Fasudil通过TLR4通路抑制脂多糖诱导的小鼠BV-2小胶质细胞TNF-α和IL-1β的表达

目的探讨Fasudil对脂多糖(LPS)诱导BV-2小胶质细胞系促炎细胞因子表达中的作用。方法体外培养BV-2小胶质细胞系,实验分为PBS对照组、LPS刺激组、LPS联合Fasudil干预组,ELISA检测细胞TNF-α、IL-1β的释放,Griess法检测NO释放水平,流式细胞术检测Toll样受体4(TLR4)、TLR2蛋白表达。结果 LPS刺激BV-2细胞可导致TNF-α、IL-1β和NO的释放明显增加,还可导致炎性信号通路中的受体TLR4表达明显增加。Fasudil能明显抑制炎性因子的释放和TLR4的表达。结论 Fasudil可抑制LPS诱导的小胶质细胞NO、TNF-α和IL-1β释放,其作用机制可能与Fasudil下调TLR4通路有关。     

法舒地尔(Fasudil)抑制脂多糖诱导的小鼠星形胶质细胞活化和炎性反应及其机制

目的探讨法舒地尔(Fasudil)对脂多糖(LPS)诱导的星形胶质细胞活化和炎症反应及Toll样受体4(TLR4)/核因子κB(NF-κB)信号通路的影响。方法体外培养新生C57BL/6小鼠大脑皮质星形胶质细胞,细胞分为PBS对照组、1μg/m L LPS刺激组、1μg/m L LPS联合15μg/m L盐酸法舒地尔处理组,Griess法检测培养细胞上清液一氧化氮(NO)的水平,ELISA检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、IL-10和IL-4的水平,免疫荧光细胞化学染色检测星形胶质细胞胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)及TLR4的表达,Western blot法检测GFAP、TLR4和磷酸化的NF-κBp65(p-NF-κBp65)蛋白水平。结果与PBS组比较,LPS组NO、TNF-α和IL-6水平显著升高,IL-10和IL-4水平降低;法舒地尔能抑制LPS诱导的NO、TNF-α和IL-6的分泌,增加IL-10和IL-4的分泌。法舒地尔处理组星形胶质细胞GFAP表达显著降低,同时TLR4和NF-κB蛋白的水平也降低。结论法舒地尔阻断TLR4/NF-κB信号通路抑制LPS诱导的星形胶质细胞活化及炎性反应。     

羟基积雪草苷对LPS诱导小胶质细胞增殖的抑制作用及机制研究

目的:研究羟基积雪草苷对LPS刺激的小胶质细胞增殖的抑制作用及机制。方法:取SD大鼠的新生小鼠,进行小胶质细胞的原代培养,分离纯化小胶质细胞;MTT法筛选LPS刺激小胶质细胞增殖的最佳浓度,观察不同浓度羟基积雪草苷对LPS刺激小胶质细胞后的作用。ELISA检测细胞上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)的含量,流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡,Western blotting法检测Toll样受体4(TLR4)蛋白的表达,RT-PCR检测NF-κB mRNA的表达。结果:LPS可以明显诱导体外培养小胶质细胞的增殖和炎症因子释放。与LPS组比较,羟基积雪草苷对LPS诱导的小胶质细胞增殖具有显著抑制作用,且具有剂量依赖性,羟基积雪草苷处理小胶质细胞48 h的IC50为10.97 nmol/L。同时羟基积雪草苷使小胶质细胞TNF-α和IL-6的释放显著降低(P0.05);羟基积雪草苷使小胶质细胞的G2期细胞与细胞凋亡率增加,并降低小胶质细胞TLR4和NF-κB的表达。结论:羟基积雪草苷对LPS刺激的小胶质细胞的增殖和炎症因子的生成具有抑制作用,其作用机制可能与抑制TLR-4和NF-κB表达、改变细胞周期并诱导细胞凋亡有关。     

表没食子儿茶素没食子酸酯对IFN-γ/LPS刺激的小鼠髓源性巨噬细胞极化的影响

目的:探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对IFN-γ/LPS刺激的小鼠髓源性巨噬细胞促炎细胞因子表达的影响。方法:取6~8周龄C57BL/6小鼠骨髓细胞,经100 ng/ml巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)体外诱导分化为骨髓巨噬细胞(BMDM),加入50 ng/ml干扰素γ(IFN-γ)和1μg/ml细菌脂多糖(LPS)刺激,并同时暴露于12.5~50μmol/L EGCG处理48 h,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测巨噬细胞促炎细胞因子IL-1β、TNF-α和i NOS的mRNA表达水平和蛋白含量。结果:IFN-γ和LPS处理可刺激巨噬细胞IL-1β、TNF-α和i NOS表达显著上调,而EGCG则能抑制IFN-γ和LPS刺激的IL-1β、TNF-α和i NOS表达,且存在剂量依赖性。结论:EGCG能够减弱IFN-γ和LPS刺激的髓源性巨噬细胞的促炎作用。     

LPS刺激诱导人卵巢癌细胞株Toll样受体4表达及细胞免疫调节

目的 探讨脂多糖(LPS)刺激对体外培养的人卵巢癌细胞株SKOV3的生长、Toll样受体4(TLR4)的表达、细胞活性氧(ROS)表达及6种炎性细胞因子分泌水平变化的影响.方法 用流式细胞仪测定不同浓度LPS刺激SKOV3 4 h后TLR4的表达水平;用LPS分别刺激SKOV3细胞不同时间后,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞仪分析TLR4表达、细胞周期分布、ROS表达水平以及细胞因子分泌水平.结果 TLR4表达与LPS作用浓度之间存在浓度依赖性和最大量效曲线关系;LPS刺激组与正常组的细胞增殖、细胞周期PrI值(细胞增殖指数,S+G_2/M)、ROS表达水平、细胞因子分泌水平均有显著性差异.结论 LPS具有诱导卵巢癌细胞TLR4表达、活性氧表达、炎症因子分泌以及细胞增殖和抑制的作用.     

HCV刺激小胶质细胞后TLR9蛋白的表达及其与MCP-1、TNF-α的关系

目的:了解在体外培养条件下雨型肝炎病毒(HCV)刺激小鼠小胶质细胞(BV2)后Toll样受体9(TLR9)蛋白的表达变化及其对MCP-1(人单核细胞趋化蛋白-1)和TNF-α分泌的影响,探讨HCV感染中枢神经系统(CNS)后小胶质细胞TLR9蛋白的表达及其相应细胞因子的变化.方法:体外培养BV2细胞,分为HCV阳性血清组、正常人血清组、空白对照组.每组各20例细胞样本.在12 h收集细胞和上清液,用流式细胞术检测TLR9蛋白的表达,ELISA法检测培养上清中MCP-1和TNF-α的含量,并应用SPSS11.0统计软件包进行统计学分析.结果:(1)各组BV2细胞均有TLR9蛋白的表达,HCV阳性血清组中TLR9蛋白的表达高于正常人血清组、空白对照组(P＜0.01);正常人血清组和空白对照组无统计学差异(P＞0.05);(2) HCV阳性血清组MCP-1和TNF-α含量高于正常人血清组、空白对照组(P＜0.01);且HCV阳性血清组TLR9蛋白的表达量与MCP-1和TNF-α的分泌可能呈正相关.结论:HCV阳性血清刺激可使体外培养的BV2细胞表达TLR9蛋白增高,且可能诱导了MCP-1和TNF-α的分泌.TLR9蛋白可能参与了HCV在中枢神经系统感染中的早期固有免疫应答.     

FTY720抑制TLR4信号转导的炎症反应

FTY720是一种1-磷酸神经鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate,S1P)受体拮抗剂。为阐明FTY720抑制炎症反应的机理,本研究采用流式细胞术检测FTY720对细菌脂多糖(LPS)刺激后小鼠脾脏细胞TLR4表达水平的影响。研究发现,注射适当剂量的FTY720可削弱LPS所引起的TLR4表达水平增强(FTY720处理组与对照组相比,TLR4+细胞构成比分别为6.7%±1.5%和38.6%±3.1%,P<0.01),并可消除LPS刺激所引起的外周血TNF-α、IFN-γ和IL-12等Th1型细胞因子表达水平增高(FTY720组血清TNF-α、IFN-γ和IL-12浓度分别为(72±22)ng/ml、(46±21)ng/ml和(19±4)ng/ml,LPS组分别为(300±75)ng/ml、(175±35)ng/ml和(50±8)ng/ml,均为P<0.01)。相反,FTY720组血清Th2型细胞因子IL-4水平与对照组相比分别为(7±3)ng/ml和(7±2)ng/ml,无显著性差异。在体外细胞培养实验中可观察到一致的结果。这些发现提示,FTY720可能通过抑制LPS/TLR4信息转导通路,下调TNF-α、IFN-γ和IL-12等Th1型细胞因子表达而抑制炎症反应。     

Toll样受体4和巨噬细胞移动抑制因子对血管内皮细胞生物活性的影响

目的:探讨Toll样受体4(TLR4)和巨噬细胞移动抑制因子(MIF)对ECV304内皮细胞增殖、黏附及炎症因子水平的影响。方法:ECV304细胞经TLR4 MIF单克隆抗体(mAb)和脂多糖(LPS)处理后,通过3H-TdR掺入实验、黏附实验和放射免疫分析研究细胞增殖、黏附和细胞因子水平。结果:LPS(10 mg/L)明显促进ECV304细胞TLR4的表达,而抗MIF mAb(10、50 mg/L)明显抑制其表达。抗MIF(50 mg/L)和抗TLR4mAb(1 mg/L)明显抑制了ECV304细胞的增殖,而LPS(10 mg/L)明显促进增殖。抗MIF mAb明显抑制了人外周血淋巴细胞对ECV304细胞的黏附,而LPS和抗TLR4 mAb对黏附无显著影响。抗MIF、抗TLR4 mAb明显抑制ECV304细胞TNFα的分泌,并呈剂量依赖,而LPS作用相反。与对照组相比,LPS(1 mg/L,48 h)可以促进ECV304细胞IL-8的分泌,抗MIF mAb(50 mg/L,48 h)可以明显抑制IL-8的分泌(P0.05)。但是抗TLR4 mAb(1 mg/L)对ECV304细胞IL-8的分泌无明显影响。结论:LPS、抗TLR4及抗MIF mAb对血管内皮细胞TLR4表达及活性有显著影响。     

UⅡ／UT系统对LPS刺激枯否细胞固有免疫炎症信号通路TLR4-IRF3的影响

目的：探讨Urotensin Ⅱ（ UⅡ）/UT系统对脂多糖（ Lipopolysaccharide ,LPS）刺激枯否细胞（ Kupffer cell ,KC）固有免疫炎症信号通路Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4）-干扰素调节因子3（Interferon regulatory factor 3,IRF3）的影响。方法：体外分离培养大鼠肝KCs,KCs培养上清液促炎性细胞因子IL-6、IFN-β和IFN-γ分泌水平采用ELISA分析检测,细胞表面TLR4的表达采用流式细胞技术分析,IRF3基因和蛋白表达情况分别采用real-time PCR和Western blot 分析方法检测。结果：LPS刺激后,KCs培养上清液IL-6、IFN-β和IFN-γ分泌水平、细胞表面TLR4表达阳性细胞率及细胞内IRF3 mRNA表达水平均显著升高,UT拮抗剂urantide预处理抑制了LPS刺激诱导KCs对上述分子的上调表达;LPS的应用也造成了KCs胞核内IRF3蛋白表达水平升高,而使胞浆内IRF3蛋白表达水平降低,urantide预处理后,抑制了LPS诱导KCs核内IRF3蛋白上调和胞浆水平下调。结论：UⅡ/UT系统通过对TLR4-IRF3通路的正性调控作用,介导了或至少部分介导了LPS刺激KCs的免疫性炎症分泌效应。     

MBL对LPS刺激的不同分化和活化状态THP1/CD14细胞产生TNF-α和IL-12的影响

目的探讨甘露聚糖结合凝集素（MBL）对脂多糖（LPS）刺激的不同分化和活化状态THP1/CD14细胞产生TNF-α和IL-12的影响.方法用PMA和/或IFN-γ诱导不同分化和活化状态的THP1/CD14细胞,以不同浓度人MBL预处理2 h后再用光滑型LPS刺激24h.收集培养上清,以ELISA从蛋白水平分析其TNF-α和IL-12 p40＋p70的产生.收集细胞提取总RNA,以RT-PCR从转录水平评估TNF-α和IL-12的表达.结果ELISA检测发现,LPS可刺激各组细胞分泌TNF-α和IL-12 p40＋p70;IFN-γ活化的THP1/CD14细胞产生IL-12 p40＋p70最高,PMA分化的THP1/CD14细胞最低;PMA分化＋IFN-γ活化的THP1/CD14细胞分泌TNF-α最高,未用PMA或IFN-γ预刺激的THP1/CD14细胞最低.高浓度MBL（50～100 mg/L）可抑制LPS诱导细胞分泌TNF-α和IL-12 p40＋ p70的作用,低浓度MBL（1～10 mg/L）则几无影响.RT-PCR分析亦显示,与相应只用LPS刺激的实验组相比,高浓度MBL（50 mg/L）对不同实验组LPS诱导的TNF-α、IL-12 p35和p40的mRNA表达均有不同程度的抑制作用.结论MBL可抑制LPS诱导的不同分化和活化状态THP1/CD14细胞产生TNF-α和IL-12,THP1/CD14细胞可用做进一步剖析MBL在免疫应答与细胞因子网络调控中的作用及其机理的模型.