5-羟色胺1A受体激动剂高通量筛选模型的建立

目的为发现5-羟色胺1A(5-HT1A)受体的激动剂,通过报告基因活性检测的方法建立高通量筛选(HTS)细胞模型。方法将带有人源5-HT1A受体的真核表达质粒pcD-NA3.1(pcDNA3.1-h5-HT1AR)与带有报告基因pCRE-luc的pcDNA3.1质粒(pcDNA3.1-pCRE-luc)共转染到工具细胞中,通过对工具细胞选择、共转染质粒比例、化合物孵育时间及阳性化合物选择等条件进行探索和优化,建立了稳定表达人源5-HT1A受体并可用于该受体激动剂筛选的细胞模型(HEK293-h5-HT1AR)。结果①根据瞬转实验中信号值的高低,模型采用HEK293细胞作为工具细胞;②根据瞬转实验中的信噪比,发现pcDNA3.1-h5-HT1AR:pcDNA3.1-pCRE-luc的最佳比例为1∶3;③对化合物孵育时间进行优化,选择的最佳孵育时间为6 h;④阳性化合物的选择过程中,实验研究了5-HT.HCl,Flibanserin,8-OH-DPAT以及Lorcaser-in(APD356)4个已报道有5-HT1A受体激动活性的化合物,结果表明APD356在该体系中最适合作为阳性对照化合物。⑤该细胞株连续培养12代,信号稳定。结论通过对一系列实验条件进行选择和优化,建立了一个稳定表达人源5-HT1A受体的细胞模型,该模型可用于高通量5-HT1A激动剂的筛选。     

利用猪脱氧胆酸合成细胞核肝X受体激动剂

利用来自畜牧业的丰富原料猪脱氧胆酸为甾体骨架研究细胞核肝X受体（LXR）激动剂，合成了3个胆酸衍生物；在体外培养的人胚胎肾细胞HEK293内，使用双荧光报告基因法测定目标物调节LXR的能力。结果显示，合成的3个化合物中，化合物1、2可以激活LXRα和LXRβ，而化合物3有亚型选择性，只对LXRα有激活作用。这类化合物有望成为调控体内胆固醇代谢的临床药物。     

毒蕈胆碱M_1受体激动剂的高通量筛选模型

目的　建立毒蕈碱样胆碱M1 受体激动剂的高通量筛选模型 ,以此模型进行M1 受体激动剂筛选。方法　将M1 受体基因质粒 (M1 /pCDNA3 1 )与报告基因质粒 (3×CRE/ 3×MRE/SRE LUC)按 1∶5的比例共转染HEK2 93 ,建立了一个稳定的M1 受体激动剂报告基因筛选细胞株。配体与细胞表面M1 受体结合后 ,激活相应的信号通路 ,调节报告基因的表达 ,通过测定荧光酶素报告基因表达水平的变化 ,评估配体激活M1 受体的生物活性。结果　通过对筛选条件 ,如细胞数目、荧光素酶表达时间、底物浓度的优化 ,建立了可靠的筛选方法 ,并对多种抗衰老中药水提物进行了筛选 ,找到 3种对M1 受体有活性的中药。结论　该系统能准确、稳定、有效地应用于M1 受体激动剂的高通量筛选     

核受体PXR、CAR、LXR和FXR作为代谢性疾病治疗靶点的研究进展

PXR、CAR、LXR 和FXR 是核受体家族的重要成员,在体内广泛分布,经配体活化后调控众多机体代谢相关的酶、转运蛋白和信号途径,在糖异生、脂类代谢及其胆汁平衡中扮演着重要的角色。通过主要介绍核受体家族主要成员PXR、CAR、LXR和FXR 在糖异生、脂类代谢以及胆汁平衡中的调控作用,从而可能为糖脂代谢和胆汁平衡紊乱相关代谢性疾病的药物治疗提供新依据。     

TNF-α 3'-UTR双荧光素酶报告基因系统的构建及丹参酮类药物筛选

目的构建并鉴定p GL3-TNF-α3'端非翻译区(UTR)双荧光素酶报告基因(DLR)表达系统,以此基于调控TNF-α转录后水平对丹参酮类成分进行筛选。方法反转录人脐静脉内皮细胞HUVEC的mRNA成c DNA,以之为模板,PCR扩增含TNF-α3'-UTR的DNA片段全长,经酶切后连接至荧光素酶报告载体p GL3-control上,构建出p GL3-TNF-α3'UTR全长的荧光素酶报告基因载体并进行鉴定。将所构建的p GL3-TNF-α3'UTR与p SVRenilla质粒组成双荧光素酶报告系统共转染至单核巨噬细胞RAW264.7,经脂多糖诱导后利用该双荧光素酶报告基因表达系统判定丹参酮类成分对TNF-α转录后调控是否有影响。结果成功构建p GL3-TNF-α3'UTR荧光素酶报告基因,克隆获得的DNA片段大小及序列与Genbank报道的一致。脂多糖(LPS)可以明显诱导转入p GL3-TNF-α3'UTR载体细胞的荧光强度。丹参酮类成分中隐丹参酮可以明显降低LPS诱导的p GL3-TNF-α3'UTR载体细胞的荧光素酶活性。结论成功构建含TNF-α3'UTR区的双荧光素酶报告基因表达系统,并以此从丹参酮类化合物中筛选出隐丹参酮,可以对TNF-α的转录后水平进行抑制调控。     

基于报告基因和PPARγ信号通路的药物筛选模型的建立

目的　建立基于报告基因和PPARγ(peroxisomeprolif erator activatedreceptorγ)信号通路的药物筛选模型,用此模型筛选具有胰岛素增敏活性的小分子化合物。方法　五种细胞分别进行瞬时转染,将含有目的片段PPRE(peroxisomeproliferatorresponseelement)和报告基因荧光素酶(Luc)的质粒及表达PPARγ的质粒共转染到细胞中,通过测定荧光素酶活力来考察马来酸罗格列酮对PPARγ信号通路的影响,选取诱导表达倍数最高的细胞株建立模型。用其他类型核受体激动剂对此模型进行特异性考察。结果　293T细胞中,荧光素酶的表达受马来酸罗格列酮的诱导倍数最高,可达4 9倍,并呈现一定的剂量依赖关系,Z′因子为0 .72。而其他各类核受体激动剂的诱导表达率均在1倍左右。马来酸罗格列酮在转染剂量范围内无促进细胞增殖的作用。结论　马来酸罗格列酮对共转染报告基因质粒和表达PPARγ质粒的293T细胞Luc的表达具有较强的诱导作用,此模型具有较好的特异性和稳定性,适用于建立筛选PPARγ激动剂的高通量筛选模型。     

肝X受体激动剂对 RAW264.7细胞摄取Ac-LDL能力的影响

目的:研究肝X受体激动剂3β-羟基-5α,6α-环氧胆烷酸甲酯(MHEC)和T-0901317对小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞摄取乙酰化低密度脂蛋白(Ac-LDL)能力的影响。方法:以5×10~5/孔培养的RAW264.7细胞为巨噬细胞模型,实验分为5组:①空白对照组;②MHEC组;③MHEC 9-顺式视黄酸(9-cRA)组;④T-0901317组;⑤T-0901317 9-cRA组。药物终浓度均为10μmol·L~(-1),作用24h,用Dil荧光标记的Ac-LDL(Dil-Ac-LDL,10 mg·L~(-1))孵育RAW 264.7细胞4h,应用流式细胞仪检测RAW 264.7细胞的荧光强度。结果:MHEC和T-0901317均可抑制RAW264.7细胞对Ac-LDL的摄取。维甲酸X受体(RXR)激动剂9-cRA与T-0901317联合作用时,RAW 264.7细胞对Ac-LDL的摄取受到更明显的抑制。结论:肝X受体激动剂MHEC和T-0901317均可抑制巨噬细胞对Ac-LDL的摄取。     

基于报告基因检测的β3肾上腺素受体激动剂筛选模型的建立与应用

目的：建立基于双荧光素酶报告基因检测的β3肾上腺素受体（β3-AR）激动剂筛选模型,并用于β3-AR激动剂的筛选。方法：应用免疫细胞化学法鉴定β3-AR在β3-CHO细胞上的稳定表达,并将pCRE-luc质粒与pRL-TK质粒共同瞬时转染β3-CHO细胞,建立一种基于双荧光素酶报告基因检测的β3-AR激动剂筛选模型。通过检测报告基因萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶活性的比值,来间接反映配体对β3-AR的激动活性。并以β-AR激动剂异丙肾上腺素刺激对模型的有效性进行验证,在此基础上以此模型对20种新化合物的β3-AR激动活性进行筛选。结果：β3-CHO细胞经免疫细胞化学法鉴定有特异性受体蛋白表达。通过将两个报告基因质粒转染该细胞后,与加入溶剂对照相比,加入异丙肾上腺素可显著促进荧光素酶报告基因的表达,表明该模型有效、可靠。以此模型从20个化合物中初筛出8个活性较强的β3-AR激动剂。结论：本研究建立了基于双荧光素酶报告基因检测的β3-AR激动剂筛选模型,并以此模型筛选发现了几个活性较强的β3-AR激动剂。     

肝X受体激动剂对RAW 264.7细胞ABCA1蛋白表达和TNF-α、IL-6产生和分泌的影响

目的:研究肝X受体激动剂3β-羟基-5α,6α-环氧胆烷酸甲酯和(MHEC)T-0901317对小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)蛋白表达和TNF-α、IL-6产生和分泌的影响.方法:应用免疫细胞化学染色法检测RAW264.7细胞ABCA1蛋白表达的影响;应用夹心法ELISA检测细胞培养上清液中TNF-α和IL-6的浓度,分析肝X受体激动剂对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的巨噬细胞TNF-α、IL-6产生和分泌的影响.结果:3β-羟基-5α,6α-环氧胆烷酸甲酯和T-0901317均可显著促进RAW264.7细胞ABCA1蛋白的表达;与维甲酸X受体激动剂9-顺式视黄酸联合作用时,ABCA1蛋白表达增加更为显著.氧化低密度脂蛋白可促进RAW264.7细胞TNF-α、IL-6的产生和分泌,而这一促进作用可部分地被3β-羟基-5α,6α-环氧胆烷酸甲酯和T-0901317所抑制.结论:肝X受体激动剂MHEC和T-0901317均可上调RAW264.7细胞ABCA1蛋白表达,并可减少氧化低密度脂蛋白诱导的巨噬细胞中TNF-α、IL-6的产生和分泌.     

降血糖药物对细胞色素P 450 3A 4的转录调节作用

观察几种降血糖药物是否能通过活化孕烷X受体(PXR)诱导细胞色素P450 3A4(CYP 3A4)的转录表达。在人肝肿瘤细胞株HepG2细胞中,用瞬时共转染报告基因实验进行几种降血糖中药提取物在不同浓度和不同处理时间下对PXR介导的CYP 3A4的转录调节作用研究。筛选出五味子、牛蒡子、桔络3种中药提取物以及非磺脲类促胰岛素降糖药米格列奈分别作用于HepG2细胞24 h后,均能诱导PXR介导的CYP3A4基因的转录表达,诱导能力随浓度增强,而其他待测药物无类似作用。在不同处理时间的研究中,五味子、牛蒡子、桔络以及米格列奈均能在12 h~36 h内增强CYP 3A4的转录表达,诱导能力随时间延长呈增强趋势。     

A cell model for high-throughput screening GLP-1 receptor agonists北大核心CSCD

目的构建GLP-1受体激动剂高通量筛选细胞模型。方法构建pEGFP-GLP-1R-3C重组质粒,转染HEK293T细胞,用G418和流式细胞仪进行筛选。所构建的细胞系命名为HEK293T-GLP-1R-3C-eGFP细胞系。Western blot和激光共聚焦检测GLP-1R-3C-eGFP蛋白的表达。将环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)响应元件报告基因转染HEK293T-GLP-1R-3C-eGFP细胞,不同浓度的GLP-1刺激后,用一步法荧光素酶报告基因检测试剂盒检测发光值反映细胞cAMP水平,采用cAMP试剂盒(ELISA)进行验证。结果成功构建HEK293T-GLP-1R-3C-eGFP细胞系。不同浓度GLP-1刺激后,发光值变化趋势与细胞cAMP水平变化趋势相似。本实验中Z′因子的值为0.52。结论本研究建立了基于重组HEK293T细胞株,其可用于GLP-1受体激动剂高通量筛选。     

STAT5b靶控报告基因检测胰岛素受体激酶活性细胞模型的建立

目的建立方便快捷的检测胰岛素受体激酶活性的方法,为筛选抗糖尿病的药物提供一种新的细胞模型。方法用克隆有胰岛素受体基因、STAT5b基因和STAT5响应元件靶控的荧光素酶报告基因的质粒共转染CHO细胞,RT-PCR检测外源基因的表达。转染的细胞经胰岛素处理,考察胰岛素对报告基因表达的剂量和时间效应,并采用AG1024处理和PTP1B基因共转染考察模型的特异性。结果经瞬时共转染的CHO细胞中检测到胰岛素受体和STAT5b基因表达,转染细胞中荧光素酶表达受胰岛素诱导且呈浓度依赖性和时间依赖性,最高诱导表达率为6.25倍。胰岛素受体酪氨酸激酶特异性抑制剂AG1024和酪氨酸磷酸化酶1B(PTP1B)可特异地阻断胰岛素的对荧光素酶表达的诱导效应。结论该细胞模型通过报告基因表达检测胰岛素受体激酶活性,灵敏性高、特异性强,在胰岛素受体激动剂和增敏剂的筛选方面具有应用价值。     

以Insig-2基因启动子为靶点的药物筛选模型的建立

目的通过双荧光素酶报告基因检测系统建立以胰岛素诱导基因2(insulin-induced gene 2,Insig-2)启动子为靶点的药物筛选模型。方法将人Insig-2基因启动子序列克隆入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,构建重组质粒pGL3-Insig-2并与内参质粒pRL-TK瞬时共转染工具细胞,通过检测荧光素酶报告基因表达水平的变化反映Insig-2基因启动子启动转录的活性,并对共转染质粒比例、工具细胞选择等条件进行探索和优化,相关药物处理进行验证。结果成功构建了重组质粒pGL3-Insig-2;确认pGL3-Insig-2:pRL-TK共转染比例为4∶1,确定3T3-L1细胞为工具细胞;1,25-(OH)2D3、小檗碱和姜黄素均能明显增强Insig-2基因启动子活性。结论成功建立了以Insig-2基因启动子为靶点的药物筛选模型,为筛选新型调脂药奠定基础。     

LXR激动剂3β-羟基-5α、6α仪环氧胆酸甲酯对血管内皮细胞ABCA1、LXRα表达的影响

目的初步研究LXRα激动剂3β-羟基-5α、6α环氧胆酸甲酯(Methyl 3β—hydroxy-5α、6α-epoxycholanate MHEC）对体外培养的人ECV-304血管内皮细胞ABCA1mRNA、LXRαmRNA表达的影响，探寻血管内皮细胞中LXR途径激活的机制及意义，并为国产LXR激动剂MHEC作为临床药物应用的可能性提供实验依据。方法以ECV-304血管内皮细胞株为研究对象，应用RT-PCR方法栓测LXR激动剂MHEC作用前后细胞ABCAlmtLNA、LXRαmRNA表达的变化，应用免疫组化S-P法检测MHEC对ECV-304细胞ABCA1蛋白表达的影响。结果MHEC能够显著上调血管内皮细胞中ABCA1、LXRα基因的表达，并呈时间和剂量依赖性。实验证实血管内皮细胞中存在LXRα基因的自身激活机制。结论MHEC是一种强力有效的LXR激动剂，能以剂量和时间依赖的方式上调血管内皮细胞中ABCA1和LXRα基因的表达。     

肝脏X受体激动剂研究进展

肝脏X受体(LXR)属于核受体超家族成员,对脂肪代谢具有重要调控作用。研究表明LXR激动剂可能作为治疗和预防动脉粥样硬化的潜在药物,已有多个化合物处于临床前评价和生物活性筛选阶段。本文对近年来报道的LXR激动剂进行简要综述。     

基于报告基因的雌激素受体β亚型激动剂细胞筛选模型的建立

目的建立基于报告基因和雌激素受体β(estrogen receptor β，ERβ)亚型信号通路的药物筛选模型，以期发现ERβ亚型激动剂。方法构建带有雌激素应答序列(estrogen responsive element，ERE)靶序列和报告基因的诱导性表达载体pTAL-ERE-SEAP，并将其转入人胚肾(HEK293)细胞中，筛选报告基因分泌型碱性磷酸酶(secreted alkaline phosphatase，SEAP)表达受雌二醇(17β-estradiol，E₂)诱导的阳性克隆。选取相关核受体配体进行模型的特异性考察，同时考察模型的稳定性及时效量效关系，以及免疫细胞化学染色鉴定转染后ERβ的表达情况。利用此模型对本实验室样品库中的2 622个化合物进行筛选。结果转染pTAL-ERE-SEAP的HEK293细胞中，SEAP报告基因的表达受E₂的诱导并呈剂量与时间依赖关系，E₂对阳性克隆细胞无增殖作用，本模型的Z′因子值为0.7，免疫细胞化学染色结果表明，转染后ERβ表达、地塞米松以及其他配体的诱导表达率低。结论利用此模型通过测定SEAP报告基因的诱导表达水平可筛选ERβ亚型激动剂。     

基于报告基因的PPAR-α激动剂筛选体系的建立

目的基于PPAR-α受体的信号传递通路和利用双萤光素酶报告基因分析方法,建立稳定的PPAR-α激动剂体外筛选体系。方法 pcDNA3.1-PPAR-α、pGL3-PPRE-luc及pRL-CMV共转染293T细胞后,设0,0.1,1,10,50μmol·L-1非诺贝特不同浓度点进行干预后,测定每浓度点重复5个样本。对转染优化试验数据,比较均值大小选取最佳结果;对不同转染组之间的差异性比较,采用t检验和方差分析。结果浓度为0.1,1,10,50μmol·L-1非诺贝特干预组相对诱导率分别为：0.82,1.29,1.72,1.94,表现有统计学差异（P〈0.05）。结论成功建立基于PPAR-信号通路及双萤光素酶报告基因分析方法的PPAR-α激动剂筛药系统。     

外源化合物对孕烷X受体和组成型雄烷受体介导的细胞色素P4503A4和2B6转录调节共转染体系的优化

目的优化孕烷X受体(hPXR)和组成型雄烷受体(hCAR)介导的细胞色素P450(CPY)3A4和CYP2B6诱导共转染体系,提高检测系统的灵敏度。方法利用invitrogen脂质体2000共同转染表达质粒hPXR/hCAR、报告基因质粒CPY3A4/CYP2B6和内参质粒pRL-TK到HepG-2细胞中。系统以hPXR的激动剂利福平,hCAR的激动剂CITCO为阳性对照组,以二甲基亚砜(DMSO)为溶剂阴性对照组。通过调整3种质粒的转染比例,以利福平/DMSO和CITCO/DMSO的比活值,即阳性药物的诱导倍数作为优化系统灵敏度的指标,分别获得最大比值以表示系统具有最佳灵敏度。结果当共转染体系比例为hPXR/hCAR表达质粒150ng、CPY3A4/CYP2B6报告基因质粒600ng、PLR-TK内参质50ng时,转染体系的检测灵敏度最高。结论针对所使用的转染细胞系和共转染质粒,通过优化质粒的转染比例可提高系统的灵敏度,优化的共转染系统可用于药物代谢酶诱导机制的研究。     

人参皂苷Rc、Re、Rf和Rg1对药物代谢酶CYP1A1活性诱导作用研究

目的研究人参皂苷Rc、Re、Rf和Rg1能否激活h AhR受体信号通路诱导CYP1A1基因及蛋白表达。方法利用前期实验室构建的p GL4.17-CYP1A1报告基因质粒、pc DNA3.1-h AhR表达质粒与pRL-TK内参质粒共转染Hep G2细胞,检测人参皂苷Rc、Re、Rf和Rg1对AhR的转录激活效应;并利用Real-time PCR及Western blot技术对人参皂苷Rc、Re、Rf和Rg1的不同浓度、不同时间处理组进行mRNA及蛋白的检测。结果报告基因模型检测结果显示,人参皂苷Rc、Re、Rf和Rg1对AhR具有转录激活作用,其中人参皂苷Re与Rf对AhR转录激活效应明显;同时不同浓度人参皂苷Rc、Re、Rf和Rg1均能上调CYP1A1 mRNA与蛋白表达水平。结论人参皂苷Rc、Re、Rf和Rg1可以诱导CYP1A1mRNA与蛋白质水平的表达,这种诱导作用可能与上述皂苷成分激活AhR并提高其对CYP1A1的转录活性有关。     

孕烷X受体对细胞色素P4503A调控机制的研究进展

细胞色素P4503A（CYP3A）是参与临床药物代谢的主要CYP同工酶之一。孕烷X受体（PXR）属于核受体超家族（NR）的NR1 Ⅰ亚家族。该受体作为药物代谢的关键转录调控因子,参与CYP3A的诱导表达。药物可通过多种途径激活PXR受体调控cyp3a基因的表达,其中包括PXR与其他核受体、转录因子及细胞信号转导通路间的相互作用等多种途径。目前,基于PXR的筛选方法已广泛应用于早期新药研发。