兔骨髓间充质干细胞的体外分离培养、低温冻存及复苏研究

目的寻求体外培养、冻存、复苏兔骨髓间充质十细胞（bone marrow mesenehymal stein cell,BMMSC）的方法,观察体外培养BMMSC的形态及生长特性,研究低温冻存对兔BMMSC生长的影响,为兔BMMSC进一步的实验研究打下基础。方法取新西兰白兔胫骨穿刺获取骨髓液,密度梯度离心法联合贴壁培养法体外纯化扩增,并行液氮冻存3个月。通过倒置显微镜观察其生物学表现,并进行细胞增殖活性分析．绘制生长曲线。结果兔BMMSC为贴壁生长,形态为均匀成纤维细胞样,增殖能力强,传代及冻存后细胞仍然保持其生物学特性。结论兔BMMSC可采取密度梯度离心法联合贴壁培养法进行较好地纯化和扩增,并町长期保存于液氮中,在一定的条件下可复苏存活,冻存不影响细胞的增殖能力。     

冻融前后人牙髓等成纤维细胞生物学特征的比较

本研究对体外培养的第5代人牙髓牙周牙龈成纤维细胞进行了冷冻和复苏,三种细胞复苏的存活率分别为14%、19%和24%,复苏后细胞的生长曲线和倍增时间等生物学特征与冻存前基本一致,提示冻融后的人牙髓牙周牙龈成纤维细胞基本保持冻融前的生物学特征.     

低温冷冻保存对人牙本质和牙髓细胞生物学性能影响的初步研究

目的：比较人离体牙在低温冷冻保存前后的牙本质和牙髓细胞的生物特性,探讨其应用价值。方法：收集需要拔除的无龋坏、无缺损新鲜离体前磨牙或第三磨牙40颗。其中20颗离体牙制成牙本质盘标本,随机分为程序降温组和新鲜拔除组,每组10颗;冻存复苏后,进行力学分析以及用扫描电观察两组标本的牙本质表面和纵剖面。剩余20颗牙使用改良组织块法原代分离牙髓细胞,冻存复苏后,观察分析冻存前后的细胞形态及生长特性。结果：低温冷冻保存复苏后,离体牙的牙本质和牙髓细胞的生长特性的情况均无明显差异。结论：应用程序低温冷冻技术保存牙齿,牙体牙髓组织生物学特性均能保持良好。     

成骨细胞超低温冻存前后生物学功能变化的研究

目的 观察超低温（液氮,-196 ℃）冻存对幼兔骨髓来源的成骨细胞体外培养的生长特性和生物学功能的影响。方法 自幼兔骨髓获取基质干细胞,体外诱导分化并培养 扩增,部分细胞进行液氮冻存,对冻存前后细胞的形态变化、增殖情况、克隆形成率、碱性磷酸酶（ALP）的合成能力、蛋白质合成能力及体外矿化能力进行对比观察,综合比较低温冻存对细胞功能的影响。结果 冻存复苏细胞的增殖有一定的时间延后性,其大体形态与冻存前基本一致,超微结构略有变化;复苏细胞仍保持典型的成熟成骨细胞的特征,具有较强的合成ALP及蛋白质的能力,两组细胞无统计学差异（P>0.05）;复苏细胞的体外矿化能力无明显变化。结论 超低温保存成骨细胞对其
生物学功能影响甚微,利用复苏细胞进行骨组织工程方面的研究是可行的。     

人牙龈和牙周韧带成纤维细胞的体外培养及生物学特性研究—细胞形态，生长曲线及碱性磷酸酶活性测定

目的：建立人牙龈和牙周韧带成纤维细胞体外培养模型并对其生物学特性作初步探讨。方法．；采用组织块法常规条件下分别进行牙龈和牙周韧带成纤维细胞的培养，通过光镜，透射电镜，生长曲线及碱性磷酸酶测定等手段对其部分生物学特性进行研究。结果：两种培养的原代及传代细胞在光镜下细胞排列及结构无明显判别，传代培养时牙龄纤维细胞有接触抑制现象，而牙周韧带成纤维细胞则可呈复层生长，牙周韧带成纤维细胞排列方向性较明显，生长曲线表明牙周韧带成纤维细胞增殖活性高于牙龄成纤维细胞；碱性磷酸酶活性测定及染色法显示两者有明显的判别。结论：体外培养的两种细胞在形态及排列上相似，但百细胞亚型的组成上存在差异。     

SD大鼠成肌细胞冻存复苏后体外培养的实验研究

目的：探讨成肌细胞冷冻复苏后，体外培养条件下的生物学特征。方法：将原代、2、4、6代成肌细胞液氮冻存，4周后复苏并进行体外培养，并与未冻存的相应各代次传代成肌细胞进行体外增殖特征比较；同时对传代和复苏成肌细胞的第2代细胞融合率进行了观察。结果：复苏后成肌细胞倍增时间、平顶期较对照组长；但成肌细胞形态、特性未见明显变化；复苏后成肌细胞融合率与传代细胞一致。结论：成肌细胞冻存后可以作为组织工程化面肌修复所需的种子细胞来源用于实验研究。     

人牙龈和牙周韧带成纤维细胞的体外培养及生物学特性研究——细胞形态、生长曲线及碱性磷酸酶活性测定

目的 :建立人牙龈和牙周韧带成纤维细胞体外培养模型并对其生物学特性作初步探讨。方法 :采用组织块法常规条件下分别进行牙龈和牙周韧带成纤维细胞的培养 ,通过光镜、透射电镜、生长曲线及碱性磷酸酶测定等手段对其部分生物学特性进行研究。结果 :两种培养的原代及传代细胞在光镜下细胞排列及结构无明显差别 ,传代培养时牙龈成纤维细胞有接触抑制现象 ,而牙周韧带成纤维细胞则可呈复层生长 ,牙周韧带成纤维细胞排列方向性较明显 ,生长曲线表明牙周韧带成纤维细胞增殖活性高于牙龈成纤维细胞 ;碱性磷酸酶活性测定及染色法显示两者有明显的差别。结论 :体外培养的两种细胞在形态及排列上相似 ,但在细胞亚型的组成上存在差异。     

大鼠髁突软骨细胞冻存复苏后的生物学特性观察

目的观察低温冻存1月后,不同年龄大鼠髁突软骨细胞的生物学特性。方法体外培养出生后1天、7天、14天、28天共4组SD大鼠髁突软骨细胞。对冻存复苏后的细胞进行形态学观察;甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色检测其对糖胺聚糖(GAG)、Ⅱ型胶原的合成能力;台盼蓝拒染试验测定细胞成活率;MTT法观察细胞增殖能力;实时定量-聚合酶链式反应(real time-PCR)检测冻存后细胞增殖核抗原(PCNA)基因表达情况。结果低温冻存后,各年龄组大鼠髁突软骨细胞仍能保持软骨细胞特有的形态及特性;细胞成活率均大于90%;生长曲线近似"S"型;冻存后各年龄组细胞pcna基因表达较冻存前无显著统计学差异(P>0.05)。结论低温冻存1月后的大鼠髁突软骨细胞成活率高,并保持了其生物学特性及增殖活性。     

人牙髓成纤维细胞等的体外培养、生长特性和鉴定

本实验从人恒牙分离牙髓组织,牙周组织和取鼠胚胎骨作体外培养。收集标本40个,培养出牙髓成纤维细胞7株,牙周膜成纤维细胞16个标本生长原代细胞8株,5个胚胎骨组织均生长7d以上。牙髓和牙周膜成纤维细胞形态典型,抗波形丝蛋白阳性。证明是中胚层来源的成纤维细胞,细胞生长曲线分裂指数显示细胞增殖正常,牙周膜细胞增长速度快于牙髓细胞。说明体外培养人牙髓和牙周膜细胞是可行的。     

冻融前后人牙髓等成纤维细胞超微结构和染色体数目的比较

本研究对人牙髓牙周牙龈成纤维细胞冻存和复苏后超微结构和染色体数目进行了观察比较,结果表明:冻融前后三种细胞70%以上染色体数目为23对,冻融后三种细胞线粒体等细胞器有部分老化,溶酶体数目增多.     

体外克隆化传代培养人年轻恒牙牙髓干细胞的研究

目的：观察克隆化传代培养10代以上人年轻恒牙牙髓干细胞的形态及特性。方法：体外分别采用传统传代法和克隆化传代法培养人年轻恒牙牙髓干细胞,流式细胞仪分别检测两种培养方法传代第10代细胞表面抗原stro-1的表达。细胞连续性克隆化传代培养。结果：克隆化传代培养的第10代细胞表面抗原stro-1阳性率高于传统传代培养的细胞（P〈0.05）。所培养的细胞具有干细胞的形态特征,呈集落型生长。目前细胞已稳定传代22代。结论：克隆化传代培养能有效提纯人年轻恒牙牙髓干细胞,细胞能稳定传代20代以上并保持干细胞特性。     

人牙源性上皮细胞的体外培养研究

目的：建立人牙源性上皮细胞的体外培养方法，为牙齿组织工程研究提供可靠的种子细胞来源。方法：采用组织块法原代培养人牙源性上皮细胞，用更换培养液类型、多次差别消化法和反复贴壁法进行纯化，在倒置显微镜下观察细胞形态及生长状况，用免疫荧光法检测细胞表达角蛋白和成釉蛋白的情况。结果：原代培养的人牙源性上皮细胞生长良好，但有少量成纤维细胞混杂，经纯化后明显好转，上皮细胞呈片状生长，表达角蛋白及成釉蛋白。传至第5代后，细胞逐渐变为长梭形，失去上皮细胞形态。结论：体外培养的人牙源性上皮细胞在较长时间内可保持其特性，有望作为牙齿组织工程研究的种子细胞。     

体外培养的人牙髓细胞表型分析

目的：分离培养来源于人体的牙髓细胞并对其细胞表型进行分析。方法：采用组织块法培养人牙髓细胞,根据牙髓的细胞成分选择特异性抗体,利用免疫组化技术对其细胞表型进行分析。结果：Ⅲ型胶原在体外培养的牙髓细胞中广泛表达,ON和OPN表达也较广泛,阳性细胞呈星形,伸出多个胞浆突起互相连接;α-平滑肌肌动蛋白和CD34表达细胞为集落状,前者呈细长的梭形,后者呈圆形;Ⅰ型胶原、BSP和OC仅在少量细胞中表达,且细胞形态不规则;DSP、NF、CD14及CD45均为阴性。结论：体外培养的人牙髓细胞表型呈现多样性,表达平滑肌、内皮细胞及骨的标志物。     

Production of colony-stimulating factor in human dental pulp fibroblasts

Class II major histocompatilibity complex (MHC)-expressing cells are usually distributed in dental pulp, and it was postulated that the colony-stimulating factor (CSF) derived from dental pulp fibroblasts contributes to the migration of class II MHC-expressing cells into pulp tissue. This study aimed to investigate the CSF production of human dental pulp fibroblasts. In pulp tissue sections, granulocyte (G)-CSF was detected from normal teeth, while G-CSF, macrophage (M)-CSF, and granulocyte-macrophage (GM)-CSF were detected from teeth with dentinal caries. In cultured dental pulp fibroblasts, G-CSF was detected by immunostaining, immunoprecipitation, and ELISA, and mRNAs of G-CSF, M-CSF, and GM-CSF were detected by RT-PCR. The dental pulp fibroblasts cultured with TNF-alpha were found to increase the G-CSF expression and to produce M-CSF and GM-CSF. These findings suggest that dental pulp fibroblasts usually produce G-CSF. In the presence of TNF-alpha, dental pulp fibroblast express M-CSF and GM-CSF.     

应用不同方法进行人牙髓细胞原代培养的比较研究

目的比较并建立人牙髓细胞原代培养的理想方法.方法分别采用组织块法、酶消化法和组织块消化法进行人牙髓细胞的体外原代培养,倒置显微镜及台盼蓝染色观察并比较三者的培养成活率、细胞活力、细胞形态和数量、培养耗时等,免疫组化法鉴定细胞来源.结果三种方法均可从人牙髓组织分离培养获得外胚间充质来源的牙髓细胞.组织块法耗时较长,4周能进行首次传代,传代成功率50%,细胞形态较单一;酶消化法能在较短时间内获得形态多样的人牙髓细胞,但培养成活率较低,且细胞数量较少,8天时传代成功率为20%;组织块消化法不仅培养成活率(75%)和8天传代成功率(62.5%)较高,而且在较短时间内可多量获得多种形态类型的人牙髓细胞.结论组织块消化法是一种更加科学可行的人牙髓细胞原代培养的优化方法,可为进行人牙髓干细胞的分离培养及特性研究提供实验方法学基础.     

人牙髓干细胞在聚乳酸-聚乙醇酸共聚物支架上粘附与增殖的研究

目的：研究成人牙髓干细胞（HDPSCs）在聚乳酸-聚乙醇酸共聚物（PLGA）支架上粘附与增殖的情况。方法：采用酶消化法分离、培养人牙髓干细胞,免疫组化法及体外诱导分化对细胞进行鉴定。将人牙髓干细胞与PLGA支架材料进行复合培养,扫描电镜（SEM）观察支架材料形态,细胞粘附、增殖及基质分泌情况;细胞计数检测其增殖力。结果：细胞接种2、5、10d,扫描电镜及细胞计数均显示HDPSCs与PLGA支架材料粘附紧密,生长状态良好,细胞明显增殖（P〈0.05）,有丰富的细胞外基质形成。结论：PLGA是一种适宜人牙髓干细胞粘附与增殖的支架材料。     

In vivo and in vitro glycosaminoglycans from human dental pulp.

A qualitative assessment was made of the type of glycosaminoglycans (GAG) present in normal human dental pulp using electrophoresis on cellulose-acetate plates. A comparison was also made between the GAG derived directly from the dental pulp (in vivo) and those derived from cultured pulp fibroblasts from the same individual (in vitro). The results of this study showed four main types of GAG in normal human dental pulp tissue, which were dermatan sulfate, heparan sulfate, hyaluronic acid, and chondroitin sulfate. GAG synthesis from cultured pulp fibroblasts in vitro was different from the GAG present in the dental pulp (in vivo). Extracellular GAG, as well as pericellular GAG consisted of dermatan sulfate, hyaluronic acid, chondroitin sulfate, and heparin. Cellular GAG, however, contained only dermatan sulfate, hyaluronic acid, and chondroitin sulfate. There was no difference in type of GAG from the second and fourth passaged pulp fibroblasts.     

体外人牙髓细胞的矿化特性

为探讨体外人牙髓细胞的生物学特性，采用体外细胞连续培养、钙质染色、Ｘ射线能谱分析与透射电镜观察等方法，对体外人恒牙牙髓细胞的矿化特性进行了研究并与人牙龈成纤维细胞（ｈｕｍａｎｇｉｎｇｉｖａｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，ＨＧＦｓ）进行了比较。结果表明，人牙髓细胞在体外可以复层生长并形成细胞结节，ＨＧＦｓ则无此能力，牙髓细胞的碱性磷酸酶活性亦较ＨＧＦｓ者高；细胞结节钙质染色呈阳性，结节内钙磷含量明显增高；人牙髓细胞有许多与成牙本质细胞相似的超微结构特征，胞间基质中可见致密晶状小体。结果提示，体外连续培养的人牙髓细胞有向成牙本质细胞分化的可能，这可为研究人牙髓细胞的分化和矿化提供有价值的思路。