海洋假单胞杆菌褐藻胶裂解酶基因在大肠杆菌中的高效表达和活性检测

利用PCR方法从假单胞杆菌基因组DNA扩增胞外褐藻胶裂解酶的全基因和缺损片段,构建表达质粒pQE30-aly32和pQE30-aly165,并在大肠杆菌M15中成功表达。表达的重组蛋白大部分存在于包涵体中,经洗涤,变性和复性,镍柱亲和层析纯化,获得了电泳纯的Aly32和Aly165。酶活性检测发现,仅Aly165具有较强活性,108 u/mg,该酶对poly(G)和poly(M)都有活性,对poly(M)更敏感。对表达体系进行优化,确定IPTG的最佳浓度为0.6mmol/L,最佳诱导菌液密度OD600为0.5~0.6,最佳表达时间为3h,28℃低温诱导可以提高重组蛋白的可溶性,可溶性蛋白相对表达量达到25%。     

荧光素酶表达载体构建及其在巴斯德毕赤酵母的表达

萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase,FL)是ATP快速检测技术的核心组件,通过荧光强度与ATP浓度的对应关系,在食品行业检测微生物数量发挥着重大作用。本文为实现荧光素酶在重组毕赤酵母GS115中的异源表达,通过从载体pGL2-control中扩增荧光素酶基因luc,克隆到真核表达载体p PIC9K中,线性化后电击转化毕赤酵母GS115菌株,筛选阳性重组菌株。在甲醇的诱导下进行酶的表达,对粗酶液进行生物活性发光分析,然后对粗酶进行超滤、阴离子层析和分子筛凝胶层析三步纯化。甲醇诱导表达96 h发现胞外和胞内粗酶液均有相对较高的酶发光活性,酶活分别为1.45×10~6 RLU/mL和1.58×10~9 RLU/mL。SDS-PAGE与Western blot分析重组荧光蛋白大小约为70 ku,最终纯化得到的荧光素酶,其比活为7.0×10~8 RLU/mg,纯化倍数达到19.3倍,产量为48 mg/L。以上结果表明,荧光素酶能够在毕赤酵母表达系统获得较好的表达和纯化效果。     

pfs基因原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化

以植物乳杆菌KLDS1.0391的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增得到pfs基因,与Gen Bank中的序列对比发现同源性为99%。将目的基因与表达载体p QE-30连接,并将重组质粒p QE-30-pfs转化到E.coli M15中。异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白,经SDS-PAGE分析,在全菌体蛋白中含有一条明显的特异性蛋白条带,大小约为27.4ku。经Ni-NTA纯化系统纯化后,在SDS-PAGE凝胶电泳图上获得纯化产物的条带。结果表明,原核表达载体p QE-30-pfs构建成功,且Pfs蛋白在大肠杆菌中成功表达,采用Ni-NTA纯化系统成功纯化了重组蛋白Pfs,为体外合成AI-2(Autoinducer-2)奠定了基础。     

噬夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora)类胡萝卜素合成相关基因crtE的克隆及其在大肠杆菌中的表达

噬夏孢欧文氏菌基因crtE编码GGPP合成酶。通过PCR扩增获得crtE基因,克隆进表达载体,构建表达质粒pET-15bcrtE。重组质粒转化E.coli BL21(DE3),构建工程菌;重组GGPP合成酶在大肠杆菌中实现了高效表达,表达量占菌体总蛋白的42%。重组蛋白以包含体形式存在,包含体经洗涤、尿素溶解、复性并经镍离子亲和层析树脂纯化,得到了电泳纯的重组噬夏孢欧文氏菌GGPP合成酶,带有His-tag的该蛋白分子量为34kDa,pI值为6.3。     

应用不同载体探索环二肽合成酶AlbC的高效可溶性表达

AlbC是一种环二肽合成酶，可用于合成具有抗菌性和抗肿瘤性的环二肽及后续衍生物。近年来，AlbC的产物在白酒及其副产物黄水中被相继检出，对赋予白酒健康功能起着至关重要的作用。为实现albC基因的高效可溶性表达，本研究以实验室保藏的枯草芽孢杆菌Y1为模板克隆出albC基因，构建了pQE30-albC,pET28a-albC,pET28a-SUMO-albC,pGEX-6P-1-albC 4个重组质粒，并探究了不同诱导温度下每个重组质粒的诱导表达情况。结果表明：（1）pQE30-albC不表达或者表达量低；pET28a-albC正确表达，但表达量和可溶性表达量都较低，纯化后融合蛋白浓度为1.0 mg/L;pET28aSUMO-albC正确表达，且实现可溶性表达，纯化后融合蛋白浓度为30 mg/L，切除SUMO标签蛋白后浓度为22 mg/L;pGEX-6P-1-albC正确表达，且实现可溶性表达，纯化后融合蛋白浓度为44 mg/L，切除GST标签蛋白后浓度为34 mg/L;(2)拥有GST促溶标签的pGEX-6P-1载体是4组载体中达到albC基因可溶性表达水平最高的载体；（3）在4种载体中...     

靶向奶牛Lepr基因的miR-30d报告基因载体构建及靶向验证

构建靶向奶牛Lepr基因的miR-30d荧光素酶报告基因载体,验证奶牛乳腺中瘦素受体基因(Lepr)是否为miR-30d的生物学靶基因。将microRNA荧光素酶表达报告载体特异性改造,使其含有TargetScan预测的与miR-30d靶向结合的奶牛Lepr基因序列,对miR-30d与重组荧光素酶载体质粒共转染后的细胞裂解液进行荧光素酶活性检测分析。结果表明,靶向奶牛Lepr基因的miR-30d荧光素酶表达报告载体构建成功,奶牛Lepr基因是miR-30d的靶基因,旨为miR-30d与Lepr基因的相互作用及与此基因相关的乳腺生物网络调控研究奠定实验基础。     

Streptoverticillium mobaraense谷氨酰胺转胺酶的表达、纯化和复性

以基因组DNA为模板 ,利用PCR技术从茂原轮链丝菌 (Streptoverticilliummobaraense)中扩增得到产成熟谷氨酰胺转胺酶MTG的结构基因mtg ,克隆于表达载体pQE 3 0T ,构建成lac启动子控制下的His6融合表达质粒pMTG ,将此重组质粒转化到受体菌E .coliM1 5中。对质粒稳定性的研究表明 ,E .coliM1 5在无选择压的情况下 ,于 3 7℃连续转接 5次 ,质粒丢失率仅有 2 4%,说明质粒基本稳定。重组菌经IPTG诱导 ,表达的重组谷氨酰胺转胺酶占菌体总蛋白的 1 8%,经SDS PAGE分析 ,表达的蛋白质的分子质量为 3 8ku ,与预期分子质量相符。表达产物主要以包涵体的形式存在。细胞经超声破碎 ,离心取包涵体溶于 8mol/L的尿素中 ,然后通过Ni NTA亲和柱分离纯化和稀释法复性。目的蛋白的纯度可达 95 %以上。比酶活为 1 0 3U/mg。     

精氨酸脱亚胺酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及纯化

通过PCR扩增得到菌株编码ADI的arcA基因,并构建表达载体pET24a-ADI。将该载体导入大肠杆菌BL21(DE3),获得高效表达ADI基因的重组菌。对ADI诱导表达条件进行优化,结果发现宿主菌在A600达到1.0时加入0.2 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),在30℃诱导4 h酶活最高,为2.04 U/mL发酵液。经超声波破碎、HiPrep DEAE FF阴离子交换层析、SuperdexTM200凝胶过滤层析,可获得SDS-PAGE电泳纯重组精氨酸脱亚胺酶(rADI)。rADI相对分子质量大小为92 600,由两个相同亚基组成,纯化后的rADI比酶活达20.9 U/mg。     

牛凝乳酶原基因在大肠杆菌中的高效表达及活性检测

以实验室保存的携带凝乳酶原前体基因的重组载体pMD 19-T/bPPC为模板克隆凝乳酶原基因,经双酶切后与载体pET-30a连接得到重组载体pET-30a/bPC,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,采用SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况。重组蛋白经变性/复性、DEAE-Sepharose Fast Flow纯化和自催化后检测凝乳活性。结果表明,重组凝乳酶原基因在大肠杆菌中高效表达,表达量占菌体总蛋白的68%,采用Arima K方法检测,其凝乳活力达到80 SU/mL。因此,通过大肠杆菌表达系统大量制备具有生物活性的重组牛凝乳酶原的策略是可行的,研究结果为弥补国内天然牛凝乳酶的短缺提供一种途径。     

重组黏质沙雷菌脂肪酶的可溶性表达及其性质研究

目的 提高重组黏质沙雷菌ECU1010脂肪酶(GST-lipase)可溶性表达量,研究其相关理化性质.方法 PCR扩增lipase基因,与表达载体pGEX-4T-1连接后转入E.coli BL21(DE3),优化培养提高可溶性表达量,表达产物用GST亲和层析柱纯化.研究温度、pH等对酶活性的影响,重组酶的底物特异性以及对(±)-MPGM的手性拆分.结果 优化后可溶性酶的活性可达8 612.3 U/L,纯化9.8倍后比活性为3.3 U/mg.重组脂肪酶的最适反应温度为30℃,最适pH为9.0.温度低于30℃、pH 6.0～6.8的条件下比较稳定.C2+,Fe2+等金属离子和一些非离子表面活性剂能提高酶的活性.硝基苯月桂酸酯(C12)是其最适底物.以(±)-MPGM为底物,4 h后转化率达到47.3%,ee值为89.7%.结论 优化后可溶性脂肪酶的活性大大提高,研究了重组脂肪酶的相关性质,为地尔硫(草)的工业化生产奠定了基础.