烟草抗PVY~N突变株eIF4E基因的克隆及表达差异分析

为了明确抗马铃薯Y病毒病的相关基因、进一步揭示其抗病机制,以烟草高抗马铃薯Y病毒脉坏死株系(Potato virus Y vein necrosis strain,PVYN)突变株SN01和SN02为试验材料,研究了突变株的抗病相关基因翻译起始因子4E(e IF4E)在寄主中的抗病作用。结果表明:从抗病突变株SN01和SN02中克隆到目的全长基因,分别命名为e IF4E01与e IF4E02,其开放阅读框ORF长度均为669 bp,编码222个氨基酸;利用MAGA4.1和CLUSTAL软件进行序列同源性比对分析表明,e IF4E01和e IF4E02与已报道的烟草e IF4E(Gen Bank:AY702653.1)基因序列相似度均达到99%,其开放阅读框序列完全一致。并与甜椒、番茄、拟南芥等物种的e IF4E家族基因也具有高度同源性;Real-time PCR结果表明,在PVYN侵染初期(接种后0~9 d),突变株SN01和SN02中的e IF4E基因表达量明显低于其感病亲本NC89和K326。说明这两个抗病突变株中的e IF4E基因的抑制表达与烟草对PVYN的抗性密切相关。     

利用母本来源的单倍体技术获得双抗TMV和PVY烟草株系

利用双单倍体技术可加快杂交后代目标性状的纯合。为了选育双抗烟草花叶病毒（TMV）和马铃薯Y病毒（PVY）的烟草材料,本文采用Coker176与NC55的F1与非洲烟杂交获得单倍体苗,经过苗期抗性鉴定、分子标记辅助选择和叶脉培养加倍,获得母本来源的双抗TMV和PVY的双单倍体。通过人工接种抗性鉴定、标记检测和田间株系比较,获得抗性、植物学性状稳定的双单倍体第三代种子。与常规杂交系统选育相比较,双单倍体方法的获得后代变异更大、性状更容易稳定。      

一株突破va基因型烟草抗性的PVY病毒分离物的鉴定

  背景和目的  近来,能突破va基因型抗性的马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)毒株在烟草上不断出现。2016年,我们分离到一株抗性突破的毒株PVY-CJ,本文对该病毒分离物进行了验证和鉴定。  方法  采用病毒重新接种、多重RT-PCR、RT-PCR分段扩增病毒全长基因组、PVY病毒分子进化分析及病毒蛋白VPg蛋白序列比对等方法对PVY-CJ毒株进行了验证和鉴定。  结果  三种重新接种了PVY-CJ的va基因型烟草品种均发病。多重RT-PCR结果将PVY-CJ鉴定为PVYNTN株系。序列分析表明,PVY-CJ全长基因组包含一个全长9180 nt的开放读框,其编码一个3060 AA的多聚蛋白。分子进化分析进一步验证了其归类于PVYNTN株系。相比其他PVYNTN株系毒株,PVY-CJ的VPg蛋白105位氨基酸出现了一个由赖氨酸到谷氨酸的替换,而这一氨基酸替换导致了其对va基因来源抗性的突破。  结论  我们首次报道并鉴定了国内一株能突破va基因型烟草抗性的PVY毒株—PVY-CJ。这为进一步研制PVY抗病烟草品种提供了材料。      

烟草野生种eIF4E1-S同源基因的多样性与马铃薯Y病毒抗性分析

  背景和目的  在栽培烟草中,真核生物翻译起始因子（Eukaryotic translation initiation factor 4E1,eIF4E1-S）的缺失或突变能够抗马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）侵染。为了解烟草野生种eIF4E1-S同源基因的多样性和PVY抗性状况,预测野生种含有抗PVY新基因（即不同于eIF4E1-S基因缺失或突变的基因）的可能性。  方法  本文设计了普通烟草eIF4E1-S和其同源基因eIF4E1H-T（非感病基因）的特异引物,扩增测定了34个烟草野生种的同源基因cDNA序列,分析了野生种PVY抗性与感马铃薯Y病毒属病毒eIF4E蛋白关键结构域序列（loop1和loop2）的相关性。  结果  在eIF4E1-S同源基因的系统进化树上,绒毛烟草组（Tomentosae）的4个抗PVY野生种Nicotiana otophora、N.setchelli、 N.tomentosa、 N.tomentosiformis聚成一组,loop1和loop2的氨基酸序列与eIF4E1H-T一致,这4个野生种对PVY的抗性可能与eIF4E1进化为eIF4E1H-T有关、包含抗PVY新基因的可能性较低。圆锥烟草组（Paniculatae）的4个抗PVY野生种N.benavidesii、N.raimondii、 N.cordifolia、N.knightiana聚成一组,同源基因氨基酸序列与eIF4E1-S一致率高于eIF4E1H-T,但loop1和loop2氨基酸序列相互之间差异较大,这4个野生种包含抗PVY新基因的可能性中等。与eIF4E1-S聚成一个小分支的N.glauca、N.noctiflore、N.africana高抗5个PVY分离物（包含可克服va抗性的PVY分离物）,其中N.glauca、N.noctiflore的同源基因loop1氨基酸序列与eIF4E1-S相同,loop2与eIF4E1-S之间只有1-2个氨基酸差异,N.africana同源基因loop1与eIF4E1-S和eIF4E1H-T差异较大、loop2与eIF4E1-S之间只有1个氨基酸差异（V97M）。推测这3个野生种的PVY抗性与eIF4E1的突变无关且含有新的抗PVY基因可能性高,可作为重点抗源研究利用。  结论  根据PVY侵染栽培烟草所利用的寄主因子eIF4E1-S基因的同源基因的多样性,抗PVY烟草野生种存在抗PVY新基因的可能性划分为高、中和低三档。N.glauca、N.noctiflore、N.africana含有新的抗PVY基因可能性高于其他供试野生种。      

烟草PVY隐性抗病基因的分子标记及其适用性

马铃薯Y 病毒(Potato virus Y,PVY)是危害烟草的重要病害, 种植抗病品种是经济有效的防治措施。分子标记辅助选择可提高抗病育种效率。来源于X-射线诱变的Virgin A Mutante(VAM) 的隐性抗PVY 基因位点(va)被广泛应用于烟草抗病育种。为了提高va 位点的育种利用效率, 根据烟草隐性抗PVY 基因(感病基因)eIF4E-1 基因序列, 设计特异扩增的引物CF2GR11,开发eIF4E-1 基因的分子标记, 并检测了该标记与抗性的遗传距离和在常见烟草资源中的适用性。CF2GR11 在云烟87、红花大金元和K326 等感PVY 品种可扩增出500 bp 产物, 在NC102、NC55 和K326PVY 等抗病品种无扩增条带。以抗、感PVY 亲本构建的101 个F₂ 单株为定位群体, 遗传连锁分析表明, CF2GR11 标记与烟草PVY 感病基因的遗传距离为0.99 cM。对46 份PVY 抗性明确的栽培烟草资源的检测表明, 供试资源的标记检测结果与抗性的吻合度为100%, 表明CF2GR11 标记适用性高。该目的基因标记可用于抗PVY 育种的辅助选择和抗PVY 资源的鉴定。      

抗PVY云烟87定向改良新品种“云烟301”的选育及特征特性

抗PVY云烟87新品种“云烟301”是云南省烟草农业科学研究院、国家烟草基因工程中心在克隆烟草隐性抗PVY基因eif4e1（又称为感PVY基因eIF4E1）、开发功能性分子标记、分析国内外抗PVY品种和种质资源基因型过程中,以云烟87为母本、Y85×RY2/F₂为父本（携带eif4e1）杂交,以定向改良云烟87的PVY抗性为主要目标,通过连续回交、分子标记辅助选择、全基因组基因芯片背景检测等技术培育而成（非转基因）。云烟301的遗传背景恢复为云烟87的比率为99.43%,云烟301的PVY抗性显著提高,保留了云烟87的栽培烘烤特性、原烟风格特征和感官质量。在打顶后PVY发病率达到1%的云烟87种植区,种植云烟301可挽回病害损失,具有良好的推广价值。      

大豆种质资源对东北SMV1号和3号株系的抗性鉴定

采用556份大豆种质资源为供试材料,在2006和2007年连续两年分别接种SMV1号和3号株系,对其成株抗性和种粒斑驳抗性均进行了鉴定。结果表明,接种1号株系的成株抗病资源446份,占80．2％;抗种粒斑驳资源107份,占19．2％;对成株和种粒斑驳均表现抗性的资源103份,占18．5％。接种3号株系的成株抗病资源151份,占27．2％;抗种粒斑驳资源87份,占15．7％;对成株和种粒斑驳均表现为抗性的资源76份,占13．7％。对1号和3号株系,在成株和种粒抗性上均表现抗病的资源69份,占12．4％。以上资源特别是兼抗资源在大豆生产和抗病育种中应予以重视。研究还显示,来自辽宁和吉林的供试资源对1号和3号株系的成株和种粒抗性均较好;来自中国农科院作物所和黑龙江的供试资源对1号株系的成株抗性较好,但对1号和3号株系的种粒抗性相对较差。     

烟草种质资源抗马铃薯Y病毒病基因型鉴定

  背景和目的  从作物种质资源中进行等位基因鉴定,特别是优异等位基因的发掘和应用,是使种质资源加速转变为基因资源的关键所在。  方法  采用苗期汁液摩擦接种的方法,对烟草种质资源的马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）抗病性进行鉴定;通过烟草隐性抗PVY基因eIF4E1（又称为感PVY基因eIF4E1）等位性测验、等位基因分子标记检测和RT-PCR扩增测序,对PVY抗病资源进行基因型分析。  结果  （1）从收集到的900多份来自国内外的烟草种质资源中筛选出19份高抗PVY资源。（2）根据等位性测验结果推断19份抗源所具有的PVY抗性均由eIF4E1基因所控制。（3）等位基因分子标记检测和RT-PCR扩增测序结果将19份抗源的eIF4E1基因区分为4种突变类型。  结论  本研究结果丰富了我国对抗PVY烟草种质资源的筛选和利用的内容,为后续烟草PVY抗性优异等位基因的发掘和育种利用提供了基础材料和信息支撑。      

青岛烟区马铃薯Y病毒株系鉴定及系统传导特性

为明确引起青岛试验田烟草脉坏死及花叶的PVY的发生规律、分子进化和系统传导特性,通过病毒病害表型,发病率和病情指数明确青岛试验田病毒病害流行规律;利用MEGA7构建系统发育树鉴定PVY青岛分离物的株系;通过q RT-PCR,western blotting和PVY-GFP荧光明确PVY侵染烟株的传导路径;通过不同叶位、不同症状病叶取样,利用q RT-PCR检测PVYCPm RNA相对含量,明确显症和隐症叶片的病毒含量差异,以及TMV、CMV、PVY单独、两者混合、三者混合侵染时的干扰或协生作用。结果显示：烟株成熟期,PVY与TMV和CMV混合发生严重,PVY分离物为N:O株系,未突破va基因抗性。在侵染早期,病毒从接种叶沿叶脉进入茎,开始双向运输时,先向根部移动,进而到达苗端;再扩散至上部叶,较慢移动至下部叶;最后伴随烟株生长持续向两端新生部位运输。侵染中期病株上部叶隐症现象显著,病叶症状与病毒浓度呈正相关。烟田中后期,PVY与TMV和CMV混合侵染,病毒间的干扰和协生作用导致症状复杂多变。研究结果有助于提高品种抗性鉴定试验的准确性和药效试验的靶标性。     

烟草赤星病菌嘧菌酯抗性突变体的诱导及其生物学特性

为探究烟草赤星病菌对嘧菌酯的抗药性风险水平,通过对烟草赤星病菌在室内含药平板上的菌丝药剂驯服和分生孢子紫外诱变,进行突变体的生物学特性的研究,并对突变体靶标基因细胞色素b进行了测序分析。获得了4株嘧菌酯抗药性突变体。其中,菌丝药剂驯服未获得突变体;孢子紫外诱变获得4株突变体,突变率约为0.004%,突变体抗性倍数分别为42.50、282.50、515和107.50。4株突变体均降低了对嘧菌酯的敏感性。适合度研究表明,抗药性突变体具有同敏感菌株同样的分生孢子萌发能力和致病能力;菌丝生长速率较敏感菌株有所降低,3株突变体的分生孢子产量较敏感菌株增强,1株突变体较敏感菌株减弱。抗药性靶基因细胞色素b基因部分序列分析表明,突变体在129位和143位的碱基与敏感菌株完全相同,未发生任何突变。初步认为烟草赤星病菌对嘧菌酯的抗性风险水平较低。     

甘蔗CP84-1198×ROC22杂交群体抗褐锈病Bru1基因分子检测

为了更好地改良ROC22的农艺性状,本研究以ROC22为父本,CP84-1198为母本,构建了CP84-1198×ROC22杂交群体(1100个株系)。从杂交后代中挑取优良个体材料,以褐锈病抗性为指标,随机挑取280个株系苗期的叶片,运用CTAB方法提取甘蔗基因组DNA,以R12H16为标记用普通PCR技术对该群体各个株系进行锈病抗性基因Bru1检测,结果发现该杂交群体中156个(55.71%)株系检测到了该基因,含有与不含有抗锈病基因Bru1符合理论比1∶1,研究结果表明ROC22含有单个抗锈病Bru1等位基因,CP84-1198不含有抗锈病Bru1等位基因。以期能为深入开展甘蔗群体抗褐锈病育种、选育和推广优良抗性品种(系)提供材料基础。     

利用细胞工程筛选烟草抗赤星病突变体的研究——一种双层培养基筛选系统的建立

为有效筛选烟草抗赤星病细胞突变体,本研究建立了一种双层培养基筛选系统。即在下层培养基中接种烟草赤星病(Alternaria alternata),在上层培养基中接种烤烟品种 NC89和净叶黄的花药(NC89高感赤星病,净叶黄高抗赤星病)。在26±1℃培养40天后发现,NC89的花药出苗率和花药平均出苗数与对照(不接种赤星病的培养基)相比,分别由30%和53颗降到2%和12颗,而净叶黄的花药出苗率和平均出苗数基本没有变化。对筛选出来的 NC89花培突变体进行了田间赤星病抗性鉴定,其中80%对赤星病抗性较 NC89有所提高,甚至部分接近高抗。这说明该双层培养基系统可以有效地对抗烟草赤星病的细胞突变体进行筛选。本系统尤其适应于(1)需长期培养;(2)毒素不易制备或易失活的病原菌的抗性筛选。     

抗二氯喹啉酸烟草材料的筛选与鉴定

为获得抗二氯喹啉酸的烟草育种材料,本研究通过叶面喷施不同浓度二氯喹啉酸,研究受药害烟株叶面积变化规律和烟草药害等级情况,确定喷施二氯喹啉酸对烟草苗期药害的临界浓度及适宜观测时间,并对烟草EMS突变体材料进行规模化筛选鉴定。结果表明,喷施处理引起烟草药害的临界浓度为0.5 mg/L,超出临界值浓度,烟草叶片会出现明显药害症状;为获得较高抗性的突变体材料,以1 mg/L为最适施药浓度,在药害症状明显时（施药后14 d）进行观测,获得了多个对二氯喹啉酸高抗、中抗及敏感的突变体材料。对高抗材料QR-19的杂交一代株系抗性分析显示,该材料对二氯喹啉酸的抗性可能受隐性基因控制。本研究为解析烟草对二氯喹啉酸等激素型除草剂的抗药性机理及除草剂抗性育种奠定了材料基础。     

甘蓝型油菜EMS突变体库构建及抗除草剂突变体筛选

为了利用诱变技术快速创造变异类型丰富的油菜新材料用于油菜遗传改良，分别用0．4％、0．8％、1．O％和1．2％的EMS（甲基磺酸乙酯）溶液对甘蓝型油菜中双9号种子进行诱变处理。结果发现：（1）1．0％的EMS溶液是处理中双9号干种子的最适浓度，4种不同浓度处理M：表型变异率依次为11．26％、14．82％、27．19％和12．38％；（2）EMS诱变具有器官特异性；（3）M：突变体库中筛选到3株苯磺隆抗性突变体，突变率约为10^-4。现已创建了包括子叶、叶片、花器、株型、角果等多器官变异类型的突变体库，为油菜遗传研究提供了丰富的种质资源。     

利用HRM技术快速筛选低镉烟草突变体

低镉烟草种质资源对烟草育种及烟叶安全具有重要意义。本研究利用EMS处理贵烟1号获得诱变群体，按株系种植2020个M₂株系，每株系种植10株，株系内3株叶片混样提取DNA，并采用HRM技术对样本池筛选烟草镉转运基因NtHMA4突变体，共获得49份疑似突变材料。DNA测序鉴定发现，其中21个株系发生SNP突变，其中15个为错义突变，其余为同义突变。对突变体与和野生型材料叶片的镉含量分析发现，有8份突变体的镉含量较野生型显著下降（16.19%~42.08%）。利用HRM技术跟踪检测10份种子可正常萌发的错义突变体M₃家系，结果表明，HRM技术不仅可快速筛选烟草EMS诱变群体中的突变材料，结合DNA测序也可进一步对突变杂合体后代进行快速、准确的基因分型。      

超量表达NrCN烟草光合特征及烟叶化学成分分析

为明确TMV抗性基因NrCN对转基因烟草光合特性及烟叶化学成分的影响,在人工培养箱和温室条件下以含有P_(ubi.u4)::NrCN表达元件的T_2代转基因烟草植株为材料,分析了不同转基因烟草株系应答TMV感染时NrCN的表达量、转基因烟草化学成分含量(质量分数),以及烟草光合作用指标的差异。结果表明,转基因株系Q2对TMV抗性最强,表现为TMV感染后NrCN基因的表达量最高,叶片可形成明显的坏死斑,Q1株系次之。烟叶化学成分测定结果表明,Q2植株打顶前后总植物碱和总氮含量均显著(P0.05)低于其他两个转基因(Q1、Q3)和非转基因植株;而打顶前后Q2株系中氯离子积累较多。另外,打顶前非转基因植株的可溶性糖含量(14.82 mg·g~(-1))极显著(P0.01)低于转基因Q1株系(21.88 mg·g~(-1))和Q2株系(16.85 mg·g~(-1))。光合指标测定结果显示,NrCN基因的导入使转基因烟草的光合作用指标发生了不同程度改变,其中Q1株系在低光强(1 000μmol·m~(-2)·s~(-1))时其净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)和蒸腾速率(Tr)等指标均显著提高。因此Q1株系可作为培育抗TMV烟草新种质的理想亲本材料。     

一种苗期鉴定烟草赤星病抗性的新方法

烟草赤星病抗性的高通量鉴定是快速筛选和培育烟草抗赤星病品种的前提条件。以15份对赤星病表现不同抗性水平的烟草种质为材料,采用链格孢菌菌饼接种苗期离体叶片,以发病叶片病斑面积作为抗性评价指标,对15份烟草种质的抗性进行评价,并与其田间成株期赤星病抗性进行比较分析。结果表明,采用苗期菌饼接种,供试15份烟草种质的病斑面积差异显著,感病品种病斑平均面积明显大于抗病品种;各品种苗期赤星病鉴定结果与成株期抗性鉴定结果基本一致,且苗期病斑面积大小与3个不同年份、同一地点的成株期平均病级指数间相关性均达到显著水平,分别为0.78、0.74和0.66。表明本研究探讨的苗期离体叶片菌饼鉴定法可以用于烟草赤星病早期鉴定,病斑面积可以作为评价指标准确反映不同烟草品种间赤星病的抗性差异。     

沉默2b基因获得抗黄瓜花叶病毒(CMV)的转基因烟草

  目的  本研究利用dsRNA技术沉默2b基因,获得烟草品种云烟85的T₁代转基因抗CMV株系。  方法  构建含有CMV 2b部分序列反向重复的植物表达载体pBIN-2b（r）-In-2b（i）,以农杆菌介导的叶盘法转化普通烟草（Nicotiana tabacum）品种云烟85。  结果  抗性筛选获得112株T₀代转基因阳性植株,接种CMV进行抗病性鉴定,发现有46株T₀代转基因植株表现为抗病,其他66株表现为感病。Tas-ELISA检测表明,T₀代抗病烟株的病毒积累量显著低于感病烟株。选取10个T₀代抗病株系繁殖,接种CMV鉴定T₁代抗病性,发现部分T₁代烟株发生一定比例的抗感分离,T₁代抗性株率为46.7%~100%。Real-time PCR检测T₁代烟株,发现T₁代抗病烟株CMV 2b基因RNA积累水平显著低于感病烟株。  结论  基于以上策略及实验,获得抗CMV转基因烟草株系。      

雄烯二酮耐底物突变株的筛选及生物转化培养基优化

采用紫外、硫酸二乙酯复合诱变的方法对能选择性降解植物甾醇侧链的新金分支杆菌MN2进行诱变处理,利用梯度平板技术筛选高底物耐受性突变株,通过摇瓶发酵实验检测其转化性能,以期筛选出具有较高底物耐受性且转化生成雄烯二酮（androst-4-ene-3,17-dione,AD）能力提高的突变株。最终筛选到1 株能在含高浓度底物平板上生长的AD突变株MN4。在底物甾醇投料量为20 g/L,摇瓶发酵144 h时AD生成率为40.9%,较出发菌株提高了15.1%。经斜面接种连续传代5 次,MN4突变株遗传性状稳定。对突变株MN4的发酵培养基进行优化,通过正交试验确定的最佳培养基配比为：葡萄糖1 g/L,玉米浆25 g/L,磷酸二氢钠0.6 g/L,硝酸钠6.2 g/L,豆油160 g/L。根据该配方进行转化,得到AD的生成率为50.6%。     

空间中特定自仿测度的谱性质分析

在三维空间R3中,当M=1/2[p1+p2,p1-p3,p2-p3;p1-p2,p1+p3,-p2+p3;-p1+p2,-p1+p3,p2+p3],D={0,e1,e2,e3}时,其中pj∈Z\{0,±1}(j=1,2,3),e1,e2,e3是R3中的单位向量,对迭代函数系{d(x)}d∈D产生的自仿测度μM,D的谱性质进行分析.得到:(1)当pj∈2Z\{0,2}(j=1,2,3)或p1=p2=p3=2时,μM,D是谱测度;(2)当p1,p2,p3至少有一个数是偶数时,空间L2(μM,D)中存在无限正交系E(Λ)且ΛZ3;(3)当pj∈2Z+1\{±1}(j=1,2,3)时,μM,D不是谱测度,且空间L2(μM,D)中正交指数函数系至多包含4个元素,且数字“4”是最好的.