重 组的方式分别在Rosa26基因位点定点插入pliver-HBeAg表达框,获得含有HBeAg基因的表达载体pliver-HBeAg,经酶切得到 含有HBeAg基因的线性DNA 片段,将Cas9 mRNA、gRNA和donor vector显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,再将其移植 入C57BL/6J雌性代孕小鼠子宫,获得F0代建系小鼠;采用长片段PCR对出生小鼠进行鉴定,共获得HBeAg基因正确同源重组 的F0代建系小鼠;F0代阳性小鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配,繁育获得F1代小鼠,经PCR鉴定及测序确认阳性F1代小鼠;将 携带HBeAg基因的F1代转基因小鼠再次回交,对子代小鼠进行PCR基因型鉴定,直至获得纯合子子代转基因小鼠;采用全自 动化学发光免疫分析仪、胶体金法和免疫组织化学方法分别检测HBeAg转基因鼠血浆和肝组织中HBeAg和HBeAb的表达。 结果采用CRISPR/Cas9技术共获得56只F0代小鼠,其中2只为正确同源重组的F0代小鼠;F1代小鼠中6只阳性F1代小鼠。 截至目前,共获得22只F2代纯合子和29只杂合子HBeAg转基因小鼠。所有HBeAg转基因小鼠外周血中均可检出高浓度的 HBeAg蛋白,但未检出HBeAb的表达。而且免疫组化结果显示HBeAg转基因小鼠肝脏肝细胞中可特异性表达HBeAg蛋白。 结论采用CRISPR/Cas9技术成功构建了能在肝脏肝细胞中稳定表达HBeAg蛋白且对HBeAg免疫耐受的新品系HBeAg转基 因小鼠,为HBV的研究提供了新的实验动物模型。     

HIV-1B亚型包膜糖蛋白gp120基因真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的克隆人类免疫缺陷病毒Ⅰ型B亚型包膜糖蛋白gp120基因,构建真核表达载体,并在真核细胞中表达,进一步为制备自行设计的以λ噬菌体作为载体的HIV核酸疫苗奠定基础。方法以克隆好的HIV-1B亚型U26942全基因质粒DNA作为模板,根据Genbank中gp120基因的核苷酸序列设计引物,并在引物的5'端分别引入BamHⅠ及XhoⅠ酶切位点,特异性地扩增gp120基因。TA克隆后经双酶切、测序等鉴定重组质粒,再经双酶切、连接构建含gp120编码基因的真核表达载体,并进行酶切鉴定分析pcDNA3.1( )/gp120。在脂质体介导下转染HepG2细胞,经G418压力筛选建立稳定转染gp120基因的细胞系,用RT-PCR及Westernboltting检测其在HepG2细胞中的表达。结果重组质粒经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切成5.4kb与1.44kb的片断,表明表达载体pcDNA3.1( )中插入了gp120基因片断,测序结果表明编码框正确。RT-PCR及Westernblotting证实稳定转染gp120基因的HepG2细胞系中有该基因的表达。结论成功构建了HIV-1B亚型包膜糖蛋白gp120基因的真核表达载体pcDNA3.1( )/gp120,并在HepG2细胞中获得稳定表达。     

SBi4211通过抑制S100B/RAGE表达减轻gp120诱导的中枢神经损伤

目的 研究S100B 抑制剂SBi4211（heptamidine）在人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1）包膜蛋白gp120损伤中枢神经系统的作用。方法 通过U251细胞和SH-SY5Y细胞建立非接触式星形胶质细胞-神经元共培养体系,由gp120蛋白处理U251细胞激活神经炎症反应造成神经元损伤,体外水平探讨SBi4211在gp120诱导的中枢神经毒性中的作用;体内实验中,以8月龄gp120转基因小鼠模拟HIV相关神经认知障碍（HAND）模型,实验分为对照组、gp120组以及gp120+SBi4211组（SBi4211处理组）。采用CCK-8、流式细胞术检测神经元活性及凋亡情况,ELISA检测S100B及炎症因子IL-6、TNF-α表达水平,Western blot和免疫组织化学染色分析RAGE、GFAP、NeuN、Syn、MAP-2蛋白表达情况。结果 体外实验结果显示SBi4211可以显著抑制gp120刺激后U251细胞S100B、RAGE的表达（P<0.001）,降低炎症因子iNOS、IL-6和TNF-α的表达水平（P<0.001）,维持神经元相关标记蛋白NeuN、Syn的表达（P<0.001）。体内实验结果显示SBi4211显著降低gp120转基因小鼠S100B、RAGE表达及炎症水平（P<0.05）,并且抑制脑内星形胶质细胞活化,保护神经元的完整性（P<0.05）。结论 SBi4211可能通过下调S100B/RAGE表达,抑制gp120引发的神经炎症反应,继而阻断gp120的中枢神经毒性作用。     

Identification and distribution of the clinical isolates of imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa carrying metallo-β-lactamase and/or class 1 integron genes

To investigate the distribution of the genes of two major metallo-β-1actamases （MBL;i.e.,IMP and VIM） and class 1 integrons （intI） in the clinical imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa, a total of 65 isolates, from a university hospital in Sichuan between December 2004 and April 2005 were screened for MBL genes by PCR using primers specific for blaIMP-1, blaVIM and blaVIM-2 genes. The MBL-positive isolates were further assessed for class 1 integrons by PCRusing specific primers. The nucleotide sequences of several PCR products were also determined. The results revealed that the blaVIM gene was found in 81.5% （53/65） of all isolates, blaVIM-2 gene was found in only 1 isolate and the intl gene was observed in 45.3% （24/53） of blaVIM-positive isolates. One isolate carried simultaneously both blaIMP-1 and intl genes, and to the best of our knowledge this is the first report of such isolate in southwest China. These observations highlight that the genes for VIM β-1actamase and class 1 integrons were predominantly present among the imipenem-resistant P. aeruginosa tested, confirming the current widespread threat of imipenem-resistant, integron-borne P.aeruginosa.     

SORL1基因敲除小鼠可作为散发性阿尔茨海默病模型

目的通过与正常小鼠、淀粉样前体蛋白（APP）/PSE1双转基因小鼠行为学和病理学的比较,证明SORL1敲除小鼠可作为 1 种散发性阿尔茨海默病模型。方法Crispr/Case9 技术对小鼠受精卵SORL1 基因进行编辑,通过检测小鼠DNA序列和 Western blot检测SORL1等方法筛选和鉴定SORL1-/-小鼠。实验分为对照组、SORL1-/-组、APP/PSE1组。Morris水迷宫检测小 鼠的学习记忆能力、免疫组化和Western blot分别检测小鼠脑组织中APP、β淀粉样蛋白的表达。结果SORL1-/-小鼠的DNA测 序结果是两条染色体SORL1基因CAAT碱基缺失,而正常小鼠SORL1基因无CAAT碱基的缺失;Western blot检测SORL1-/-组 小鼠脑组织无SOLR1表达。在Morris水迷宫的定位航行实验中,与对照组比较,SORL1-/-组和APP/PSE1组小鼠平均逃避潜伏 期均明显延长（P<0.05）,SORL1-/-组和APP/PSE1组比较,小鼠的平均逃避潜伏期差异无统计学意义（P>0.05）;在Morris水迷宫 的空间探索实验中,与对照组比较,SORL1-/-组和APP/PSE1组小鼠平均穿越平台次数均减少（P<0.05）,SORL1-/-组和APP/PSE1 组比较,小鼠平均穿越平台次数差异无统计学意义（P>0.05）。免疫组化和Western blot检测结果均显示SORL1-/-组小鼠脑组织 中APP和Aβ表达明显较对照组多,SORL1-/-组与APP/PSE1 组脑组织的APP和β淀粉样蛋白表达差异无统计学意义。结论 SORL1-/-小鼠可出现APP/PSE1小鼠相似的行为学和病理学的改变,可作为一种散发性阿尔茨海默病模型。