人白细胞介素24真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的 构建人白细胞介素24(human interleukin-24,hIL-24)真核表达载体,并在HepG2细胞中稳定表达,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),从植物血凝素活化的人外周血单个核细胞中克隆得到hIL-24基因目的 片段.应用DNA重组技术将IL-24PCR产物双酶切后定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),转化大肠杆菌DHSα获得重组载体,进行PCR、酶切及测序鉴定.应用脂质体将鉴定正确的重组质粒转染至HepG2细胞,用G418筛选稳定转染细胞株.采用RT-PCR检测稳定转染细胞HepG2中IL-24 mRNA的表达.结果 通过RT-PCR获得与预期大小一致约600 bp的IL-24基因片段;重组载体pcDNA3.1(+)-IL-24经PCR、双酶切及测序证实,IL-24 eDNA片段已正确插入真核表达载体中;在稳定转染的HepG2细胞株中可见到IL-24 mRNA表达.结论 成功构建了hIL-24真核表达载体pcDNA3.1(+)-IL-24,并获得了稳定转染该重组质粒的HepG2细胞株.     

真核表达质粒pEGFP-N1-Bex2的构建及其在U251细胞中的表达

目的 构建pEGFP-N1-Bex2真核表达质粒,并探索其在U251神经胶质瘤细胞中的表达.方法 以正常人脑组织总RNA为模板,采用RT-PCR法获得Bex2的cDNA,并与pEGFP-N1载体连接,构建pEGFP-N1-Bex2真核表达质粒.对pEGFP-N1-Bex2重组质粒的菌液行PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定.在U251细胞中用脂质体转染法转染pEGFP-N1-Bex2真核表达载体过表达Bex2,分别于转染后12、24、48、72 h收集细胞,用Western blot检测Bex2基因的表达情况.结果 真核表达质粒pEGFP-N1-Bex2经PCR及双酶切鉴定,均可见387 bp的目的基因条带,并单倍正向克隆至质粒中.转染质粒pEGFP-N1-Bex2后荧光显微镜下观察U251细胞内有绿色荧光蛋白表达,Western blot检测见47 KD和26 KD分别有清晰的外源性Bex2-GFP融合蛋白和GFP蛋白的表达.pEGFP-N1-Bex2在转染U251细胞后12h即有表达,48 h达到高峰.结论 成功构建pEGFP-N1-Bex2真核表达质粒,瞬时转染后在U251细胞中顺利表达.     

重组组蛋白去乙酰化酶2-pEGFP-C2质粒的构建及表达

目的将组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)基因克隆入pEGFP-C2载体,探讨构建的质粒转染进非洲绿猴肾成纤维细胞COS-7株相关蛋白和mRNA的表达及蛋白分布部位的情况。方法从人肝癌细胞(HepG2)中获得组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)的cDNA,采用Xho I和BamH I双酶切,用T4连接酶将该cDNA连接pEGFP-C2质粒,将构建成功的pEGFP-C2-HDAC2质粒经PCR、限制性内切酶酶切和测序鉴定后转染非洲绿猴肾成纤维细胞(COS-7),荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,RT-PCR和Western blot鉴定HDAC2的表达。结果双酶切鉴定可见HDAC2质粒片段,转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达,PCR结果可检测到HDAC2 mRNA表达,同时Western blot可检测HDAC2蛋白和GFP蛋白的表达。结论成功构建了重组pEGFP-C2-HDAC2表达质粒,HDAC2蛋白可与绿色荧光蛋白在COS-7细胞中融合表达。     

STAT3基因shRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建携带信号传导和转录激活子3(STAT3)基因短发夹状干扰RNA(shRNA)的真核表达载体.方法 从GenBank STAT3 mRNA上寻找到3条符合特征的靶序列,合成靶序列的DNA寡核苷酸链,合成双链DNA,并和BamH Ⅰ和HindⅢ酶切后的pRNAT-U6.1/Neo载体质粒连接产生重组质粒,PCR筛选阳性克隆,并行测序鉴定.重组质粒转染大肠癌LoVo细胞,RT-PCR检测STAT3的表达.结果 PCR和测序证实重组质粒构建正确.3种重组质粒对大肠癌LoVo细胞STAT3的表达有较强的抑制作用.结论 成功构建了携带有STAT3基因的短发夹状干扰RNA的重组质粒.     

小鼠IL-18真核表达质粒的构建及其生物学活性的鉴定

目的构建小鼠白细胞介素18(interleukin18,IL-18)的真核表达质粒,并检测其表达的IL-18的生物学活性。方法采用RT-PCR获得小鼠IL-18基因,通过EcoRⅠ和HindⅢ双酶切及连接反应,构建pEGFP-mIL-18真核表达载体,重组载体经过限制性内切酶、PCR及DNA序列测定等证实连接片段的正确性后,转染HEK293细胞系,荧光显微镜观察GFP-mIL-18融合蛋白的表达,收集转染后72h的上清液,MTT法检测上清液中IL-18表达产物的生物学活性。结果酶切分析、PCR鉴定、DNA测序表明成功地构建了pEGFP-mIL-18真核表达载体,MTT法证明表达产物有刺激小鼠脾细胞增殖的功能。结论所获pEGFP-mIL-18真核表达载体能在体外表达具有生物学活性的IL-18,为进一步研究IL-18的功能和运用奠定了基础。     

大鼠干扰素诱导蛋白-10真核表达质粒的构建及其在NIH 3T3细胞中的表达

目的构建大鼠干扰素诱导蛋白-10（IP-10）基因的真核表达质粒,并研究其在NIH 3T3细胞中的表达情况。方法通过PCR获得实验所需的IP-10基因片段,通过酶切IP-10基因片段、真核表达质粒载体pEGFP—cl和连接反应,构建IP-10的真核表达质粒pEGFP—cl—IP-10,重组质粒经限制性内切酶、PCR及DNA序列测定证实构建成功后,用PolyFect脂质体转染NIH 3T3细胞,然后用免疫荧光技术检测pEGFP—cl—IP-10在NIH 3T3细胞中的表达。结果酶切分析、PCR及DNA序列测定证实,IP-10基因片段被成功克隆人真核表达质粒载体pEGFP—cl,免疫荧光技术检测证实,该基因能在NIH 3T3细胞中表达。结论证实IP-10基因可在NIH 3T3细胞中表达,为将其作为DNA疫苗治疗自身免疫性疾病的研究奠定了基础。     

FAM3B基因cDNA克隆及其在胃癌细胞系BGC-823的表达

目的克隆FAM3B cDNA,构建FAM3B重组表达载体并在胃癌细胞系BGC-823中表达,观察其对细胞系的影响,探索新的肿瘤治疗途径。方法构建pEGFP-N2-FAM3B真核表达质粒,将pEGFP-N2-FAM3B转染人胃癌细胞系BGC-823,研究其对胃癌细胞产生的作用。结果重组pEGFP-N2-FAM3B真核表达质粒构建成功,经pEGFP-N2-FAM3B转染后,荧光显微镜下可见转染的BGC-823细胞有绿色荧光蛋白的表达,转染后的BGC-823细胞生长减慢。结论构建完成真核表达载体pEGFP-N2-FAM3B,重组pEGFP-N2-FAM3B质粒在胃癌细胞系BGC-823细胞内成功表达。     

pEGFP-N1-PEDF重组质粒的构建和鉴定

目的：构建 pEGFP-N1-PEDF真核表达质粒,并进行鉴定。方法利用RT-PCR方法从组织中提取PEDF的基因片段,与pMD18-T载体连接,构建pMD18-T-PEDF重组质粒,酶切后与pEGFP-N1真核表达载体连接,构建pEGFP-N1-PEDF真核表达质粒,进行测序、酶切鉴定,表明质粒构建成功。结果本实验成功构建了pEGFP-N1-PEDF真核表达质粒。结论为进一步研究利用PEDF基因治疗皮肤肿瘤提供实验基础。     

ASAP3真核表达载体的构建和鉴定

目的:构建ASAP3的真核表达载体并鉴定。方法:通过DNA重组技术和PCR方法从人肝癌细胞株HepG2克隆ASAP3基因,插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,通过PCR、酶切及测序鉴定重组载体的正确性。结果:DNA测序和酶切鉴定证明ASAP3基因正确克隆至pcDNA3.1(+)的多克隆位点。结论:成功构建ASAP3的真核表达载体p ASAP3。     

HPV_(16)E7-HSP_(70)融合表达质粒的构建及鉴定

采用分子克隆技术 ,首先将 HSP70 基因片段克隆到真核表达载体 pc DNA3 .1ˉ上 ,获得 pc DNA-HSP重组质粒 ,然后采用 PCR扩增技术 ,定点突变编码 HPV1 6 E7蛋白 C末端锌指结构的基因序列 ,将该突变的 E7基因插入 pc DNA-HSP重组质粒 ,通过粘端连接的方式构建 pcd-HPV1 6 E7-HSP70 融合表达质粒 ,最后通过限制性内切酶酶切、PCR和 DNA测序等技术鉴定。结果显示 ,重组融合表达质粒经酶切、PCR和 DNA测序证明其突变位点、碱基及阅读框架均准确无误。     

miRNA-1真核表达载体的构建及转染骨髓间充质干细胞绿色荧光蛋白的表达

目的 构建大鼠miRNA-1真核表达载体,为研究miRNA-1功能提供实验基础.方法 应用技术体外合成miRNA-1前体对应的基因组片段,定向克隆到pSD11-U6/Neo/绿色荧光蛋白载体上.阳性克隆进行及DNA测序鉴定,将构建成功的重组质粒pSD11-U6/Neo/绿色荧光蛋白/miRNA-1借助脂质体转染大鼠骨髓间充质干细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达.结果 PCR鉴定及DNA测序表明真核表达载体pSD11-U6/Neo/绿色荧光蛋白/miRNA-1构建成功.转染大鼠骨髓间充质干细胞后,荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达.结论 大鼠miRNA-1真核表达载体构建成功.     

人β_3-AR和PPAR-γ2基因真核表达载体及β_3-AR稳定表达细胞株的构建

目的构建高效表达人β3-肾上腺素受体(hβ3-AR)的真核细胞表达载体,为进一步研究hβ3-AR的功能以及与过氧化物酶体增殖体激活受体-γ2(PPAR-γ2)调控基因之间的相互影响奠定基础。方法从人肾旁脂肪组织提取总RNA,应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法扩增hPPAR-γ2、hβ3-AR cDNA全长序列。将EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后的hβ3-AR cDNA与同样进行EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切的pcDNA3·1(+)载体连接形成重组载体pcDNA3·1(+)/hβ3-AR。将XbaⅠ和AflⅡ双酶切后的hPPAR-γ2cDNA与同样进行XbaⅠ和AflⅡ双酶切的pcDNA3·1(+)载体连接形成重组载体pcDNA3·1(+)/hPPAR-γ2。通过限制性内切酶酶切鉴定后对DNA序列进行测序,鉴定重组质粒中hβ3-AR和hPPAR-γ2基因的完整性和可靠性。运用定点诱变方法,对野生型hPPAR-γ2和hβ3-AR质粒进行定点诱变,构建Pro12Ala突变的hPPAR-γ2和Trp64Arg突变的hβ3-AR的pcDNA3·1(+)载体,电穿孔法将人hβ3-AR重组表达载体pcDNA3·1(+)/hβ3-AR(突变型和野生型)转染到SH-SY5Y细胞中,用G418筛选获取稳定转染细胞株,并用RT-PCR、Western blot方法进行鉴定。结果酶切和测序分析显示重组质粒构建正确,并在转染的SH-SY5Y细胞中获得hβ3-AR的高效表达。结论成功克隆了人PPAR-γ2、β3-AR基因全长cDNA,并成功构建了人野生型和突变型的hPPAR-γ2和hβ3-AR的真核表达重组体〔pcDNA3·1(+)/hPPAR-γ2和pcDNA3·1(+)/hβ3-AR〕。成功获得了稳定表达hβ3-AR基因的SH-SY5Y细胞株。     

弓形体RH株抗原基因SAG1的扩增克隆及鉴定

目的 :体外扩增弓形体主要表面抗原 SAG1基因 ,构建 pc DNA3- SAG1真核表达质粒 ,为研制弓形体疫苗奠定基础。方法 :采用 PCR技术 ,自行设计一对寡核酸引物 (P1,P2 ) ,从弓形体 RH株基因组 DNA中特异扩增出编码SAG1抗原的基因片段。扩增的目的片段经纯化后用 Eco R1和 Hind 双酶切后 ,克隆到真核表达质粒 pc DNA3中 ,转化入大肠杆菌 TG1,用氨苄青霉素和 PCR初筛 ,将 PCR扩增阳性的重组子分别用 Sac1单酶切、Eco R1和 Hind 双酶切鉴定。结果成功地构建真核型表达质粒 pc DNA 3- SAG1,从而为进一步 SAG1重组抗原的体外表达创造有利条件。结果 :从 RH株基因组 DNA中特异扩增出编码 SAG1的全基因序列 ,扩增目的基因片段大小与预期长度(10 2 5 bp) ,相符 ;将分离、纯化的目的基因片段 SAG1插入 pc DNA3质粒 Hind 和 Eco R1位点 ,构建重组质粒pc DNA3- SAG1。结论 :成功构建重组质粒 pc DNA3- SAG1     

STK15基因RNA干扰真核表达载体的构建及对人结肠癌细胞侵袭的影响

目的 构建STK15基因特异的RNA干扰（RNAi）真核表达质粒,将其转染人结肠癌细胞SW480后,观察对STK15基因表达的抑制作用及对肿瘤细胞侵袭能力的影响.方法 设计并合成能表达小发夹结构RNA （shRNA）的DNA序列,退火后与载体pGPU6/GFP/Neo连接,构建重组表达载体pGPU6/GFP/NeoSTK15 shRNA,转化DH5α菌株后挑选阳性克隆,提取质粒进行序列测定.脂质体介导重组质粒转染人结肠癌SW480细胞,于转染后24h和48 h通过反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白印迹法分别在mRNA和蛋白水平检测STK15基因的表达,并通过细胞体外侵袭实验检测肿瘤细胞的侵袭能力.结果 测序证实插入pGPU6/GFP/Neo载体的DNA序列、方向和位点均正确.与阴性质粒转染组比较,pGPU6/GFP/Neo-STK15 shRNA质粒转染细胞24h和48 h后,STK15基因的mRNA和蛋白表达水平均明显降低,且呈现时间依赖性,STK15 mRNA水平分别下调80％和98％,蛋白水平分别下调40％和80％.与阴性质粒转染组比较,pGPU6/GFP/Neo-STK15shRNA质粒转染细胞的侵袭能力分别下降约67％和89％.结论 成功构建了针对STK15基因的特异性shRNA真核表达载体,转染细胞后可抑制STK15基因的表达和细胞的侵袭能力,为进一步研究STK15基因功能以及探讨结肠癌治疗的新途径奠定了基础.     

Pro370Leu突变型MYOC基因真核表达质粒的构建及其表达特点

目的：构建Pro370Leu突变型MYOC基因真核表达质粒，并在Hela细胞中表达以研究蛋白的定位和分泌特点。方法：以pGEM—T—MYOC质粒中MYOC为模板，用PCR介导的定点突变技术，得到Pro370Leu突变型MYOC基因（mMYOC），并定向亚克隆到真核表达质粒pDsRed2-N1上，得到pDsRed2-N1—mMYOC重组表达质粒，再用限制性内切酶消化和DNA测序鉴定，最后用脂质体包埋转染法转染Hela细胞，进行荧光显微镜观察，并用Western Blot分析蛋白分泌情况。结果：经酶切和DNA序列测定，证实重组质粒构建成功，mMYOC基因能在Hela细胞中表达，并且蛋白只定位在细胞质中，经Western Blot分析，mMYOC蛋白不能分泌到培养液中。结论：成功构建Pro370Leu突变型MYOC基因真核表达质粒pDsRed2-N1—mMYOC，并能有效表达，其表达的蛋白定位在细胞质，并且不能分泌。     

猪干扰素-γ基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的克隆猪的干扰素-γ基因(PoIFN-γ),构建重组真核表达质粒,转染细胞。方法从猪的肝脏组织中提取出基因组DNA,以其为模板通过长链PCR扩增出干扰素-γ全基因。将猪干扰素γ基因克隆到真核表达载体PCI-neo载体中,组装成真核表达载体PCI-neo-PoIFNγ。利用脂质体转染法将重组载体PCI-neo-PoIFN-γ转染入中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中,在G418的存在下进行筛选培养。结果构建出重组真核表达质粒,获得转染细胞系。结论成功克隆了猪的干扰素-γ基因,获得了转染细胞系。     

His肽修饰人干扰素γ制备

目的：为便于人干扰素γ功能研究,制备6His修饰的人干扰素γ。方法：采用一步反向PCR扩增编码人干扰素γ的cDNA序列,克隆到质粒pUC19,测序鉴定正确后构建于pQE80L表达质粒,BamHI和HindⅢ双酶切,行1．2％琼脂糖凝胶电泳鉴定;SDS—PAGE和Western blot检测表达的目的蛋白,Ni^2＋-NTA柱纯化蛋白,酶联免疫吸附测定纯化的目的蛋白。结果：一步反向PCR扩增得到编码人干扰素1eDNA片段,测序结果正确,SDS—PAGE和Western blot分析显示His修饰的人干扰素γ在大肠杆菌中获得了高效表达,SDS—PAGE证实目的蛋白具有较高纯度,酶联免疫吸附测定出目的蛋白。结论：本法成功制备了6His肽修饰的人干扰素γ。     

基因1b型不同准种株HCV核心蛋白真核表达质粒的构建及表达

目的 构建基因1b型丙型肝炎病毒(HCV)不同准种株截短片段核心蛋白(CP)绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白表达质粒.方法 用聚合酶链反应(PCR)扩增获得等长度片段的CP基因:氨基酸(aa)长度为癌中心株(T)∶T∶1-172 aa、癌旁株(NT)∶1-172 aa及C191(HCV-J6)∶1-172 aa,扩增产物用Nhe I及EcoR I双酶切后将其插入到真核表达质粒pEGFP-N1中,转染不同细胞系,用荧光显微镜及流式细胞仪观察GFP的表达.结果 PCR扩增、序列分析验证,T、NT及C191截短片段CP基因均成功克隆到pEGFP-N1中,在转染HepG2、chang-liver 48h后,用荧光显微镜及流式细胞仪均观察到GFP的表达.结论 构建基因1b型HCV不同准种株截短片段CP的真核表达质粒获得成功,可用于不同准种株CP的功能研究.