Sca-1^＋造血干/祖细胞重建致死剂量辐射小鼠造血功能的作用

背景：近年来,造血干细胞移植在国内外已广泛开展,移植的造血干细胞能否有效重建造血成为造血干细胞移植领域的研究热点问题之一。目的：观察Sca-1＋造血干/祖细胞（hematopoietic stem/progenitor cell,Sca-1＋HSC/HPC）对造血衰竭小鼠造血功能重建的作用。方法：雌性C57BL/6受体鼠给予致死剂量60Coγ射线照射后分2组,对照组：输注无菌PBS;移植组：移植免疫磁性分选法分离纯化的同系雄性C57BL/6小鼠Sca-1＋HSC/HPC;检测受体鼠生存时间;外周血白细胞、红细胞比容、血小板的变化;脾湿质量及脾集落数;PCR检测Y染色体（Sry基因）表达确定受体小鼠重建造血的细胞来源。结果与结论：移植组受体鼠30d存活率、白细胞、红细胞比容、血小板、脾湿质量及脾集落数均明显高于对照组（P〈0.05）;Y染色体PCR分析,证实雌性受体小鼠重建造血的细胞来源于雄性供体。提示Sca-1＋HSC/HPC移植后能重建造血衰竭小鼠造血功能。     

Sca-1+造血干/祖细胞重建致死剂量辐射小鼠造血功能的作用

背景:近年来,造血干细胞移植在国内外已广泛开展,移植的造血干细胞能否有效重建造血成为造血干细胞移植领域的研究热点问题之一.目的:观察Sca-1+造血干/祖细胞(hematopoietic stem/progenitor cell,Sca-1+HSC/HPC)对造血衰竭小鼠造血功能重建的作用.方法:雌性C57BL/6受体鼠给予致死剂量60Coγ射线照射后分2组,对照组:输注无菌PBS;移植组:移植免疫磁性分选法分离纯化的同系雄性C57BL/6小鼠Sca-1+HSC/HPC;检测受体鼠生存时间;外周血白细胞、红细胞比容、血小板的变化;脾湿质量及脾集落数;PCR检测Y染色体(Sry基因)表达确定受体小鼠重建造血的细胞来源.结果与结论:移植组受体鼠30 d存活率、白细胞、红细胞比容、血小板、脾湿质量及脾集落数均明显高于对照组(P < 0.05);Y染色体PCR分析,证实雌性受体小鼠重建造血的细胞来源于雄性供体.提示Sca-1+HSC/HPC移植后能重建造血衰竭小鼠造血功能.     

体外诱导人类诱导性多能干细胞分化为造血干 / 祖细胞的研究简

本研究探讨体外诱导人诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cell,iPSC）分化为造血干/祖细胞的能力.在体外用小鼠骨髓基质细胞OP9与人类iPSC共培养的方法,将iPSC诱导分化为造血干/祖细胞;用流式细胞术检测造血干/祖细胞表面标志物的表达水平;用实时定量PCR检测分化过程中iPSC及造血干/祖细胞的相关基因mRNA表达水平的变化;用免疫磁珠法分离CD34＋造血干/祖细胞并进行半固体集落形成实验检测细胞的集落形成能力.结果表明,iPSC与OP9细胞共培养诱导造血分化的第4天即可观察到iPSC形态变化;流式细胞术检测显示,分化得到的细胞表达已知的造血干/祖细胞相关表面标志物CD34和CD43分子.在体外分化过程中多能性的标志基因Oct4的表达逐渐下降,造血相关转录因子Gata-2的表达逐渐升高,而Runx-1的表达量则呈波浪式变化,CD34表达量逐渐升高.集落培养14 d能够得到红系集落（CFU-E）,粒系集落（CFU-G）,巨核系集落（CFU-M）,粒-巨核系集落（CFU-GM）和混合系集落（CFU-GEMM）.结论：iPSC细胞能够在体外通过与OP9细胞共培养分化为造血干/祖细胞.     

再生障碍性贫血造血干细胞的研究现状

再生障碍性贫血(再障)的病因和发病机制复杂,但主要的病理生理学改变为造血干细胞(HSC)和造血祖细胞(HPC)的损伤,表现为干/祖细胞数量和质量的异常。我们主要针对原发性获得性再障的干细胞损伤及其机制综述如下。1 再障 HSC 数量和质量的异常1.1 再障干/祖细胞数量异常:再障患者 HSC/HPC 群体数量的减少已形成共识。在体外半固体琼脂培养系统中,再障患者的骨髓无或仅有很少的集落形成;后来的长期细胞培养(LTC)研究也证实,再障的 HSC/HPC 数量明显低于正常在再障出现明显的临床症状时,作为反映 HSC/HPC 的长期     

Notch信号通路对VEGF促小鼠胚胎干细胞分化成为造血干/祖细胞的作用

目的:探讨Notch信号通路对小鼠胚胎干细胞(ESC)分化为造血干细胞/祖细胞(HSC/HPC)的影响。方法:小鼠胚胎干细胞体外增殖形成拟胚体;拟胚体体外诱导分化,分为EB组、实验对照组、VEGF、DAPT组、VEGF-DAPT组。流式细胞术检测HSC/HPC表型CD117+CD34+Sca1+; RT-PCR检测相关基因表达。结果:VEGF组诱导形成的HSC/HPC数目较对照组及EB组明显增多(P 0.05),提示VEGF促进ESC分化为HSC/HPC;DAPT组诱导分化的HSC/HPC数目较对照组及EB组增多(P 0.05),提示Notch信号通路阻断剂DAPT促进ESC分化为HSC/HPC;VEGF-DAPT组HSC/HPC较VEGF组HSC/HPC和DAPT组增多(P 0.05),提示DAPT、VEGF对促进ESC分化为HSC/HPC有协同作用。结论:Notch信号通路在VEGF促ESC分化为HSC/HP中起抑制作用。     

SIRT5缺失对小鼠造血干细胞损伤恢复的影响

目的:探讨在5-FU诱导下脱酰基酶Sirtuin 5对小鼠造血干细胞损伤恢复的影响。方法:采用流式细胞术分析SIRT5缺失对小鼠造血干/祖细胞比例,胸腺T细胞的发育情况,外周血和脾脏中T细胞、B细胞和髓系细胞比例的影响。使用5-FU进行化疗损伤诱导,采用流式细胞术分析SIRT5缺失对骨髓造血干/祖细胞比例的影响,同时检测SIRT5缺失小鼠造血干/祖细胞的细胞周期和凋亡。通过流式分选进行造血干细胞体外培养,分析SIRT5缺失对造血干细胞增殖能力的影响。结果:与野生型相比,SIRT5的缺失不影响小鼠胸腺中T细胞的发育以及外周血和脾脏中T细胞、B细胞和髓系细胞比例。在骨髓中,SIRT5缺失小鼠的造血干/祖细胞比例升高。在5-FU处理的造血损伤情况下,SIRT5缺失会导致小鼠造血干细胞比例下降(P<0.05),并且SIRT5缺失小鼠的造血干/祖细胞由G₀期向G₁期激活(P<0.05),同时伴随早期凋亡率显著升高(P<0.05)。通过体外单克隆培养,与野生型相比,SIRT5缺失小鼠的造血干细胞克隆形成能力显著下降(P<0.05)...     

细胞周期抑制剂SNS-032对小鼠造血干细胞生物活性的影响研究

本研究旨在探讨SNS-032（C17H24N4O2S2）对小鼠骨髓造血干细胞（hematopoietic stem cells,HSC）细胞周期、凋亡、分化及自我更新的影响及其可能的相关机制。利用极限稀释实验检测SNS-032作用前后HSC自我更新的变化,用流式细胞术检测SNS-032作用前后小鼠骨髓细胞Lin-c-kit＋Sca-1＋及Lin-c-kit＋Sca-1-表型细胞的细胞周期及凋亡的变化,用实时定量PCR检测SNS-032作用前后细胞周期相关基因、凋亡相关基因及HSC自我更新相关基因mRNA表达量的水平。结果显示,SNS-032处理后,小鼠骨髓细胞中HSC的自我更新能力没有明显变化;加SNS-032处理后,小鼠骨髓细胞Lin-c-kit＋Sca-1＋表型细胞的细胞周期无统计学意义的变化（P〉0.05）,小鼠骨髓Lin-c-kit＋Sca-1-表型细胞的G1期细胞增多（P〈0.05）;小鼠骨髓细胞Lin-c-kit＋Sca-1＋表型细胞和Lin-c-kit＋Sca-1-表型细胞的细胞凋亡增多,与对照相比均无显著性差异（P〉0.05）。小鼠骨髓细胞经SNS-032处理后,HSC周期相关基因CDK1、CDK2、CDK7、p27的表达量均明显降低（P〈0.05）,而CDK4,CDK6,p21,p18,p19,p16的表达与对照组相比没有明显变化（P〉0.05）。凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Puma和p53表达量与对照组相比没有明显区别（P〉0.05）,与干细胞自我更新相关的基因中Bim,Sall4,Notch1表达量升高,但与对照组相比没有显著性差异（P〉0.05）。结论：SNS-032没有明显的抑制正常造血干细胞自我更新、分化作用,而且SNS-032没有明显的诱导正常造血干、祖细胞的凋亡作用。     

采用多功能流式细胞术分析分选造血干细胞和髓系定向分化祖细胞

目的 探讨富集纯化造血干细胞(HSC)和髓系定向分化祖细胞的新实验方案.方法 根据造血干细胞和定向分化祖细胞在发育过程中表达某些特异性分化抗原的特性,通过免疫磁珠分选技术结合四色和六色流式细胞术分析14只健康小鼠的骨髓造血干细胞、造血祖细胞及定向分化祖细胞系列的表达,并对其进行分选,以进一步通过集落细胞培养和传代试验对分选后细胞的活性进行检测.结果 经上述实验方案分析,14只健康小鼠骨髓造血祖细胞(HPC)的表达率约为HSC的10倍;但其牛成活性远不如造血干细胞,共同髓系祖细胞(CMP)的传代能力仅为HSC的1/2,且次级分化的粒系单核系祖细胞(GMP)和红系巨核系祖细胞(MEP)的生成活性更弱,其传代次数为零.结论 通过多色流式细胞术实验方案可以分析纯化HSC和髓系定向分化祖细胞的表达,并精确计数HSC和祖细胞.     

神经干细胞体外衰老模型的构建及相关生物学特点☆

背景:干细胞衰老主要表现为其增殖、分化能力下降,端粒长度缩短及端粒酶活性增强以及衰老相关基因及蛋白的表达上调等。目的:建立神经干细胞体外衰老模型,探讨其衰老的相关生物学特点及调控机制。方法:将从新生SD大鼠海马组织中分离纯化的第3代神经干细胞在37℃、体积分数5%CO2和神经干细胞完全培养基中培养2h为对照组,在对照组基础上加入终浓度为100μmol/L三丁基过氧化氢培养2h构建神经干细胞体外衰老模型为衰老模型组。结果与结论:与对照组比较,三丁基过氧化氢作用2h,倒置显微镜下见衰老模型组神经干细胞增殖形成的神经球数量、体积以及由其分化形成的细胞数量均显著下降;MTT吸光度值显著下降26%,神经干细胞增殖形成的神经球数量下降48%;神经干细胞分化形成的神经元的数密度显著下降61%;衰老相关β-半乳糖苷酶阳性神经球百分比显著升高了19倍;p16INK4a、p21Cip1/Waf1mRNA的表达水平分别显著升高了137%和68%。以上结果表明,三丁基过氧化氢能构建神经干细胞体外衰老模型,p16INK4、p21Cip1/Waf1可能通过p16/RB和p19ARF/p53/p21cip1通路调控三丁基过氧化氢诱导神经干细胞衰老。     

含人AGM区基质细胞对小鼠胚胎干细胞诱导体外分化为造血干/祖细胞的作用

为探讨人主动脉-性腺-中肾(AGM)区基质细胞对小鼠胚胎千细胞(embryonic stem cells,ESC)体外诱导分化为造血干细胞(HSC)的影响及其作用机制,将小鼠E14 ESC诱导为拟胚体(EB),收获的EB细胞以Tran-swell非接触共培养体系分别在人AGM区、胎肝(FL)或骨髓(BM)基质细胞饲养层上进一步诱导分化,分为EB对照、AGM诱导、FL诱导、BM诱导、AGM + FL诱导和AGM + BM诱导共6组.分别收获各组EB来源细胞,以流式细胞仪检测Sca-1+ c-Kit+细胞含量,并进行各系造血细胞集落形成单位(CFU)分析.结果显示:经不同基质细胞饲养层诱导后EB来源细胞中Sca-1+ c-Kit+细胞比例均较诱导前明显升高(p<0.01),AGM+FL诱导组为(21.96±2.54)%,显著优于其它诱导组(p<0.01),AGM+BM诱导组阳性细胞比例亦较单纯BM诱导组明显增加(p<0.O1);EB对照组造血集落产率明显低于其它诱导组,AGM+FL、AGM+BM诱导组集落产率较高,尤以AGM+FL诱导组最佳(p<0.01).结论:人AGM区基质细胞有助于维持一定的原始HSC数目及高增殖潜能,在AGM区基质细胞诱导基础上可明显提高FL或BM基质细胞对ESC源性原始HSC的进一步扩增作用.     

持续 Wnt 信号通路激活促进胚胎干细胞源造血干细胞的增殖简

背景：如何提高胚胎干细胞诱导效率、促进胚胎干细胞源造血干细胞体外增殖成为目前急需解决的课题。目的：以外源性Wnt3a作为诱导剂,激活培养中的小鼠胚胎干细胞Wnt/β-catenin信号通路,观察该通路的激活是否促进胚胎干细胞向造血祖细胞的定向分化。方法：用外源性wnt3a（100μg/L）持续作用ES-E14TG2a小鼠胚胎干细胞21 d,通过细胞免疫荧光及蛋白免疫印迹检测细胞内β-catenin蛋白含量,QRT-PCR检测Wnt下游靶标基因的表达量来确定经典Wnt/β-catenin信号通路是否被激活,然后采用单层贴壁培养法诱导其向造血干细胞分化,流式细胞仪检测造血发育相关表面标志CD34＋/Sca-1＋,同时以QRT-PCR法检测造血相关基因的表达情况。结果与结论：ES-E14TG2a小鼠胚胎干细胞经wnt3a（100μg/L）连续培养21 d后发现β-catenin蛋白在细胞内积累;Wnt信号通路的下游靶标基因Pitx2、Frizzled、Sox17、Oct4的表达量均出现不同程度的增加,可见经典 Wnt/β-catenin 信号通路有被激活;单层贴壁培养法诱导其向造血干细胞分化的过程中检测到CD34＋/Sca-1＋细胞含量在14 d时占总细胞量高达20.2%,而对照组的仅占11.9%。造血相关基因骨形态发生蛋白4、FLK2及CD34的表达量均增加,而Smad5的表达则明显受到抑制。说明Wnt3a持续作用可激活Wnt/β-catenin信号通路,并促进ES-E14TG2a小鼠胚胎干细胞向造血干细胞的定向分化。     

组蛋白乙酰化修饰调控NF-κB驱动的PNPLA3基因表达的机制初探

目的 探讨禁食/再喂食后小鼠肝脏Patatin样磷脂酶域蛋白3（PNPLA3）基因启动子核因子-κB（NF-κB）结合区域组蛋白H3K9乙酰化（H3K9ac）水平以及相关去乙酰化酶（HDAC）和乙酰化转移酶（HAT）的变化特点。方法 根据体质量将18只C57BL/6小鼠随机分为3组各6只,分别为自由饮食组、禁食组（夜间饥饿24 h）和再喂食组（饥饿24 h后再自由摄食高蔗糖含量饲料12 h）,分别予自由饮食、禁食和禁食后再喂食干预,检测并比较各组肝脏PNPLA3、NF-κB、HDAC（SIRT1、SIRT6）和HAT（GCN5、Elp3）基因表达情况,用染色质免疫共沉淀-定量PCR检测H3K9ac富集水平,并分析H3K9ac与PNPLA3表达的相关性。结果 3组比较,C57BL/6小鼠肝脏PNPLA3、NF-κB基因表达在禁食时下调,再喂食后又上调（P均< 0.001）。H3K9ac水平变化与PNPLA3变化趋势一致（P均< 0.05）,相关分析提示两者具有相关性（r_s = 0.958, P < 0.001）;禁食组SIRT1和SIRT6表达水平较自由饮食组高,再喂食组两者水平均下降（P均< 0.05）,与H3K9ac变化趋势相反;GCN5、Elp3表达变化与SIRT1及SIRT6类似（P均< 0.05）。结论 SIRT1和SIRT6相关H3K9去乙酰化涉及饮食调节NF-κB驱动的PNPLA3的表达。     

不同氧浓度培养对小鼠骨髓造血干细胞生物活性的影响

本研究模拟人外周血造血干细胞(HSC)移植中HSC所经历的氧环境,研究不同氧浓度对小鼠骨髓HSC生物功能的影响及可能机制。采用体外扩增实验、定向分化实验、细胞周期分析、活性氧测定及亚致死量射线照射小鼠骨髓原始Lin-c-kit+Sca-1+HSC移植等方法,分别检测了Lin-c-kit+Sca-1+HSC的扩增能力,细胞周期,活性氧水平及造血重建能力。结果表明:低于常氧浓度,特别是乏氧的氧环境能降低活性氧的产生,增强原始骨髓HSC体外扩增能力,增加红系集落(BFU-E)、粒单集落(CFU-GM)、红系粒单系巨核系集落(CFU-GEMM)的数量,维持较多的HSC处于G0/G1期,进而明显促进移植后小鼠的脾集落(CFU-S)生长及提高移植小鼠存活数量。而暴露于常氧、不恒定且氧浓度变化剧烈的氧环境中的骨髓HSC能产生较高水平的活性氧,上述功能指标都较低。结论:骨髓HSC的活性氧水平与周围氧环境中氧浓度水平及稳定性密切相关,高水平的活性氧损害骨髓HSC的功能。在恒定的较低浓度的氧环境下培养及应用抗氧化剂对于骨髓HSC移植可能更有益。     

地氟醚预处理对缺氧/复氧损伤时核因子-κB转导通路效应分子的影响

目的：探讨地氟醚预处理对于核因子（NF）-κB信号转导通路激活后效应分子的影响。方法：选用人脐静脉内皮细胞株（ECV304）。将细胞分为5组：（1）空白对照组;（2）缺氧/复氧（A/R）组;（3）A/R＋肿瘤坏死因子-α（TNF-α,10ng.mL-1）刺激组（A/R＋TNF-α组）;（4）地氟醚1.0MAC预处理＋A/R组（Des＋A/R组）;（5）地氟醚1.0MAC预处理＋A/R＋TNF-α（10ng.mL-1）刺激组（Des＋A/R＋TNF-α组）。应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法分别检测各组细胞的细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）和白细胞介素-8（IL-8）的基因表达水平。结果：A/R组较对照组细胞的ICAM-1、VCAM-1和IL-8mRNA表达水平均有所增加;而经地氟醚预处理后,Des＋A/R组细胞的mRNA表达较A/R组有明显降低。结论：地氟醚预处理可抑制TNF-α刺激的内皮细胞表面黏附分子及炎性介质的基因表达水平。     

脂多糖对中性粒细胞核转录因子-κB活性的影响

目的：探讨在脂多糖（LPS）刺激下,中性粒细胞核转录因子-κB（NF-κB）活性变化及其抑制因子（IκBα）的影响。方法：离体培养人中性粒细胞,分为来普霉素B（LMB）干预组（A组）、LPS刺激组（B组）和LPM＋LPS组（C组）。各组分别在刺激后0、15、60、120min,用NF-κBp65试剂盒检测细胞核NF-κB活性,用Western-blot检测细胞核、浆中IκBα含量。结果：A组中各时相点NF-κB活性无明显变化;同一时相点细胞核、浆之间,以及不同时相点细胞核之间、细胞浆之间IκBα含量无明显变化。B组LPS刺激后,NF-κB活性较0点时明显增强;细胞核、浆中各时相点IκBα较未刺激时显著降低;细胞核、浆中呈现一致性变化。C组NF-κB活性于60min时点后,较B组同时相点明显受抑制;胞浆中IκBα于60min时较B组明显减少,而核中IκBα于60min后较B组明显增加。结论：NF-κB活性与核中IκBα含量呈负相关;IκBα在中性粒细胞存在核浆穿梭,通过抑制IκBα核浆穿梭,可显著降低NF-κB活性。     

Indole-3-carbinol enhances the resolution of rat liver fibrosis and stimulates hepatic stellate cell apoptosis by blocking the inhibitor of κB kinase α/inhibitor of κB-α/nuclear factor-κB pathway

Hepatic stellate cells (HSC) play a pivotal role in liver fibrosis, and the clearance of activated HSC by apoptosis is associated with the resolution of liver fibrosis. The development of strategies that promote this process in a selective way is therefore important. We evaluated the effects of indole-3-carbinol (I3C), a nutritional component derived from vegetables from the Brassica family, on liver fibrosis and HSC apoptosis. The in vivo therapeutic effects of I3C were monitored in three rat models of liver fibrosis induced by porcine serum, bile duct ligation, or multiple hepatotoxic factors, and its proapoptotic effect and molecular mechanism were studied in vitro in HSC-T6, a rat HSC line. The results showed that I3C treatment significantly reduced the number of activated HSC in the livers of rats with liver fibrosis. In histopathology, I3C reduced hepatocyte degeneration and necrosis, accelerated collagen degradation, and promoted the reversal of liver fibrosis. I3C prescribed to HSC-T6 resulted in morphologic alterations typical of apoptosis and DNA cleavage to a nucleosomal ladder. Moreover, I3C significantly increased the HSC-T6 apoptosis rate and the expression ratio of Bax to Bcl-2. High-throughput protein array analysis indicated that the tumor necrosis factor-α/nuclear factor-κB (NF-κB) signal pathway participated in I3C-induced HSC-T6 apoptosis. Western blot and electrophoretic mobility-shift assay confirmed that I3C inhibited the phosphorylation of inhibitor of κB kinase α and inhibitor of κB-α and NF-κB DNA binding activity. In conclusion, I3C could promote the reverse process of liver fibrosis in vivo and induce apoptosis of activated HSC in vitro, which indicates the use of I3C as a potential therapeutic agent in liver fibrosis treatment.     

RNA干扰介导的核转录因子-κB抑制蛋白激酶α和γ基因沉默对核转录因子-κB信号通路调节作用的影响

目的 观察RNA干扰介导的核转录因子-κB抑制蛋白(IκB)激酶(IKK)α和γ基因沉默对核转录因子-κB(NF-κB)信号通路的调节作用,进一步阐明其基因调控机制.方法 设计IKKα及IKKγ靶向的小分子干扰RNA(siRNA),合成互补的寡核苷酸链,转染到RAW264.7小鼠巨噬细胞.观察经脂多糖(LPS)刺激后NF-κB的活化、IKKα及IKKγ基因表达的变化、NF-κB p65及p50核移位的变化以及前体蛋白NF-κB p105的表达情况.结果 IKKα及IKKγ基因沉默后,可导致IKKα及IKKγ基因表达出现明显下调,同时NF-κB p65及p50的核移位受到抑制,胞质、胞核中NF-κB p65、p50及p105的表达显著下调,而且能抑制NF-κB p65、p50及p105蛋白的核移位.结论 IKKα及IKKγ两种蛋白激酶参与NF-κB信号通路的调节,不仅能分别在抑制蛋白的泛肽化、组蛋白磷酸化等环节发挥作用,而且还能够通过相互之间的协同作用,弥补其中某种蛋白受到过度抑制时所引起的炎症信号通路的功能障碍.