恶性疟原虫海南分离株pfmdr1基因与氯喹抗性的相关性分析

目的了解海南省恶性疟原虫pfmdr1基因同氯喹抗性的关系。方法采用套式PCR技术特异性扩增pfmdr1基因含有编码第86位、1042位和1246位氨基酸的基因片段,并对扩增产物进行RFLP分析。结果42个样本中,pfmdr1第86位氨基酸均未发生突变,即86位氨基酸是野生型的Asn,而不是突变型的Tyr。第1246位氨基酸发生突变的样本共有7个,全部为抗性虫株。第1042位点PCR扩增结果阳性的37个样本中突变的样本共有10个,其中9个为抗性虫株,一个为敏感虫株。结论我国海南省恶性疟原虫氯喹抗性产生与pfmdr186位氨基酸基因多态性无关,但第1042和1246位氨基酸的突变更易在抗性虫株中检出。     

恶性疟原虫海南分离株裂殖子表面蛋白1基因的分型研究

目的　了解海南省恶性疟原虫裂殖子表面蛋白 1(PfMSP1)等位基因型的分型特征。方法　采用套式PCR方法 ,用几对PfMSP1特异引物扩增疟原虫虫株PfMSP1基因第 2区与第 3区部分片段 ,并对等位基因型代表株的基因片段进行序列分析。结果　 39份血样中有 36份恶性疟患者共扩增出 44个PfMSP1基因片段 ,以MAD2 0型为主导型 (占 75 % ) ,K1型为次要型 ,未检出RO33型。两种不同等位基因型的混合感染率为 19 4%。序列分析表明 ,海南省恶性疟原虫虫株的MAD2 0型和K1型第 2区序列与MAD2 0和K1原型序列具有高度同源性。结论　海南省恶性疟原虫虫株存在MAD2 0型和K1型两种等位基因型 ,以MAD2 0型为优势虫株。     

海南恶性疟原虫分离株Pfcrt和Pfmdr1基因点突变的研究

目的 分析海南省恶性疟原虫分离株氯喹抗性转运蛋白编码基因(Pfcrt)及其P-糖蛋白同系物1（Pgh1)编码基因(Pfmdr1)的点突变特征， 为探讨抗性分子标记用于氯喹抗性监测提供参考。 方法 采用巢式PCR（nested-PCR）和限制性酶切片段长度多态性（RFLP）方法， 检测Pfcrt基因编码第76位氨基酸的密码子和Pfmdr1基因编码第86、1246位氨基酸的密码子发生点突变情况。按世界卫生组织（WHO）推荐的体外微量法测定恶性疟原虫对氯喹的敏感性。 结果 检测的36份血样中， 28份成功扩增Pfcrt基因， 导致第76位氨基酸由赖氨酸（K）变为苏氨酸（T）的突变型占64.3%， 混合型占14.3%， 野生型占21.4%； 29份成功扩增Pfmdr1基因， 导致第86位氨基酸由天冬酰胺（N）变为酪氨酸（Y）的突变型占3.4%， 混合型占6.9%, 野生型占89.7%。未发现编码第1246位氨基酸的密码子发生点突变。体外氯喹敏感试验结果显示, 72.2%(26/36)分离株存在抗性。 治疗前恶性疟原虫Pfcrt 76T突变发生率在体外微量测定法显示的氯喹抗性与敏感株中的差异有统计学意义（P＜0.05）， 而Pfmdr1点突变发生率在氯喹抗性与敏感株中的差异无统计学意义（P＞0.05）。 结论 恶性疟原虫Pfcrt 基因76T可以作为监测氯喹抗性的一个分子标记。     

中缅边境恶性疟原虫Pfcrt基因76位点突变研究

目的 检测分析中缅边境恶性疟原虫氯喹抗性基因(pfcrt)及其76位点氨基酸的突变情况。方法 采用巢式PCR方法扩增含76位点的pfcrt基因,并对扩增产物进行限制性内切酶及测序分析。结果 对恶性疟现症病人血样作pfcrt基因的巢式PCR扩增,目的基因片段(145 bp)检出率为74.05%(117/158),对PCR扩增阳性的产物进行RELP分析,检查突变型酶切片段,突变率为95.73%(112/117)。 结论 恶性疟原虫pfcrt基因可以作为一个分子标记用于监测中缅边境地区恶性疟原虫的氯喹抗性。     

中国脑型疟患者恶性疟原虫分离株裂殖子表面蛋白MSP1第16—17区基因的分子克隆及序列分析

目的 :为设计研制安全有效的人脑型疟疫苗提供进一步科学依据。方法 :应用多聚酶链反应 ( PCR)技术对中国 5例脑型疟患者恶性疟原虫云南省勐腊县勐罕 CMH/YN分离株和云南省盈江县农场 CYJ/YN分离株基因组 DNA裂殖子表面蛋白 1( MSP1)第 13— 17区基因进行扩增 ,将扩增产物分别经 Eco RI和 Kpn I双酶切后 ,回收的 MSP1第 16— 17区基因分子定向克隆M13mp18和 M13mp19载体 ,按 Sanger双脱氧链终止法进行 DNA序列测定 ,并与 MAD2 0、K1和Wellcome株原型基因进行同源性分析比较。结果 :发现脑型疟患者恶性疟原虫 CMH/YN和 CYJ/YN分离株 MSP1第 16— 17区基因之间的序列完全相同 ,全长为 918bp,编码 30 6个氨基酸 ,含 12个半胱氨酸组成的 2个表皮生长因子 ( EGF)单体结构域 ;除了在核苷酸第 4 869位缺失 1个碱基和散在分布 5个碱基点突变之外 ,与 MAD2 0、K1和 Wellcome株相应基因之间的核苷酸同源性分别为 98.6%、2 3.3%和 2 2 .8%。结论 :本研究在世界上首次报道脑型疟患者恶性疟原虫分离株MSP1第 16— 17区 DNA序列测定分析结果 ,确证该基因与 MAD2 0株高度同源性 ,并发现在1691— 170 1位氨基酸存在 TCTEEDSGSSR表位。     

海南省恶性疟原虫氯喹抗性相关基因pfcrt多态性分析

目的了解海南省恶性疟原虫产生氯喹抗性是否与pfcrt基因中的关键性点突变有关。方法对45份采自海南省恶性疟患者血样,采用套式PCR法分别扩增pfcrt基因中含有第76位和220位氨基酸的多态性片段,并对扩增产物进行限制性内切酶酶切分析,观察是否存在突变位点。结果45个样本中,pfcrt基因发生K76T点突变的样本有28个,其中20个是抗性株,8个是敏感株;全部样本的pfcrt基因第220位氨基酸均发生A220S点突变。结论我国海南株恶性疟原虫产生氯喹抗性与发生在pfcrt基因中的K76T点突变有一定的关联。     

海南省恶性疟原虫氯喹抗性相关基因pfcrt多态性分析

目的了解海南省恶性疟原虫产生氯喹抗性是否与pfcrt基因中的关键性点突变有关。方法对45份采自海南省恶性疟患者血样，采用套式PCR法分别扩增pfcrt基因中含有第76位和220位氨基酸的多态性片段，并对扩增产物进行限制性内切酶酶切分析，观察是否存在突变位点。结果45个样本中，pfcrt基因发生K76T点突变的样本有28个，其中20个是抗性株，8个是敏感株；全部样本的pfcrt基因第220位氨基酸均发生A220S点突变。结论我国海南株恶性疟原虫产生氯喹抗性与发生在pfcrt基因中的K76T点突变有一定的关联。     

我国云南、海南恶性疟原虫顶端膜抗原1基因结构域Ⅲ多态性分析

目的 分析中国云南、海南两省恶性疟原虫顶端膜抗原1(apical membrane antigen 1,AMA-1)(Ⅲ)多态性.方法 收集海南、云南感染恶性疟原虫患者的血液187份,提取血样基因组DNA.设计两对引物扩增AMA-1(Ⅲ)基因,将PCR产物进行测序,分析其单倍型多样性.结果 187份样品中的AMA-1(Ⅲ)基因有23种单倍型,云南株有21种,海南株7种,海南有2种单倍型未在云南株中发现,云南株单倍型多样性高于海南株.AMA-1(Ⅲ)基因有9个多态位点,云南株有3份样品451位氨基酸残基的同义突变,云南、海南这些位点每种突变出现的比例不同.结论 恶性疟原虫AMA-1(Ⅲ)基因多态性在云南、海南两省各有其特点,对此结构域的群体遗传多样性分析可为针对此区域疟疾疫苗的设计提供有价值的信息.     

恶性疟原虫海南分离株pfcrt基因同氯喹抗性的相关性分析

目的探讨恶性疟原虫海南株pfcrt基因多态性同氯喹抗性的关系。方法采集确诊恶性疟患者血样42份，应用套式PCR方法体外扩增pfcrt基因含有编码第76和356位氨基酸的基因片段，并对扩增产物进行限制性酶切分析。结果1）76位点：22个氯喹抗性虫株中有18个发生K76T突变型（81．82％），20个氯喹敏感虫株中野生型和突变型各占50％；2）356位点：所有42个样本的356位点均为野生型。结论我国海南省恶性疟原虫pfort基因的K76T突变与氯喹抗性存在一定关联，而356位点可能与氯喹抗性无关。     

3种恶性疟原虫红内期抗原基因的测序和序列分析

目的 测定我国恶性疟原虫海南株（FCC1／HN）谷氨酸富集蛋白（GARP），丝氨酸重复抗原（SERA）和裂殖子表面蛋白1（MSA1）基因序列，并进行序列分析。方法：采用PCR技术从恶性疟原虫FCC1／HN株基因组DNA中扩增GARP，SERA和MSA1基因片段，分别插入到测序载体上进行测序。应用DNAstar软件辅助分析3种抗原基因的结构及3种抗原在不同恶性疟原虫株间的分化情况。结果 恶性疟原虫FCC1／HN株GARP基因全长2263bp，编码682个氨基酸残茯，谷氨酸占23．61％，包含5个典型的氨基酸重复序列；SERA基因全长3448bp，编码995个氨基酸残基，丝氨酸含量为10．65％，包含1个连续32个丝氨酸（S）残基的序列；MSA1基因全长5085bp，编码1694个氨基酸残基，MSWA1的氨基酸序列符合MAD20特征。恶性疟原虫FCC1／HN株与3D7，FC27株GWARP的序列差异主要集中于C－末端；FCC1／HN株与FCR3，3D7，FCBR，Hondulas-1株SERA的序列差异主要集中于N－端，FCC1／HN株与MAD2，3D7，HN1，HN2，FC27，RO－71RO－33，CAMP和Palo-alto株MSA1的同源性高，K1和WELLCOME株MSA1的同源性高，各分离株MSA1的序列差异主要处于第2至16分区。结论 了解了恶性疟原虫FCC1／HN株GARP，SERA和MSA1的初级结构及其编码基因结构。恶性疟原虫FCC1／HN株与其它分离株GARP和SERA的氨基酸序列差异集中于特定区段，FCC1／HN株MSA1不同分区的氨基酸序列与其它分离株MSA1的对应序列存在不同程度的差异。     

黑色素瘤抗原基因MAGE-A1在直肠癌组织的表达

[目的]检测黑色素瘤抗原基因MAGE-A1在直肠癌组织中的表达,探索其与直肠癌临床病理的关系及其在直肠癌免疫治疗中的应用价值。[方法]采用RT-PCR法,对66例直肠癌患者的癌组织、癌旁"正常"黏膜组织和手术切缘组织(乙状结肠端)以及3例直肠息肉标本(无瘤)的MAGE-A1的表达情况进行检测,并对RT-PCR扩增产物中的目的基因片段进行DNA测序验证。[结果]66例直肠癌患者的直肠癌组织、癌旁"正常"黏膜组织、手术切缘组织MAGE-A1基因的表达阳性率分别为30.30%(20/66)、12.12%(8/66)、12.12%(8/66),3例直肠息肉标本未见MAGE-A1表达。肿瘤组织MAGE-A1基因表达阳性率均显著高于癌旁"正常"黏膜组织、手术切缘组织(P0.05);而与年龄、性别、组织学类型、Dukes分期及淋巴结转移无关(P0.05)。[结论]基于MAGE-A1基因在直肠癌中的高表达率,MAGE-A1表达蛋白可以作为一种有前途的靶点用于免疫治疗,同时有望成为一种筛查和随访指标。     

RASSF1B基因的克隆及序列分析

目的克隆RASSF1B基因并观察其序列。方法采用RT-PCR从胃腺癌细胞AGS、肝癌细胞HEPG2、高转移肺癌细胞95D、肺腺癌细胞LTEP—a-2、白血病细胞U937中克隆RASSF1B基因,用生物信息学方法对克隆基因的序列进行分析。结果RASSF1B在5种肿瘤细胞中均有表达。序列分析显示,该基因中有一个Ras结合区域和一个SARAH区域。结论在胃腺癌、肝癌、高转移肺癌、肺腺癌、白血病细胞中成功克隆出RASSF1B基因,该基因序列中含有一个Ras结合区域和一个SARAH区域。     

中国ADPKD患者PKD1基因突变位点检测

目的检测中国人PKD1基因突变位点,探讨其突变规律。方法采集38个家系的多囊肾患者病理标本（血样及组织）共43份,无病个体血样15份。提取基因组DNA,并采用聚合酶链反应法特异性扩增含PKD1基因的12、14、21外显子片段。扩增产物经分离纯化后用遗传分析仪进行基因测序,进入互联网基因库查找正常基因序列并与所测结果进行比较,分析测序结果。结果在外显子12检测到一个无义突变（C26017A）,在外显子21检测到一个错义突变（A33849G）。多囊肾突变率为4.7%（2/43）。未发现突变热点。结论检测到2个新的可能的致病突变位点C26017A、A33849G。中国ADPKD人群PKD1基因不存在突变热点。     

共表达HIV-1的gag-gp120与IL-2的pGPIL-2诱导小鼠产生细胞毒性T细胞的研究

目的 研究HIV-1CN融合基因与IL-2基因共表达基因质粒pGPIL-2诱导产生细胞毒性T细胞（CTL）。方法 脂质体介导共表达中国流行株HIV-1gag-gp120基因与IL-2基因的基因疫苗质粒pGPIL-2转染BHK-21细胞,以间接免疫荧光法鉴定其表达。取pGPIL-2免疫鼠脾细胞,检测pGPIL-2诱导的细胞毒性T细胞杀伤活性。结果 杀伤实验结果证明,经基因免疫获得的 CTL效应细胞,可杀伤 HIV-1CN 融合基因转染的靶细胞。结论 pGPIL-2可有效地诱导 CTL的产生,该研究结果为进一步设计中国流行株HIV-1基因疫苗提供了重要实验依据。     

MAGE-1基因在肝细胞性肝癌中的表达

目的探讨ＭＡＧＥ－１基因编码的肿瘤相关抗原作为肝细胞性肝癌（ＨＣＣ）主动免疫治疗攻击靶点的可能性。方法用ＲＴ－ＰＣＲ的方法检测了３９例ＨＣＣ及癌旁组织、３种人肝癌细胞株和５例非ＨＣＣ病例肝组织中ＭＡＧＥ－１基因的表达。结果ＨＣＣ癌组织中ＭＡＧＥ－１基因表达率明显高于癌分组织中的表达率,５８．９％（２／３９）对１０．３％（４／３９）,Ｐ＜００１。３种细胞株均为阳性表达。结论ＭＡＧＥ－１基因可作为主动免疫治疗的攻击靶点,以进一步研究设计新的ＨＣＣ免疫治疗策略。     

ADD-1基因和GNB3基因多态性与原发性高血压的相关性研究

目的调查ADD-1基因和GNB3基因多态性与深圳地区原发性高血压的关系。方法用病例对照研究。高血压组97例,非高血压组87例。用MS-PCR和PCR-RFLP方法分别检测ADD-1基因G460T基因型及GNB3基因T825C基因型。结果①高血压组和非高血压组ADD-1基因型分别为GG0.237/0.241、GT0.505/0.460、TT0.258/0.299,差异无统计学意义(P=0.787);G等位基因频率为0.490/0.471,差异无统计学意义(P=0.724);②高血压组和非高血压组GNB3基因型分别为TT0.258/0.161、TC0.484/0.529、CC0.258/0.310,差异无统计学意义(P=0.265);T等位基因频率为0.5/0.425,差异无统计学意义(P=0.151);③联合基因分析高血压组TT CC联合基因型者显著少于非高血压组(P=0.043)。结论在深圳地区人群中,未发现ADD-1基因多态及GNB3基因多态与高血压相关,但两基因可能存在协同作用。     

原发性肝细胞癌中cyclinD1基因表达的研究

目的　研究ｃｙｃｌｉｎＤ１ 基因在原发性肝细胞癌中的表达，并探讨与ｐ１６ 及ＣＤＫ４ 蛋白表达的关系。方法　用原位杂交检测ｃｙｃｌｉｎＤ１ 基因ｍＲＮＡ 表达，免疫组化检测ｃｙｃｌｉｎＤ１ 蛋白表达。结果　４ 例（１４－３ ％ ） ＨＣＣ 可检测到ｃｙｃｌｉｎＤ１ 基因过表达。均属ⅢⅣ级，４ 例ＨＣＣ 均有ＣＤＫ４ 蛋白表达，其中２ 例为ｐ１６ 蛋白阳性。结论　１）ｃｙｃｌｉｎＤ１ 表达增加只在小部分恶性程度高的ＨＣＣ 中起作用，可能与肿瘤侵袭有关。２） 在ＨＣＣ 中，ｃｙｃｌｉｎＤ１ 基因过表达和／ 或ｐ１６ 蛋白丢失均起重要作用     

HTRA1 gene expression in gastric epithelial cells

Objective:To explore HtrA1 gene expression aud its regulation in human gastric cancers.Methods:The HtrA1 mRNA levels were examined by QPCR analysis and coufirmed its expression with Northern blot analysis.The HtrA1 protein levels in all six gastric epithelial cell lines were investigated by Western blot analysis.Gene copy number was accessed and then sequenced the coding region from each mRNA in all six cell lines.The HtrA1 promoter region DNA methylation status was detected by using bisulfite sequeucing analysis.Effect of decitabine and TSA on HTRA1 expression in gastric cancer cell line was determined by RTPCR.Results:HIC analysis indicated that HtrA1 was highly expressed in normal epithelium,but dramatically down-regulated in gastric carcinoma tissues and variably expressed in tumor-adjacent tissues.HtrA1 gene expression was dramatically decreased in gastric carcinoma cells compared to nontumorigenic counterparts.The HtrA1 gene loss in any of the 4 breast cancer cell lines was not detected.Total 14 CpGs in this region were all methylated in gastric cancer cells,whereas two normal cells.GES-1 and HFI-145,were having several unmethylated cytosines in this region.HtrA1 showed as~Mr 44,000,Expression of HtrA1 protein was not observed in any of the four gastric caucer cell lines.BGC-823.MKN-45.SGC-7901and MKN-28.HtrA1 expression was observed in the HF1-145and GES-1 cell lines.Conclusions:The epigenetic silencing for HtrA1gene expression could provide a possible strategy for re-activating Htrt1 gene expression in gastric cancer cells.thus facilitating further investigation of HtrA1's role in chemotherapy.     

HIV-Ⅰ gag基因在大肠杆菌中的表达

目的表达HIV-1型鹳基因蛋白。方法将编码HIV-1型gag的部分序列，克隆到表达载体pET-28a后，进行IPTG诱导在E．coli BL21（DE3）表达，表达产物分别经SDS-PAGE和Western-Blot进行检测。结果表达产物为分子量约50kD的融合蛋白，并可与HIV-1型病人阳性血清发生特异性反应。结论鹳基因在大肠杆菌中得到表达，且表达产物具有良好的抗原性。     

几类主要病原需氧放线菌菌属的SecA1基因分析研究

目的 了解几类主要病原需氧放线菌不同菌属间SecA1基因碱基突变特点,为病原需氧放线菌的实验室诊断,分类及致病性提供一定的实验室理论数据。方法 以162株需氧放线菌为实验研究对象,通过分子生物学方法对需氧放线菌SecA1基因扩增测序,及收集NCBI数据库中已发表的需氧放线菌SecA1基因,运用多序列对比及DNAStar软件对需氧放线菌SecA1序列进行特异性基序分析及SecA1蛋白的二级结构和表位特性预测。结果 需氧放线菌不同菌属间SecA1序列在300~350 bp区域有着特异性差异,经预测该区域编码的SecA1蛋白二级结构属间大致相同,而蛋白质柔性区域、亲水性及表面可及性等性质在属间存在差异,其中以Mycobacteria菌属的差异较为明显。结论 需氧放线菌SecA1基因不同菌属间具有特异性的碱基突变,这种突变导致属间SecA1蛋白部分性质有差异,与各菌属致病性可能存在着一定的相关性。