基于群体感应研究苦丁茶多酚对荧光假单胞菌腐败特性的抑制作用

为探究苦丁茶多酚对分离自卵形鲳鲹的腐败菌荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）的抑制作用,本文以报告菌株紫色杆菌(Chromobacterium violaceum) CV026 为检测模型,测定了苦丁茶多酚对细菌的群体感应抑制活性,以胞外酶活性、生物被膜形成量及形态、群集与泳动性为指标,测定了苦丁茶多酚对荧光假单胞菌腐败特性的抑制作用。结果表明:苦丁茶多酚对CV026、荧光假单胞菌的最小抑菌浓度分别为2.1、3.0 mg/mL;在亚抑菌浓度下,苦丁茶多酚可以显著降低紫色杆菌CV026 紫色菌素的产生量（P<0.05）;当浓度为2.0 mg/mL 时,对紫色菌素的抑制率达68.89%,且不影响CV026 菌株的生长;苦丁茶多酚能有效抑制荧光假单胞菌胞外酶活性、生物被膜形成、群集与泳动能力等相关腐败特性,其抑制作用呈剂量依赖性,苦丁茶多酚浓度为2.0 mg/mL时,对蛋白酶、脂肪酶活性、生物被膜形成、群集和泳动能力的抑制率分别达到80.68%、53.50%、44.90%、79.56%和90.12%;苦丁茶多酚具有较好的群体感应抑制活性,可以为新型天然群体感应抑制剂研发提供参考。     

绿薄荷精油对温和气单胞菌群体感应现象及其腐败特性的抑制作用

本研究以紫色杆菌Chromobacterium violaceum 026（CV026）为检测指标,结合气相色谱-质谱定量检测信 号分子,研究绿薄荷精油对温和气单胞菌群体感应现象及其腐败特性的影响。结果表明：在亚抑菌剂量下,绿 薄荷精油具有降低紫色杆菌CV026产紫色菌素的能力,其剂量为2 μL/mL时,对紫色菌素的抑制率达56.17%; 绿薄荷精油对温和气单胞菌N-酰基高丝氨酸内酯的分泌及某些腐败特性的表达,如生物被膜的形成、胞外蛋白 酶活力和细菌迁移（群集和泳动）,均有抑制作用;随着绿薄荷精油剂量的升高,抑制效果更趋明显,并且呈 现剂量依赖性。可见,绿薄荷精油具有良好的群体感应抑制活性,可作为新型的群体感应抑制剂用于延长水产 品货架期。     

绿原酸对荧光假单胞菌群体感应现象及其腐败特性的抑制作用

首先以群体感应报告菌株紫色杆菌CV026检测模型,确定绿原酸的群体感应抑制活性,结合HPLC-MS/MS检测其对荧光假单胞菌释放信号分子的影响。以胞外酶活性、嗜铁素、群集与泳动为评价指标,通过添加外源信号分子分析绿原酸对荧光假单胞菌群体感应活性及腐败特性的调控作用。结果表明:在不影响荧光假单胞菌正常生长的剂量下,绿原酸可以减少其信号分子的产生,明显抑制荧光假单胞菌嗜铁素的产生、胞外蛋白酶、胞外脂肪酶活性、群集与泳动等相关腐败特性,且随着绿原酸浓度的升高,抑制效果更趋明显。因此,绿原酸具有较好的群体感应抑制活性,该研究为绿原酸作为群体感应抑制剂的开发提供了理论支持。     

乙基麦芽酚对杀鲑气单胞菌群体感应及腐败活性的抑制作用

本研究利用群体感应报告菌株紫色杆菌（Chromobacterium violaceum）026鉴定乙基麦芽酚的抗群体感应活性,通过气相色谱-质谱定量检测分析乙基麦芽酚对杀鲑气单胞菌（Aeromonas salmonida）分泌信号分子的影响。添加外源信号分子,以生物被膜形成量、胞外蛋白酶活力、细菌运动性（群集和泳动迁移直径）为指标,分析乙基麦芽酚对杀鲑气单胞菌群体感应及腐败活性的抑制作用。结果表明：乙基麦芽酚对紫色杆菌026以及杀鲑气单胞菌的最小抑菌浓度为0.1 mg/mL,在亚抑菌浓度下,乙基麦芽酚可降低紫色杆菌026产紫色杆菌素的能力;气相色谱-质谱定量检测结果显示,乙基麦芽酚对杀鲑气单胞菌所产群体感应信号分子C12-高丝氨酸内酯的分泌具有明显的抑制作用;且0.08 mg/mL乙基麦芽酚对杀鲑气单胞菌生物被膜形成、胞外蛋白酶活力和细菌运动性（群集和泳动）的抑制率分别为71.2%、69.1%、80.4%和82.1%,且抑制作用具有浓度依赖性。由此可见,乙基麦芽酚对杀鲑气单胞菌具有较强的群体感应抑制效果,有望作为群体感应抑制剂用于水产品保鲜。     

固定化青霉素酰化酶对荧光假单胞菌群体感应的抑制作用

水产品腐败菌的群体感应现象是加速水产品腐败的原因之一。近年来,由于化学保鲜剂的使用导致许多腐败菌产生抗性,并且其安全性也令消费者担忧,因此研究安全、高效的生物保鲜剂是水产保鲜中的重要课题。本研究用固定化青霉素酰化酶来抑制水产品优势腐败菌——荧光假单胞菌的群体感应现象。利用CV026验证固定化青霉素酰化酶对荧光假单胞菌AHLs的淬灭作用;利用光学显微镜和扫描电镜研究酶对生物被膜的影响;利用牛奶琼脂平板验证胞外蛋白酶的活性;通过分子对接预测酶与不同AHLs的相互作用。结果表明,固定化青霉素酰化酶能够降低荧光假单胞菌AHLs的含量,从而减少紫色杆菌CV026紫色菌素的生成,减缓荧光假单胞菌生物被膜和胞外聚合物的形成。同时也干预了胞外蛋白酶的产生,当酶质量浓度为15 mg/mL时无法观察到明显的蛋白抑制圈。分子对接结果显示,该酶与短链和长链的信号分子都能成功对接,然而,更偏向于长链AHLs。3D对接结果显示,C14-HSL被活性中心周围的氨基酸残基全部包裹,相互以氢键连接,氢键的数量较多,结合作用更强。由此说明固定化青霉素酰化酶具有良好的群体感应淬灭活性,可作为新型保鲜剂应用于水产品保鲜。     

丹皮酚对格氏沙雷菌群体感应现象及生物被膜形成的影响

采用生物传感器紫色杆菌CV026检测丹皮酚的群体感应现象抑制能力,探讨丹皮酚对格氏沙雷菌群体感应现象及生物被膜形成能力的影响。结果表明:在亚抑菌浓度下,丹皮酚对紫色杆菌CV026产紫色菌素有抑制作用,500μg/mL丹皮酚处理紫色杆菌后紫色菌素产量下降57.95%。光学显微镜分析丹皮酚对格氏沙雷菌生物被膜形成有抑制作用,扫描电镜验证丹皮酚不仅抑制生物被膜形成,而且可使生物被膜断裂。丹皮酚还抑制格氏沙雷菌毒力因子的表达,如蛋白酶和胞外多糖产量,随着丹皮酚质量浓度的增加,抑制作用呈现质量浓度依赖性。由此可见,丹皮酚有较强的群体感应抑制效果。     

面包乳杆菌ZHG2-1对荧光假单胞菌群体感应的淬灭作用

以紫色杆菌CV026为指示菌株，验证面包乳杆菌ZHG2-1群体感应淬灭活性，检测其对荧光假单胞菌生物膜、致腐因子表型以及相关基因表达水平的影响，探究面包乳杆菌ZHG2-1对荧光假单胞菌群体感应的淬灭机制。结果表明:菌株ZHG2-1无细胞上清液对荧光假单胞菌AHLs的降解活性为100%。在亚抑制质量浓度(1.0，2.0，3.0 mg/mL)下，菌株ZHG2-1粗提物对荧光假单胞菌生物膜的抑制率和清除率分别为在9.66%~31.32%和28.62%~62.82%范围，对胞外多糖、蛋白酶、脂肪酶、生物胺等致腐因子抑制率在7.23%~100%范围，并呈质量浓度依赖性。扫描电镜结果表明亚抑制质量浓度的菌株ZHG2-1粗提物处理使其生物膜量显著减少，细菌菌落处于分散状态。qRT-PCR结果显示，菌株ZHG2-1粗提物对荧光假单胞菌群体感应基因rhlI和rhlR分别下调0.93和0.99，aprX、algA、orm、flgA、ldcA等生物膜和致腐基因的表达水平也被显著抑制，说明面包乳杆菌ZHG2-1通过干扰荧光假单胞菌群体感应基因的表达，影响其生物膜和腐败因子的产生。本研究结果为开发水产品新型生物防腐剂提供理论依据。     

肉桂油对大菱鲆荧光假单胞菌腐败能力的抑制作用

利用报告菌株紫色杆菌CV026检测模型,验证肉桂油具有群体感应抑制活性。以大菱鲆灭菌鱼汁为研究对象,接种荧光假单胞菌后,经3μL/m L肉桂油处理并于4℃下贮藏,每隔24 h测定细菌菌落总数、荧光假单胞菌落数、TMA和TVB-N,结合感官评价,研究肉桂油对荧光假单胞菌腐败能力的抑制作用。结果表明:肉桂油能够显著减缓鱼汁感官品质的下降(p0.05),有效降低鱼汁的TMA和TVB-N(p0.05),但不影响荧光假单胞菌的生长。可见,肉桂油可以通过干扰荧光假单胞菌的群体感应系统,来降低其腐败能力,并且这种效果不是利用抑菌作用来实现的。     

钝顶螺旋藻提取物对细菌群体感应的抑制作用

以mini-Tn5突变株Chromobacterium violaceum CV026为报告菌检测系统,研究钝顶螺旋藻甲醇提取物的群体感应抑制活性及对大菱鲆腐败菌Shewanella putrefacens生物膜形成的影响。结果表明:螺旋藻75%甲醇提取物(0.125～1.000g/100mL)不仅能显著降低Chromobacterium violaceum CV026细菌紫色菌素的产生,而且能显著抑制外源信号分子N-已酰化高丝氨酸内酯(10μmol/L C6-HSL)诱导的报告菌紫色菌素的增加。当螺旋藻提取物添加质量浓度为1.000g/100mL时,对报告菌紫色菌素的抑制率达87.67%,对Shewanella putrefacens生物膜的形成抑制率达77.05%,与对照差异均达显著水平(P<0.05)。抑菌实验表明,在给定的质量浓度范围内,螺旋藻提取物对报告菌的生长无显著影响;螺旋藻提取物抑制紫色色素的产生与生物膜的形成不是通过抑制细菌的生长来实现的,而与抑制信号分子诱导的群体感应现象有关;螺旋藻提取物具有较强的细菌群体感应抑制活性,可作为细菌群体感应抑制剂用于新鲜食品及其制品的贮藏与保鲜。     

与己醛具有群体感应协同抑制效应的精油成分组合筛选研究

为了减少精油作为抗菌剂的实际使用量,研究了对胡萝卜软腐欧氏杆菌(蔬菜腐败菌)的群体感应具有协同抑制作用的精油成分组合。基于胡萝卜软腐欧氏杆菌的最小抑菌浓度和分级抑菌浓度,从9种精油成分中筛选出与己醛具有协同抑菌作用的4个精油成分组合,利用紫色杆菌CV026和胡萝卜软腐欧氏杆菌筛选其中对二者群体感应具有协同抑制效应的精油成分组合,进一步利用能够判别两种物质是否具有协同作用的金氏公式验证,发现己醛只有与香叶醇组合才具有较好的群体感应协同抑制效果,而且有效浓度仅为己醛和香叶醇单体最小抑菌浓度的1/8和1/16。该组合对紫色杆菌CV026和胡萝卜软腐欧氏杆菌的群体感应相关指标均具有较好的抑制效果,其中群体感应指标中的产紫色菌素、游泳运动、群集运动、产胞外多糖和生物被膜形成的抑制率分别为52.91%、58.19%、51.49%、65.03%和69.84%。通过扫描电子显微镜和激光共聚焦显微镜进一步观察到己醛联合香叶醇对胡萝卜软腐欧氏杆菌生物被膜的形成具有明显的破坏作用。研究结果表明,具有协同抑制腐败菌群体感应作用的己醛与香叶醇组合,可以在降低精油成分实际使用量的同时,有效抑制腐败菌的腐败特性。     

Quorum Sensing Regulation and Inhibition of Exoenzyme Production and Biofilm Formation in the Food Spoilage Bacteria Pseudomonas psychrophila PSPF19

Gram-negative bacteria use the mechanism of acylated homoserine lactone (AHL) mediated quorum-sensing to regulate gene expression in response to population density. The present work aimed to detect signal molecule production and its influence on the production of food spoilage phenotypes such as exoenzyme (lipases and proteases) synthesis and biofilm formation in Pseudomonas psychrophila PSPF19, isolated from freshwater fish stored in refrigerated conditions. The C4-HSL signaling molecule produced by the isolate induced exoenzyme production by twofold and increased attachment and biofilm formation. Further, studies on the effect of a synthetic quorum sensing inhibitor, furanone C-30 on protease and lipase production and biofilm formation, revealed that it inhibited exoenzyme production and bacterial attachment. This study adds to our understanding that quorum sensing plays a role in the low temperature spoilage of foods by psychrotrophic Pseudomonads and quorum sensing inhibitors such as furanones can be developed as new intervention techniques and food preservatives.     

Quorum Sensing Inhibitory and Anti-Biofilm Activity of Essential Oils and Their in vivo Efficacy in Food Systems

The present study investigated the effect of the essential oils of Cuminium cymium, Murraya koenigii, Curcuma longa, Zingiber officinale, Myristica fragrans (mace and nutmeg), Trigonella foenum graceum, and Elettaria cardamomum on AHL-mediated quorum sensing and biofilm formation. Inhibition of quorum sensing (QS) regulated phenotypes by the essential oils at subinhibitory concentrations was investigated using the biosensor bacteria Chromobacterium violaceum (C. violaceum 12472 and C. violaceum CV026) and Pseudomonas aeruginosa PA01. Sub-MIC of essential oils was screened for inhibition of quorum-sensing regulated pigment production, motility and biofilm formation in the biosensors. The essential oil of M. koenigii showed the most promising QS inhibitory and anti-biofilm activity at a concentration of 0.02% v/v and hence was used for further studies. Anti-biofilm activity against food spoilage Pseudomonas species was studied by crystal-violet MTP method and fluorescence microscopy. The essential oil of M. koenigii at sub-MICs inhibited biofilm formation in the pseudomonads by inhibiting cell attachment, reducing metabolic activity and EPS production, and preventing biofilm maturation. Further, it was capable of delaying spoilage by psychrotrophic P. psychrophila PSPF19 in refrigerated milk. The major components present in M. koenigii essential oil were caryophyllene, caryophyllene oxide, cinnamaldehyde, α-, and β-phellandrene and eugenol. Application of M. koenigii essential oil and its constituents based on the quorum-sensing inhibitory and anti-biofilm activity would be a novel intervention strategy to enhance shelf life and food safety.     

冷藏草鱼源气单胞菌的群体感应现象及其对生物膜形成的影响

以冷藏草鱼的优势腐败菌气单胞菌（Aeromonas spp.）为研究对象,利用报告菌株Chromobacterium violaceum CV026检测细菌的群体感应活性,通过染色法定量测定细菌的生物膜形成,并探究温度以及群体感应信号分子对气单胞菌生物膜形成的影响。结果显示,冷藏草鱼的气单胞菌属包含多个不同种,分离获得的20 株气单胞菌中90%能产生N-酰基高丝氨酸内酯。进一步分析生物膜形成量较强的2 株菌A. salmonia W41和A. salmonia W69,结果显示该2 株菌在30 ℃和8 ℃的生物膜形成量高于37 ℃。菌株W41和W69主要分泌N-丁酰基高丝氨酸内酯（N-butanoyl-L-homoserine lactone,C4-HSL）和N-己酰基高丝氨酸内酯（N-hexanoyl-L-homoserine lactone,C6-HSL）信号分子,50 μmol/L的C6-HSL显著促进W41生物膜的形成;而低浓度的C4-HSL和C6-HSL促进W69生物膜的形成,高浓度的C4-HSL和C6-HSL抑制W69生物膜的形成。可以看出,大多数气单胞菌属具有群体感应现象,气单胞菌属生物膜的形成受个体差异和温度的影响,同时群体感应信号分子的浓度和类型也是影响气单胞菌属生物膜形成的主要因素。     

大菱鲆荧光假单胞菌的群体感应现象及不同碳源培养下的腐败特性研究

本文以大菱鲆分离的荧光假单胞菌作为研究对象,紫色杆菌CVO26平行划线法检测信号分子。不同碳源(葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖、乳糖、麦芽糖)的AB培养基培养并检测其生物被膜、嗜铁素和胞外蛋白酶的产生量,同时添加外源的信号分子标准品,研究AHLs与腐败因子之间的相关性。研究表明:大菱鲆分离的荧光假单胞菌能够发生群体感应现象,经不同碳源培养,其腐败因子产生情况有明显差异,碳源的添加对生物被膜的产生有促进作用,对胞外蛋白酶的产生没有显著影响;以葡萄糖、麦芽糖为碳源,生物被膜的产生量较高;以蔗糖和乳糖为碳源,嗜铁素的产量较高。添加外源信号分子标准品,生物被膜、嗜铁素和胞外蛋白酶的产生量有显著提高。因此,生物被膜、嗜铁素和胞外蛋白酶的产生与AHLs有关,群体感应现象可调控腐败特性的表达,并在水产品腐败过程中发挥作用。