UⅡ/UT系统在LPS刺激大鼠肝枯否细胞前炎细胞因子TNF-α和IL-1β表达与分泌中的作用研究

目的探讨UⅡ/UT系统在LPS刺激大鼠肝枯否细胞(Kupffer cell,KC)TNF-α和IL-1β表达和分泌中的作用。方法采用胶原酶灌注消化和密度梯度离心分离大鼠KC。细胞分组和处理方法:正常对照组urantide(-)LPS(-)、urantide或UⅡ处理组urantide/UⅡ(+)LPS(-)、LPS刺激组urantide(-)LPS(+)、urantide或UⅡ预处理组urantide/UⅡ(+)LPS(+);细胞内基因表达采用RT-PCR和real-time PCR方法检测,细胞培养上清液中蛋白质分泌水平采用ELISA分析方法检测。结果 LPS刺激后,KC内UⅡ、UT mRNA相对表达水平和细胞培养上清液UⅡ多肽水平显著升高,但urantide预处理组显著低于LPS刺激组(P0.01)。Urantide处理组细胞UⅡ/UT mRNA和上清液UⅡ多肽水平与正常对照组之间无明显统计学差异(P0.05);LPS刺激后(LPS刺激组、UⅡ预处理组和urantide预处理组),TNF-α和IL-1βmRNA表达和蛋白质分泌水平较正常对照组明显升高(P0.01),但urantide预处理组较LPS刺激组和UⅡ预处理组显著降低(P0.01),LPS刺激组与UⅡ预处理组之间无明显统计学差异(P0.05)。UⅡ或urantide处理组KC上述前炎细胞因子的表达和分泌水平与正常对照组之间无明显统计学差异(P0.05)。结论 UⅡ/UT信号系统可能在LPS刺激肝KC前炎细胞因子TNF-α和IL-1β的表达和分泌中起重要作用。     

IRF3 基因干扰对LPS 刺激原代枯否细胞早期细胞因子分泌动态变化的影响

目的:探讨干扰素调节因子3(Interferon regulator factor 3,IRF3)shRNA腺病毒对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激枯否细胞(Kupffer cell,KC)早期细胞因子分泌动态变化的影响。方法:采用在体灌注分离培养大鼠原代KC,以IRF3shRNA腺病毒体外感染KC,48 h后采用LPS刺激细胞,于0、2、4和6 h收集细胞培养上清液,并收集6 h细胞。上清液细胞因子的分泌采用ELISA分析;细胞IRF3基因表达采用RT-PCR和Western blot方法检测。结果:LPS刺激诱导了KC内IRF3 mRNA和蛋白质表达升高,IRF3 shRNA腺病毒的应用抑制了LPS刺激诱导和非刺激组成性IRF3 mRNA和蛋白质的表达;KC受LPS刺激活化后极早期(2 h)IFN-β分泌即上升,4 h达峰值,6 h分泌水平开始下降,但仍维持于高水平。干扰腺病毒的应用抑制了LPS刺激后各时间点IFN-β的分泌,抑制分泌高峰的出现,并使6 h分泌水平趋于正常;KC活化后极早期即分泌大量TNF-α,并于2 h内达到峰值,随后分泌逐渐下降,但6 h仍维持于高水平。干扰腺病毒的应用抑制了LPS刺激各时间点TNF-α的分泌,并抑制了分泌高峰的出现;IL-1β分泌增高出现于LPS刺激4 h后,6 h分泌水平达更高值。干扰腺病毒的应用抑制了LPS刺激早期KC对IL-1β的分泌;KC受LPS刺激活化后极早期IL-10分泌即上升,且随着LPS刺激时间延长,其分泌水平逐渐增加。IRF3 shRNA腺病毒的应用促进了LPS刺激后早期各时间点IL-10的分泌。结论:IRF3 shRNA腺病毒可使原代枯否细胞IRF3基因表达沉默;在LPS刺激原代KC,IRF3可促进其下游信号分子IFN-β、前炎细胞因子TNF-α和IL-1β的分泌,并抑制抑炎细胞因子IL-10分泌。因此,IRF3可能在肝组织免疫炎症性损伤的发生中起中心作用。     

封闭枯否细胞对LPS诱导激活丝裂原活化蛋白激酶的影响

目的： 利用小鼠LPS血症模型，探讨封闭枯否细胞（KCs）对LPS诱导MAPK信号转导通路的影响。方法： 雄性昆明种小鼠在注射LPS（5 mg/kg）前48 h及24 h，分别静脉注射GdCl₃（10 mg/kg）或等量的生理盐水，于LPS或生理盐水注射后30 min，分别取出肝脏或分离KCs；体外培养小鼠KCs经GdCl₃（100 μmol/L）预处理1 h，加入含LPS（100 μg/L）的DMEM培养基继续孵育30 min，分别检测肝脏及体内外KCs ERK1/2、p38MAPK蛋白表达和磷酸化水平，及GdCl₃对KCs吞噬、分泌功能的影响。结果： GdCl₃可抑制LPS 诱导KCs活化和TNF-α分泌，但不能抑制LPS诱导KCs或肝脏ERK1/2、p38MAPK磷酸化，也不能影响ERK1/2、p38MAPK蛋白表达，KCs 经GdCl₃单独短时间处理（1 h），可使其少量分泌TNF-α。结论： 封闭KCs并不能通过调节细胞内ERK1/2、p38MAPK信号转导途径，抑制LPS诱导的KCs活化及TNF-α释放，而可能是通过其它信号转导途径（JNK、NF-кB、GPCR等）间的相互作用减轻肝损伤。     

体外LPS刺激及CD40的配基化对sCD40基因修饰DCs TLR4-MD2表达及IL-12分泌的影响

目的： 研究体外LPS刺激及CD40的配基化对可溶性CD40（sCD40）基因修饰树突状细胞TLR4-MD2表达及IL-12分泌的影响,为有效利用树突状细胞诱导特异性移植免疫耐受提供实验依据。方法: 脂质体法将质粒pEGFP-N1/sCD40及空质粒pEGFP-N1转染DC2.4细胞株;应用LPS及抗CD40单抗刺激6 h,流式细胞仪检测DC表面TLR4-MD2的表达,RT-PCR法检测DC 的TLR4 mRNA 表达水平,并用ELISA法检测细胞因子IL-12p70的分泌。结果: LPS刺激下调DC表面TLR4-MD2的表达,同时给予CD40配基化可引起TLR4-MD2的表达显著增高;CD40配基化对DC TLR4mRNA 水平表达无影响，但可部分地增高LPS引起的TLR4mRNA 表达降低;此外,CD40的配基化可显著诱导LPS刺激后IL-12分泌增加。sCD40基因修饰DC可拮抗以上作用。结论: 体外LPS及抗CD40单抗刺激下,sCD40基因修饰树突状细胞可显著下调其表面TLR4-MD2的表达,IL-12p70分泌减少，可能与阻断胞浆内的TLR4-MD2的转运过程有关。     

Toll样受体4信号转导研究进展

Toll样受体（Toll-like-receptors,TLRs）是一个主要分布于炎症细胞的识别病源分子的受体超家族,其中TLR4主要识别革兰阴性细菌细胞壁成分脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）。LPS与TLR4结合后活化髓样分化因子88 (myeloid differentiation factor 88, MyD88)依赖性和非依赖性两条信号途径;前者活化丝裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）和核因子-κB（nuclear factor kappa B,NF-κB）信号通路,后者活化NF-κB和干扰素调节因子-3(IFN-regulated factor-3,IRF3)信号通路。通过这些信号途径TLR4诱导炎症细胞释放炎症因子介导炎症反应;同时TLR4通过活化树突状细胞促进抗原递呈,介导先天性免疫向获得性免疫的转化。此外,TLR4能诱导磷脂酰肌醇-3激酶-蛋白激酶B（PI3K-AKT）的信号转导,LPS介导的细胞存活和增殖与TLR4活化 PI3K-AKT途径有关。     

LPS刺激诱导人卵巢癌细胞株Toll样受体4表达及细胞免疫调节

目的 探讨脂多糖(LPS)刺激对体外培养的人卵巢癌细胞株SKOV3的生长、Toll样受体4(TLR4)的表达、细胞活性氧(ROS)表达及6种炎性细胞因子分泌水平变化的影响.方法 用流式细胞仪测定不同浓度LPS刺激SKOV3 4 h后TLR4的表达水平;用LPS分别刺激SKOV3细胞不同时间后,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞仪分析TLR4表达、细胞周期分布、ROS表达水平以及细胞因子分泌水平.结果 TLR4表达与LPS作用浓度之间存在浓度依赖性和最大量效曲线关系;LPS刺激组与正常组的细胞增殖、细胞周期PrI值(细胞增殖指数,S+G_2/M)、ROS表达水平、细胞因子分泌水平均有显著性差异.结论 LPS具有诱导卵巢癌细胞TLR4表达、活性氧表达、炎症因子分泌以及细胞增殖和抑制的作用.     

脂多糖通过NF-κB途径调节大鼠星形胶质细胞Toll样受体表达

目的 研究脂多糖（LPS）对大鼠星形胶质细胞Toll样受体表达的影响及其机制。方法 在原代培养的第3代星形胶质细胞中加入不同浓度的LPS作用24h,通过免疫荧光、western blot观察星形胶质细胞 Toll样受体的表达和NF-κB p65的表达,同时研究NF-κB通路抑制剂对其的影响。结果 在正常状况下,星形胶质细胞胞浆和胞膜表达大量的TLR3受体,很少的TLR4受体。在LPS的刺激下,星形胶质细胞的TLR3表达保持不变,TLR4受体的表达随予以LPS的量增加而增高。LPS可刺激星形胶质细胞NF-κB的表达升高,抑制NF-κB通路活化抑制TLR4受体的上调。 结论 星形胶质细胞Toll样受体的表达是不同源的,TLR4受体随环境的变化而改变,其分子机制可能与NF-κB信号途径有关。     

脂多糖刺激干扰素调节因子3促进小鼠腹腔巨噬细胞白介素-17表达

目的：探讨干扰素调节因子3（IRF3）对脂多糖（LPS）刺激小鼠腹腔巨噬细胞促进白细胞介素-17（IL-17） 表达的初步作用机制。方法：小鼠腹腔注射3%巯基乙酸肉汤,3 d 后提取C57BL/6 野生和IRF3 基因敲除小鼠的 腹腔巨噬细胞,培养过夜后添加LPS。收集细胞培养上清液,酶联免疫吸附试验检测细胞因子IL-17 和白细胞介素-6 （IL-6）的表达;提取细胞蛋白质,免疫印迹检测细胞核因子κB抑制蛋白（IκB）α、IRF3、磷酸化信号转导子和 转录激活子3（STAT3）的蛋白水平。结果：LPS 刺激小鼠腹腔巨噬细胞后,IRF3 可显著地促进IL-17 的产生,同 时伴随着IL-6 的产生、IκBα 蛋白的降解及STAT3 的磷酸化。结论：IRF3 可能通过促进IL-6 的产生,间接地激活 STAT3 的磷酸化,进而促进IL-17 的产生。     

法舒地尔(Fasudil)抑制脂多糖诱导的小鼠星形胶质细胞活化和炎性反应及其机制

目的探讨法舒地尔(Fasudil)对脂多糖(LPS)诱导的星形胶质细胞活化和炎症反应及Toll样受体4(TLR4)/核因子κB(NF-κB)信号通路的影响。方法体外培养新生C57BL/6小鼠大脑皮质星形胶质细胞,细胞分为PBS对照组、1μg/m L LPS刺激组、1μg/m L LPS联合15μg/m L盐酸法舒地尔处理组,Griess法检测培养细胞上清液一氧化氮(NO)的水平,ELISA检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、IL-10和IL-4的水平,免疫荧光细胞化学染色检测星形胶质细胞胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)及TLR4的表达,Western blot法检测GFAP、TLR4和磷酸化的NF-κBp65(p-NF-κBp65)蛋白水平。结果与PBS组比较,LPS组NO、TNF-α和IL-6水平显著升高,IL-10和IL-4水平降低;法舒地尔能抑制LPS诱导的NO、TNF-α和IL-6的分泌,增加IL-10和IL-4的分泌。法舒地尔处理组星形胶质细胞GFAP表达显著降低,同时TLR4和NF-κB蛋白的水平也降低。结论法舒地尔阻断TLR4/NF-κB信号通路抑制LPS诱导的星形胶质细胞活化及炎性反应。     

IgG刺激诱发的小胶质细胞Toll样受体4表达及细胞因子分泌

目的:了解在体外培养条件下免疫球蛋白G (IgG) 刺激对小胶质细胞表达Toll 样受体4(TLR4)和分泌细胞因子的作用.方法:用不同浓度的IgG (2 mg/L、 20 mg/L、 200 mg/L)及脂多糖(LPS)(10 mg/L)刺激原代培养的大鼠小胶质细胞,24 h后以免疫荧光染色观察TLR4的表达,ELISA法检测培养上清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和γ干扰素(IFN-γ)的含量.结果:IgG直接作用于体外培养的小胶质细胞后,以剂量依赖的方式引起TLR4的表达和TNF-α的分泌,但未检测到IFN-γ含量的变化.作为阳性对照的LPS引起了小胶质细胞TLR4表达,并诱导了TNF-α及少量IFN-γ的分泌.结论:同种IgG刺激可使体外培养的小胶质细胞大量表达TLR4,可能通过MyD88依赖途径导致炎性细胞因子分泌.结果提示至少在中枢神经系统的固有免疫反应中,TLR4可能发挥识别病原体之外的蛋白分子,例如IgG的作用.     

LPS触发的TLR4对NF-κB和IRF3信号通路的调控差异

目的探讨脂多糖(LPS)触发的Toll样受体4(TLR4)对NF-κB和干扰素调节因子3(IRF3)信号通路的调控差异。方法 LPS刺激小鼠原代腹腔巨噬细胞,用免疫荧光法检测TLR4及两种转录因子p65及IRF3的定位,用Western blot方法检测转录因子p65和IFR3的磷酸化水平。结果巨噬细胞经LPS刺激30 min内,细胞膜上的TLR4荧光强度增加(P0.01),胞质中TLR4荧光强度显著增加(P0.01),且与早期内体抗原1(early endosome antigen 1,EEA1)共定位;当LPS刺激90和180 min时,胞膜和胞质内的TLR4信号均显著下降(P0.01),与EEA1共定位的信号也明显减少(P0.01)。静息状态下,TLR4的下游信号通路分子p65和IRF3的荧光信号均出现在胞质中;LPS刺激后,两者的荧光信号在细胞核中逐渐增加(P0.05),但p65荧光信号比IRF3增强得更早,且更持久。p65磷酸化的修饰也明显早于IRF3,且持续时间更长。结论 TLR4活化后的定位变化导致其下游IRF3信号通路的传递时间明显延后,且比NF-κB信号通路短暂。     

1,25-二羟维生素D_3对胰岛β细胞免疫保护作用

目的研究1,25-二羟维生素D3对胰岛β细胞的免疫保护作用,为胰岛β细胞的免疫保护治疗提供实验依据。方法培养胰岛β细胞株NIT细胞及正常对照外周血单个核细胞,分别与以下4组作用：①（IL-1β＋IFN-γ）组,②（IL-1β＋IFN-γ＋D3）组,③D3组,④对照组（DMEM）。采用酶联免疫吸附分析（ELISA）检测培养上清液中IL-4、IFN-γ水平,用硝酸还原酶法检测上清液NO水平,用化学发光法检测上清液胰岛素水平。结果①IL-1β＋IFN-γ＋D3刺激的NIT-1细胞与IL-1β＋IFN-γ刺激组相比,分泌IL-4水平增高（P〈0.01）、IFN-γ减少（P〈0.01）,IL-4/IFN-γ增高（P〈0.01）;②IL-1β＋IFN-γ＋D3刺激的NIT-1细胞与IL-1β＋IFN-γ刺激组相比,分泌NO水平减少（P〈0.01）;③IL-1β＋IFN-γ＋D3刺激的NIT-1细胞与IL-1β＋IFN-γ刺激组相比,胰岛素分泌增加（P〈0.05）。结论 1,25-二羟维生素D3可减轻IL-1β＋IFN-γ对NIT细胞的损伤作用,保护NIT细胞的胰岛素分泌功能。     

TLR4介导HCV引起小胶质细胞IL-12和IFN-α分泌的实验研究

目的检测HCV刺激小鼠小胶质细胞(BV2细胞)后IL-12、IFN-α分泌变化及其与TLR4的关系。方法用含20%HCV阳性血清的培养液刺激BV2细胞,为HCV血清组,并设置正常血清组和空白对照组。于24 h后用RT-qPCR方法观察各组TLR4相对表达,应用ELISA方法检测各组细胞培养上清液中IL-12、IFN-α的含量,同时观察TLR4阻断后各组IL-12、IFN-α的分泌变化。结果 HCV血清组TLR4相对表达和IL-12、IFN-α分泌均高于正常血清组及空白对照组(P<0.01);阻断TLR4的HCV血清组IL-12、IFN-α分泌明显低于非阻断组(P<0.01),高于正常血清组及空白对照组(P<0.01);正常血清组和空白对照组阻断前后无明显变化(P>0.05)。结论 TLR4可能会通过介导HCV刺激小胶质细胞分泌IL-12、IFN-α等来发挥宿主CNS抗HCV的固有免疫应答。     

大肠杆菌麦芽糖结合蛋白激活TLR2介导的MyD88依赖途径和TLR4介导的TRIF/TRAF3依赖途径诱导Th1活化

目的探讨TLR2/TLR4介导的信号通路在大肠杆菌麦芽糖结合蛋白诱导Th1活化中的调控作用。方法免疫磁珠分选方法获取纯的CD4+T细胞,经CD3/CD28抗体活化后的CD4+T细胞分别用MBP、MBP+anti-TLR2、MBP+anti-TLR4刺激。ELISA检测培养上清中IFN-γ和IL-4的分泌;RT-PCR检测CD4+T细胞IFN-γ、MyD88、TRIF、TRAF3和TRAF6的mRNA表达;Western blotting方法检测CD4+T细胞MyD88、TRIF、TRAF3和TRAF6的蛋白表达。结果 MBP组IFN-γ水平升高、IFN-γ、MyD88、TRIF、TRAF3的mRNA上调、TRAF6的mRNA下调;MBP+anti-TLR2组IFN-γ水平降低、TRAF6的mRNA上调、MyD88的mRNA下调、TRIF、TRAF3的mRNA无影响;MBP+anti-TLR4组IFN-γ水平升高、TRAF6的mRNA上调、MyD88、TRIF、TRAF3的mRNA下调,Western blotting实验也出现了相似的结果。结论 TLR2介导的MyD88依赖途径和TLR4介导的TRIF/TRAF3依赖途径在MBP诱导的Th1活化过程中发挥了重要的调控作用。     

不同乳腺癌细胞系中TLR5 和NLRC4 受体的表达和定位

目的:探究TLR5 和NLRC4 受体在不同乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MCF-7 和MDA-MB-435 中的表达和定位情况,并探讨重组鞭毛素蛋白对乳腺癌细胞TLR5 受体的激活情况。方法:利用Real-time PCR 法检测MDA-MB-231、MCF-7 和MDA-MB-435 细胞TLR5 和NLRC4 mRNA 表达水平,用流式细胞仪检测MDA-MB-231、MCF-7 细胞TLR5 受体的表达和定位。纯化重组鞭毛素蛋白即全长鞭毛素蛋白FliC(同时激活TLR5 和NLRC4 两条通路)、FliC驻90-97(不能激活TLR5 通路)、FliC-L3A(不能激活NLRC4 通路)、FliC驻90-97:L3A(两条通路都不激活)。用1 g/ ml 重组鞭毛素蛋白刺激MCF-7 细胞,12 h 后,ELISA 法检测IL-8 的分泌。结果:MCF-7 细胞TLR5 mRNA 表达水平最高,约是MDA-MB-435 细胞的1 700 倍,MDA-MB-231细胞TLR5 表达水平是MDA-MB-435 的约200 倍。TLR5 在MCF-7 细胞浆和胞膜上均有表达,而MDA-MB-231 细胞只在胞浆中表达。激活TLR5 通路的FliC 和FliC-L3A 能够刺激MCF-7 细胞分泌IL-8,而不激活TLR5 通路的FliC 90-97 和FliC 90-97:L3A 则不能。结论:不同乳腺癌细胞系都表达TLR5 和NLRC4,但是表达部位和表达水平不同。MCF-7 细胞TLR5 和NLRC4 表达高于其他乳腺癌细胞系。乳腺癌细胞系表面的TLR5 受体可以被鞭毛素蛋白激活,为进一步探讨TLR5 通路的激活在乳腺癌细胞增殖中的作用提供实验基础。     

TLR4激动对内皮细胞粘附功能的影响及阿托伐他汀的干预研究

目的：观察Toll样受体4（TLR4）激动对脐静脉内皮细胞（HUVECs）氧化低密度脂蛋白受体LOX-1的调节和对单核细胞与HUVECs粘附率的影响，以及LOX-1在内皮细胞粘附功能中的作用，并观察阿托伐他汀的干预作用方法：RT-PCR方法检测TLR4、LOX-1 mRNA表达水平，流式细胞术检测TLR4、LOX-1蛋白表达水平，细胞计数法计算单核细胞与HUVECs粘附率。结果：脂多糖(1 mg/L) 孵育24 h上调HUVECs TLR4、LOX-1 mRNA和蛋白的表达，增加单核细胞与HUVECs粘附率,抗LOX-1抗体部分抑制LPS介导的单核细胞与HUVECs粘附率的增加，阿托伐他汀（10 μmol/L）抑制脂多糖介导的上述效应。结论：TLR4激动上调LOX-1表达及增加内皮细胞粘附功能，LOX-1在LPS介导的单核内皮细胞粘附功能中起部分作用，阿托伐他汀可能通过抑制TLR4表达及TLR4 介导的LOX-1表达而发挥其内皮细胞保护作用。     

小鼠TLR3真核表达质粒的构建及其活性初步鉴定

目的　克隆、表达小鼠TLR3并进行功能鉴定。方法　用聚合酶链反应技术扩增得到mTLR3cDNA ,经酶切后将其克隆到真核表达质粒pBabe puro ,转染L92 9细胞 ,细胞裂解液经免疫沉淀后 ,SDS PAGE和免疫印迹检测蛋白表达 ,并用免疫组化技术观察polyI∶C刺激、经TLR3介导的对IRF3的激活作用。结果　克隆得到mTLR3cDNA ,构建重组体后转染细胞后表达的蛋白质相对分子量与预计相符 ,并能识别双链RNA类似物polyI∶C ,诱导IRF3核转位。结论　表达的小鼠TLR3具有生物学活性 ,为进一步研究TLR3介导的信号通路及其在抗病毒免疫中的作用打下基础。     

TLR4介导的BV-2细胞抗HCV固有免疫应答机制初步研究

目的:观察BV-2细胞感染HCV后IFN-β、IL-6分泌和TLR4表达相关性,初步探讨TLR4是否介导参与中枢神经系统抗HCV固有免疫应答及其可能机制。方法:将BV-2细胞接种于24孔培养板,贴壁后换用含20%HCV阳性血清的培养液感染细胞,为HCV实验组,同时设正常血清组和空白对照组。应用流式细胞术检测各组BV-2细胞TLR4蛋白水平的表达;用RT-PCR观察阻断TLR4后各组BV-2细胞TLR4mRNA表达变化;用ELISA检测阻断TLR4后各组BV-2细胞IFN-β、IL-6分泌变化。结果:HCV实验组TLR4表达和IFN-β、IL-6分泌均高于正常血清组及空白对照组(P<0.01);阻断TLR4的HCV实验组TLR4mRNA表达及IFN-β、IL-6分泌明显低于非阻断组(P<0.01)。结论:HCV感染中枢神经系统后,TLR4可通过启动下游细胞因子IL-6、IFN-β等的转录和翻译,介导参与宿主抗HCV固有免疫应答过程。     

脂多糖持续刺激巨噬细胞的免疫学机制初探

目的:探讨巨噬细胞在脂多糖(LPS)的持续刺激下产生免疫抑制后的表型变化及对T细胞影响的分子机制。方法:蔗糖密度梯度离心法从全血中分离人外周血单个核细胞,结合磁珠细胞分选技术分选出单核细胞,体外诱导单核细胞分化为巨噬细胞,以未处理和IFN-γ处理为对照,对LPS处理48 h的巨噬细胞进行形态学观察、细胞表面分子(HLA-DR、CD14、CCR7、HLA-ABC及CD40)表达的检测和细胞因子(IL-10、IL-12、IL-6及TNF-α)分泌水平的检测。同时将LPS诱导的巨噬细胞与CD3+T细胞进行异体共培养,进一步观察巨噬细胞对T细胞增殖能力的影响。用实时荧光定量PCR验证Toll样受体4(TLR4)信号通路中的非My D88依赖型途径相关分子的表达水平。结果:LPS处理48 h的巨噬细胞,抗原递呈能力(HLA-DR)下降,免疫抑制细胞因子IL-10升高,把LPS诱导的巨噬细胞与异体T细胞共培养6 d,其促进CD8+T细胞增殖的能力较弱。实时荧光定量PCR结果显示LPS持续刺激下巨噬细胞的TRIF、IRF3和CIITA均呈下调状态。结论:持续LPS处理巨噬细胞48 h后,巨噬细胞呈现一种免疫抑制的状态,且其刺激CD8+T细胞增殖的能力减弱,这种状态与非My D88依赖型TLR4信号通路受损有关。     

内毒素预处理促进金黄色葡萄球菌刺激的巨噬细胞生成一氧化氮

目的：明确脂多糖（LPS）预处理后巨噬细胞对后续热灭活革兰氏阳性金黄色葡萄球菌（HKSa）刺激的反应性变化,并探讨其机制。方法：Griess法检测细胞培养上清一氧化氮（NO）含量;实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测Toll样受体2（TLR2）mRNA和蛋白表达;双荧光报告基因检测法观察细胞内活化T细胞核因子（NF-AT）转录活性。结果：LPS预处理小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞24 h后,该细胞在后续HKSa刺激下NO生成量显著增加,提示LPS可以致敏巨噬细胞、增强其对HKSa的反应性。LPS可以剂量依赖性地增加细胞内TLR2 mRNA和蛋白表达;LPS预处理也可增强TLR2特异性配体肽聚糖刺激巨噬细胞NO生成的效应;TLR2特异性中和抗体可部分阻断LPS的致敏效应。LPS可促进NF-AT转录激活,细胞内钙离子（Ca2+）螯合剂BAPTA/AM和calcineurin抑制剂cyclosporin A(CsA)均可阻断LPS的作用;BAPTA/AM和CsA均能显著抑制LPS的致敏效应。结论：LPS可以致敏巨噬细胞,从而使其在后续HKSa作用下NO生成量增加;模式识别受体TLR2和Ca2+/calcineurin/NF-AT信号转导途径可能参与了LPS的这一致敏效应。