KDR启动子驱动的CD/TK双自杀基因联合survivin基因干扰抑制肝癌细胞生长的体内研究

目的：探讨腺病毒介导的KDR启动子驱动的CD/TK双自杀基因系统（Ad-KDRP-CD/TK）联合survivin基因干扰对肝癌细胞在裸鼠体内生长的抑制作用。
　　方法：将20只裸鼠随机分均为模型组（皮下植入BEL-7402肝癌细胞成瘤,不加任何处理）、双自杀基因转染组（皮下植入转染Ad-KDRP-CD/TK的BEL-7402细胞,成瘤后瘤内注射前药更昔洛韦与5-氟胞嘧啶）、survivinsiRNA转染组（皮下注射BEL-7402肝癌细胞,成瘤后瘤内注射survivinsiRNA/Lip-DMEM转染混合物）、联合转染组（双自杀基因转染+survivinsiRNA转染处理）。治疗2周后处死各组小鼠,称取肿瘤质量,计算肿瘤抑制率,检测瘤组织微血管密度（MVD）及survivinmRNA与蛋白表达。结果：各治疗组的肿瘤质量明显小于模型组（均P<0.05）,且联合转染组的抑瘤率最大（均P<0.05）;肿瘤组织MVD、survivinmRNA与蛋白水平均明显降低,且联合转染组的降低程度最为明显（均P<0.05）。
　　结论：双自杀基因联合survivin干扰是抑制鼠肝癌细胞在体内生长的有效途径。     

低强度超声联合载HSV1-TK/GCV自杀基因阳离子微泡对高强度聚焦超声不完全消融后残余肝癌细胞的抑制作用

目的探讨载单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶/更昔洛韦(HSV1-TK/GCV)自杀基因的阳离子微泡联合低强度超声对高强度聚焦超声(HIFU)辐照后残留肝癌SMCC-7721细胞的抑制作用。方法以低功率HIFU辐照肝癌SMCC-7721细胞,选取最佳残存细胞亚系并稳定培养。通过低强度超声辐照载TK基因的阳离子微泡转染细胞。分为对照组(残余癌)、残余癌+超声+TK/GCV组、残余癌+微泡+TK/GCV组及残余癌+微泡+超声+TK/GCV组。以Western Blot法检测TK基因是否成功转入并稳定表达。采用流式细胞仪观察并检测基因转染效率。筛选适宜前药GCV浓度,并检测各组别相同条件下细胞存活率。以流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率。结果HIFU功率为5 W,频率为10.20 MHz,持续辐照40s,可获得残癌稳定模型。前药GCV的最适浓度为100μg/ml。相同条件下残余癌+微泡+超声+TK/GCV组癌细胞存活率最低(P0.05),仅为(43.16±3.18)%,且TK蛋白的表达明显高于其他各组(P均0.05)。结论低强度超声联合载HSV1-TK/GCV自杀基因阳离子微泡对高强度聚焦超声不完全消融肝癌细胞有明显抑制作用。     

pcDNA3/AFP/TK/Angio融合基因靶向性治疗人原发性肝癌的实验研究

目的研究pcDNA3/AFP/TK/Angio融合基因对人肝癌细胞系SMMC-7721裸鼠移植瘤模型的靶向性治疗作用。方法建立人原发性肝癌裸鼠皮下移植瘤模型,将荷瘤裸鼠随机分成肿瘤对照组、空质粒组、丙氧鸟苷（GCV）组、pcDNA3/TK/Angio组及pcDNA3/AFP/TK/Angio组5组。于瘤体内分别直接注射不同的质粒,同时于裸鼠腹腔内注射GCV,观察不同时段皮下肿瘤的生长情况并做病理学检查,免疫组化法检测肿瘤微血管密度（MVD）以及血管内皮细胞生长因子（VEGF）的表达量,原位末端标记（TUNEL）法检测细胞原位凋亡。放免法检测裸鼠血清甲胎蛋白（AFP）的变化,透射电镜观察肿瘤细胞超微结构的变化。结果裸鼠皮下成瘤率100%;pcDNA3/TK/Angio组及pcDNA3/AFP/TK/Angio组的肿瘤体积、血清AFP含量、肿瘤MVD和VEGF表达强度均明显低于对照组、空质粒组和GCV组（P〈0.05）,细胞凋亡指数都明显高于后3组（P〈0.05）,可见较多的凋亡细胞。而pcDNA3/AFP/TK/Angio组的肿瘤体积、AFP、MVD及VEGF表达强度又明显低于pcDNA3/TK/An-gio组（P〈0.05）,凋亡指数高于后者（P〈0.05）。结论pcDNA3/AFP/TK/Angio融合基因系统可显著抑制肿瘤的生长,有望成为治疗原发性肝癌的新型生物制剂之一。     

超声微泡介导HSV1-TK/GCV自杀基因系统对人肝癌细胞株HepG2的杀伤作用

目的 观察超声微泡(UM)介导HSV1-TK/GCV自杀基因系统对人肝癌细胞株HepG2的杀伤效率.方法 将HepG2接种在培养板中,随机分为以下5组:(A)空白对照组;(B)单纯质粒组;(C)超声微泡+质粒组;(D)超声+质粒组;(E)超声+超声微泡+质粒组.转染后24 h,荧光显微镜观察各组细胞绿色荧光的表达,流式细胞仪检测各组细胞的转染效率,噻唑蓝(MTT)比色法检测转染方法对HepG2活性的影响,Western blot法检测各组细胞的TK蛋白表达;转染后24h,各组细胞加入0、0.1、1.0、10.0、50.0、100.0、500.0、1000.0 mg/L共8个浓度梯度的前药更昔洛韦(GCV),72 h后MTr法检测各组细胞的存活率.结果 荧光显微镜下E组的绿色荧光强度明显高于其他各组;流式细胞仪检测基因转染率分别为0％、0.39％、0.61％、1.10％、36.00％,荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测提示E组tk mRNA相对表达量为1.13,是其余各组的7～9倍,Western blot 条带灰度分析显示E组TK蛋白的明显高于其他各组(P＜0.05);转染方法对HepG2细胞活性无明显影响(P＞0.05);GCV浓度在50 mg/L以上培养72 h后,低频超声+超声微泡+质粒组细胞几乎全部被杀灭,存活率为0,杀伤效应最强(P＜0.05),其余各组几乎无杀伤作用.结论 超声破坏微泡造影剂可提高HSV1-TK基因在HepG2中的转染和表达,增强HSV1-TK/GCV自杀基因系统对肝癌细胞的杀伤效应,而超声辐照和微泡造影剂在转染过程中对细胞的活性无影响.     

血管内皮因子-C_短发夹RNA靶向微泡联合超声辐照对裸鼠乳腺癌的抑制效应

目的探讨血管内皮生长因子-C_短发夹RNA（VEGF-C_shRNA）靶向微泡联合超声辐照对乳腺肿瘤生长的抑制作用。方法对32只雌性BALB/c裸鼠原位接种MCF-7人乳腺癌肿瘤组织。待移植瘤成瘤后,随机分为4组,G1组为空白对照,G2组采用VEGF-C_shRNA靶向微泡联合辐照,G3组为空白微泡＋辐照,G4组为VEGF-C_shRNA静脉治疗。VEGF-C_shRNA靶向微泡治疗中,采用眼球后静脉注射150μg/kg两次,每次注射微泡后采用超声定位肿瘤后对微泡进行多次辐照。观察各组乳腺癌生长的情况。结果 G2组肿瘤增长幅度明显小于其他组,尤其是在治疗后第3、7、17天其平均增殖率与G1组差异有统计学意义（P均〈0.05）,G2组与G3组比较,第3、7、10、13、17及20天的差异均有统计学意义（P均〈0.05）,G2组与G4组第7、13天以及17天的差异有统计学意义（P〈0.05）。结论 VEGF-C_shRNA靶向微泡联合辐照可以抑制裸鼠乳腺癌的生长。     

Vasostatin基因抑制裸鼠种植性肝癌血管生成的实验研究

目的：探讨人血管内皮抑制素Vasostatin基因对裸鼠种植性肝癌生长及肿瘤新生血管生成和细胞凋亡的影响。方法：建立裸鼠肝癌种植瘤模型,采用Vasostatin基因质粒（VAS组）及空壳质粒（对照组）进行瘤体内电转染,观察治疗后肿瘤生长情况,计算肿瘤体积及抑瘤率,应用免疫组织化学技术检测肿瘤微血管密度变化,TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡情况。结果：VAS组抑瘤率为31.73%。对照组、VAS组肿瘤质量分别为（1.23±0.82）g和（0.81±0.62）g;微血管密度分别为18.26±1.72和5.62±0.59;肿瘤细胞凋亡指数分别为6.25±1.32和16.48±0.96,2组间差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论：人血管内皮抑制素Vasostatin基因对裸鼠种植性肝癌生长具有明显的抑制作用,可促进肿瘤细胞的凋亡,进而影响肿瘤生长。     

血管内皮抑素微泡联合聚焦超声抗结肠癌肿瘤血管生成的实验研究

目的评估靶向载血管内皮抑素微泡联合改良聚焦超声定向辐照抑制结肠皮下易位原位结肠癌肿瘤血管生成的治疗效果。方法将65只结肠皮下易位原位结肠癌肿瘤的Balb／c裸鼠模型随机分为5组,每组13只：A组为空白对照组,裸鼠肿瘤未行任何治疗组;B组为单纯超声辐照组,仅行超声辐照,未使用任何造影剂;C组为超声辐照联合SonoVue裸微泡治疗组;D组为超声辐照联合Targestar．SA裸微泡治疗组;E组为超声辐照联合包载血管内皮抑素的微泡治疗组。分别于辐照前、辐照后1、14和28d测量肿瘤体积,绘制肿瘤体积生长曲线。实时超声造影检查,脱机分析峰值强度（PI）、局部血容量（RBV）和局部血流量（RBF）等造影参数。实验结束后切除肿瘤组织行光镜及电镜病理学检查,并通过CD34免疫组织化学检测评估肿瘤坏死面积（NA）和微血管密度（MVD）。结果辐照前各组肿瘤体积的差异无统计学意义（P〉O．05）;辐照后28d,C组、D组和E组肿瘤体积明显小于A组和B组,且E组明显小于c组和D组（均P〈0．01）。辐照前各组PI、RBV和RBF的差异均无统计学意义（均P〉0．05）;辐照后28d,C组、D组和E组PI、RBF和RBV较辐照前明显降低且明显低于A组和B组（均P〈0．05）,E组明显低于C组和D组（均P〈0．05）。电镜观察显示,C、D、E组肿瘤细胞核膜消失,核染色质溶聚,呈簇状不规则排列,线粒体空泡化和微血管内皮损伤出血,以E组最为明显,而A和B组鲜见。免疫组织化学染色显示,治疗后28d,E组肿瘤组织NA明显高于其他各组,而MVD则明显低于其他各组（均P〈0．01）。结论靶向载血管内皮抑素微泡联合改良聚焦超声定向辐照可以破坏结肠皮下易位原位结肠癌肿瘤微血管,并抑制肿瘤新生血管生成,增强结肠癌的治疗效果．将来可能是具有临床应用前景的结肠癌治疗新方法。     

载多西紫杉醇脂质微泡联合超声靶向微泡破裂对兔VX2肝癌微血管的作用

目的探讨载多西紫杉醇脂质微泡（DLLM）联合超声靶向微泡破裂（UTMD）对兔VX2肝癌微血管的抑制作用。方法建立60只兔VX2肝癌动物模型,将其随机分为6组（n=10）：单纯药物组（Doc组）、单纯载药微泡组（DLLM组）、药物＋超声组（Doc＋US组）、单纯微泡＋超声组（PLM＋US组）、载药微泡＋超声组（DLLM＋US组）及对照组,比较各组动物肿瘤组织的血管密度（MVD）、CD34及VEGF的表达。结果处理后DLLM＋US组的CD34表达水平低于其他各组,MVD明显降低,与其他各组相比差异有统计学意义（P〈0.01）;DLLM＋US组的VEGF表达水平明显低于其他各组（P〈0.01）。结论 DLLM联合UTMD能抑制兔VX2肝癌的微血管生成,从而抑制兔VX2肝癌的生长。     

血管内皮生长因子受体启动子双自杀基因治疗乳腺癌

目的 探讨腺病毒介导的KDRP-CD/TK融合基因对乳腺癌裸鼠体内抑瘤作用的特点.方法 以MCF-7细胞株建立裸小鼠乳腺癌动物模型,随机分为Ⅰ组[注射重组腺病毒AdKDRP-CDglyTK与前药5-氟胞嘧啶(5-FC)与丙氧鸟苷(GCV)]、Ⅱ组(仅注射前药5-FC与GCV)、Ⅲ组(仅注射重组腺病毒AdKDRP-CDglyTK)及Ⅳ组(空白对照,不施加任何处理).治疗结束后,计算抑瘤率、常规病理检查、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测瘤体CD/TK融合基因的表达以及微血管密度(MVD)变化的检测,同时观察该治疗体系有无系统毒性.结果 各组瘤重如下:Ⅰ组(实验组)(25.04±3.09)mg、Ⅱ组(498.07±4.47)mg、Ⅲ组(501.94±4.50)mg、Ⅳ组(503.79±6.27)mg.可见Ⅰ组肿瘤逐渐缩小,余各组肿瘤逐渐增大(F=12 727.420,P＜0.01);第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组肿瘤生长差异无统计学意义(P＞0.05);Ⅰ组有CD/TK基因表达且MVD(1.05±0.04)较对照组(4.15±0.10)变小(t=64.126,P＜0.01);常规病理检查发现Ⅰ组组织片状坏死,且该治疗体系对重要脏器无毒性作用.结论 KDR启动子驱动双自杀基因体系对裸鼠皮下移植瘤有明显的生长抑制作用,其机制涉及对肿瘤及其血管内皮细胞的双重杀伤.     

VEGF-C反义核酸对结直肠癌LoVo细胞体内生长的影响

目的：探讨VEGF-C反义核酸对结直肠癌LoVo细胞体内生长的影响。方法：20只裸鼠随机均分为实验组与对照组,实验组接种转染反义VEGF-C核酸的LoVo细胞,而对照组接种转染空白质粒的LoVo细胞。观察两组肿瘤的生长情况,21 d后处死动物取移植瘤标本,用免疫组化法检测移植瘤组织中的微淋巴管密度（MLD）和微血管密度（MVD）。结果： 两组的成瘤率均为100%;实验组与对照组接种14 d后的肿瘤体积分别为（382.0±152.8）mm3和（454.2±148.7）mm3,21 d后为（745.0±250.9）mm3和（1 574.4±506.2）mm3,差异均有统计学意义（均P<0.05）;实验组肿瘤组织中MLD与MVD计数均较对照组明显减少[（11.75±2.22）/0.72 mm2 vs. （28.50±2.65）/0.72mm2,（47.75±2.99）/0.72 mm2 vs. （53.73±3.50）/0.72 mm2]（均P<0.05）。结论：转染VEGF-C反义核酸可抑制结直肠癌LoVo细胞移植瘤在裸鼠的体内生长,并抑制移植瘤淋巴管与血管的生成。

     

不同微泡浓度对NT-3基因转染神经干细胞的影响

目的探讨低频超声下体外介导神经营养因子3（NT-3）基因转染神经干细胞的适宜超声微泡浓度。方法体外培养神经干细胞,在24孔板中加入200μl不同浓度（分别为10％、20％和30％）微泡和20μl pEGFP-NT-3基因重组质粒（1μg／u1）混合静置30min。将500μl神经干细胞悬液（3×10^5／ml）加入微泡和质粒混合液中,固定声强1．5W／cm^2,照射时间60s,占空比10％,用1MHz超声探头辐照。转染后流式细胞仪检测细胞绿色荧光蛋白表达情况,MTT法检测神经干细胞存活率。空白对照组为质粒与神经干细胞的混合物,不经超声辐照。结果微泡浓度为10％时,细胞存活率〉80．00％,但细胞转染率只有（6．26±0．58）％;微泡浓度为30％时,细胞存活率〈40．00％,同时转染率最低;而当微泡浓度为20％时,细胞存活率较高[（69．66±2．08）％],且细胞转染率最高[（14．39±1．79）％]。结论在一定超声辐照参数条件下,微泡浓度20％的细胞转染率较高,且对细胞损伤较小,可作为神经干细胞基因转染的适宜条件。     

经肝动脉或瘤体注射单纯疱疹病毒-胸苷激酶基因治疗兔肝癌

目的　观察瘤体内直接注射或经肝动脉注射载有单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSV TK)基因的EB病毒表达质粒 pDR2 /TK、丙氧鸟苷 (GCV )对原位兔肝癌的治疗效果。 方法　制作兔原位肝癌模型 (VX2 ) ,瘤体注射或经肝动脉注射质粒 pDR2 /TK ,腹腔注射GCV连续 10d。RT PCR检测肝癌HSV TK表达 ;螺旋CT监测肝癌大小 ,并观察兔存活时间。结果TK基因导入 10d后 ,直接注射组TK在肝癌组织强表达 ,癌旁组织弱表达 ,正常肝组织不表达 ;肝动脉注射组TK基因在肝癌表达稍强于癌旁及正常肝组织。直接注射组肿瘤大小 ( 3 .5 5± 0 .3 9)cm ,与经肝动脉注射+肝动脉结扎组肿瘤大小 ( 3 .70± 0 .3 7)cm无明显差别 (P >0 .0 5 ) ,但均明显小于对照组。瘤体直接注射TK基因 +GCV治疗组动物平均存活时间 ( 5 9.8± 3 .3 )d、肝动脉注射组 +肝动脉结扎组( 5 4.8± 4.5 )d明显长于各对照组 (P均 <0 .0 1)。结论　对实验性兔肝癌 ,瘤体内直接注射或经肝动脉注射导入治疗基因后 ,HSV TK/GCV系统具有较好的治疗效果。     

腺病毒介导HSV-TK/CD基因对胆管癌体内体外的杀伤作用

目的　研究HSV TK /CD融合基因对胆管癌的杀伤作用。方法　腺病毒介导HSV TK /CD融合基因体外转染胆管癌细胞QBC93 9,与单自杀基因对照 ,四甲基偶氮唑蓝 (MTT )比色法测定肿瘤细胞生长抑制率 ,旁观者效应 ;构建胆管癌裸鼠模型 ,瘤内注射重组腺病毒 ,观察肿瘤生长情况。结果　与单一自杀基因转染组对照 ,双基因组表现出更强的抗肿瘤作用。当给予相同浓度的前体药物时 ,融合基因组 ,CD组和TK组的肿瘤细胞存活率分别为 3 .1%、3 2 .1%、5 5 .2 %。体内实验显示 ,融合基因组的肿瘤生长受到明显抑制 ,抑制率达 70 .7%。单自杀基因TK、CD组则分别为 41.2 %和 5 5 .7% ,差异有统计学意义 (P <0 .0 5 )。组织学检查可见实验组肿瘤发生明显坏死 ,这种现象在融合基因治疗组尤为明显。结论　与单自杀基因相比 ,HSV TK/CD融合基因在体内和体外都具有更强的抗肿瘤活性。     

腺病毒驱动KDR启动子介导CD/TK融合基因系统对肝癌细胞的靶向杀伤作用

目的 研究腺病毒介导的KDR启动子驱动CD/TK双自杀基因系统（AdKDR- CDglyTK）对肝癌细胞选择性杀伤作用。方法 将质粒pAdEasy-KDR-CDglyTK在293细胞内包装、扩增后，体外感染表达KDR的BEL-7402细胞株和对照组不表达KDR的LS174T细胞株，并给予不同浓度的前药5-FC和/或GCV，观察该体系对不同细胞株的杀伤效应及其旁观者效应。结果 所得病毒滴度为2.5×10^12pfu/ml。两种细胞的感染率相似，其感染率随腺病毒滴度的递增而增加。RT-PCR方法 检测发现：感染AdKDR-CDglyTK的BEL-7402有目的 基因CDglyTK的表达，感染AdKDR- CDglyTK的LS174T细胞无目的 基因表达。表达KDR的BEL-7402细胞对前药具有较高的敏感性，不表达KDR的LS174T细胞对前药不敏感（F=750.03，P〈0.001）。融合基因的疗效优于任一单自杀基因（F=275.89，P〈0.05）。将感染腺病毒的细胞与未感染细胞以不同比例混合培养，观察到该体系明显的旁观者效应。结论 KDR基因启动子可调控双自杀基因系统选择性杀伤表达KDR的肝癌细胞。     

TRAIL真核表达质粒的构建及抑制肝癌生长的实验研究

目的构建TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)基因的真核表达质粒，观察其对BALB／c裸鼠肝癌细胞皮下移植瘤模型的抑瘤作用。方法提取U937细胞总RNA．用RT-PCR方法扩增出胞外区(114—281aa)，连入溶菌酶信号肽序列，构建分泌型TRAIL重组质粒；建立裸鼠7402肝癌细胞皮下移植瘤模型，纯化后的质粒DNA与脂质体聚乙烯胺混合后经肌肉注射进行基因转染，体内验证重组蛋白的抑瘤活性，采用TUNEL法进行肿瘤组织细胞凋亡检测。结果肿瘤体积测定结果显示．TRAIL对肝癌细胞生长有抑制作用；凋亡检测光镜下可见有棕褐色凋亡细胞，细胞凋亡指数增高。结论重组TRAIL质粒能引起肿瘤细胞的凋亡，抑制7402肝癌细胞的生长。