自噬对宫颈癌细胞增殖和迁移能力的影响

目的 观察自噬对宫颈癌细胞增殖迁移能力的影响,并探讨其可能机制。方法 采用不同浓度雷帕霉素诱导人宫颈癌HeLa细胞,吖啶橙染色观察自噬小体的形成,Western blot检测自噬相关基因LC3B以及PI3K/Akt/mTOR通路蛋白的表达情况,采用RTCA仪器实时检测细胞的增殖能力,Transwell小室检测细胞的迁移能力。应用自噬抑制剂3-methyladenine(3-MA)阻断宫颈癌细胞自噬后,采用RTCA仪器实时检测细胞的增殖能力,Transwell小室检测细胞的迁移能力。构建带有绿色荧光蛋白的LC3B质粒,转入HeLa细胞,通过G418药物筛选转染阳性细胞,荧光显微镜观察LC3B的细胞定位,Western blot检测LC3B表达。RTCA仪器实时检测野生型和LC3B过表达HeLa细胞的增殖能力,Western blot检测PI3K/Akt/mTOR通路蛋白的表达。结果 雷帕霉素诱导后,宫颈癌HeLa细胞自噬水平增高,增殖和迁移能力有所下降;PI3K/Akt/mTOR通路蛋白表达改变(P＜0.05)。自噬抑制剂3-MA诱导HeLa细胞增殖和迁移水平下降(P＜0.05)。荧光显微镜和Western blot结果显示构建的LC3质粒成功转入Hela细胞中并且能够抑制宫颈癌细胞的增殖(P＜0.05)。结论 在一定范围内,随着自噬水平的升高,HeLa细胞增殖和迁移能力降低,可能是通过PI3K/Akt/mTOR信号通路发挥作用。通过基因靶向扰乱自噬关键基因(如LC3等)而改变宫颈癌细胞自噬水平可能为宫颈癌的治疗带来新策略。     

自噬在熊果酸抑制人宫颈癌HeLa细胞增殖中的作用

[目的]分析自噬在熊果酸抑制人宫颈癌HeLa细胞增殖中的作用.[方法]体外培养人宫颈癌HeLa细胞,不同浓度(5、10、20μmol/L)的熊果酸处理48h后,采用MTT法检测HeLa细胞增殖抑制率的变化;透射电镜观察细胞自噬超微结构的改变;Western blotting检测自噬相关蛋白p62及Beclin-1的表达情况;微管相关蛋白1轻链3A/B (microtubule-associated protein 1 light chain 3 A/B,LC3A/B)免疫荧光检测熊果酸对HeLa细胞自噬水平的影响;检测自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)抑制自噬前后对熊果酸增殖抑制作用的影响.[结果]不同浓度(5、10、20 μmol/L)的熊果酸处理组对HeLa细胞的抑制率分别为20.1％±1.3％、35.6％±2.6％和49.0％±1.0％,熊果酸可抑制HeLa细胞增殖并呈剂量依赖性(=446.177,P＜0.001);熊果酸能诱导HeLa细胞发生自噬:透射电镜观察发现经熊果酸处理后HeLa细胞中自噬囊泡明显增加;Western blotting分析表明熊果酸可呈剂量依赖性增加Beclin-1的表达,降低p62的表达;免疫荧光检测显示熊果酸处理后,HeLa细胞的荧光强度与对照组相比明显增强;3-MA与熊果酸联合作用于HeLa细胞时可抑制细胞增殖.[结论]熊果酸抑制HeLa细胞增殖,并诱导其发生自噬,自噬抑制剂3-MA能够增强熊果酸对HeLa细胞的增殖抑制作用.     

柴胡皂苷D抑制人结直肠癌细胞SW480增殖的分子机制探讨

目的:研究柴胡皂苷D（saikosaponin-D,SSD）抑制人结直肠癌细胞SW480增殖的分子机制。方法:Western blot检测SSD对AMPK信号通路相关蛋白（p-AMPKα和p-ACC）表达的影响;Western blot检测siRNA敲低AMPKα后SSD对AMPK信号通路相关蛋白表达的影响;MTT和细胞计数实验研究siRNA敲低AMPKα后SSD对SW480细胞增殖的影响。结果:SSD处理后,p-AMPKα和p-ACC的表达均增高（P＜0.05）;siRNA敲低AMPKα后SSD对p-AMPKα和p-ACC的上调作用被抑制（P＜0.05）;SSD抑制细胞的增殖（P＜0.05）,但AMPKα被敲低后SSD对SW480细胞的增殖抑制作用被抑制（P＜0.05）。结论:SSD通过激活AMPK信号通路抑制人结直肠癌细胞SW480的增殖。     

柴胡皂苷D通过诱导C2-M期阻滞抑制结直肠癌SW480细胞的增殖

目的:观察柴胡皂苷D（SSD）对于结直肠癌肿瘤细胞增殖的影响并初步探索其潜在的分子机制。方法:运用MTT、细胞计数试验及克隆形成试验观察SSD对细胞增殖的影响。流式细胞仪检测SSD对细胞凋亡及周期分布情况的影响。RT-PCR和Western-blot技术检测G2-M周期阻滞关键调控因子在SW480细胞中的表达。结果:MTT试验发现SSD能够显著抑制结直肠癌肿瘤细胞SW480的增殖,而对正常结直肠细胞FHC的增殖无明显影响。细胞计数试验和克隆形成试验进一步验证了SSD对于SW480细胞增殖的影响(P<0.05)。流式细胞术检测发现SSD不影响细胞的凋亡(P>0.05),但却显著诱导G2-M周期阻滞(P<0.05)。SSD在mRNA水平下调了G2-M周期调控因子CCNA1、CCNA2、CCNB1和CCNB2的表达(P<0.05);在蛋白水平,CCNA2、CCNB1和p34/cdc2明显被下调,p-H3S10上调,p21WAF1/CIP1被明显上调。结论:SSD可以通过上调p21WAF1/CIP1的表达诱导G2-M周期阻滞来抑制结直肠肿瘤细胞SW480的增殖。     

自噬对低氧微环境中人肺腺癌A549细胞放疗敏感性的影响

背景与目的已有的研究证明低氧可诱导肿瘤细胞自噬发生,自噬水平与肿瘤放疗敏感性相关,因而调控自噬信号通路是增强放疗敏感性极具潜力的治疗策略。本研究旨在探讨联合应用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)下调低氧环境中人肺腺癌A549细胞的自噬水平后对其放疗敏感性的影响。方法实验设低氧对照组及低氧+3-MA(自噬抑制剂)组,分别采用电镜检测自噬体变化,Western blot检测自噬标记蛋白-微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 lightchain3,LC3)蛋白表达,分析LC3II/LC3I比值变化。随后每组再给予直线加速器(0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy)照射后采用M法检测细胞增殖活性。结果与低氧对照组相比,低氧+3-MA组自噬体数量、LC3II/LC3I比值均下降。给予照射后,与低氧对照组比较,低氧+3-MA组细胞增殖活性下降。结论在低氧环境中,A549细胞保护性自噬增加,抑制自噬可增强A549细胞的放疗敏感性。     

柴胡皂苷D通过抑制EMT和细胞干性抑制人结直肠癌细胞SW480的迁移和侵袭

目的:研究柴胡皂苷D（saikosaponin-D，SSD）对人结直肠癌细胞SW480迁移和侵袭能力的影响，并初步探讨SSD抑制细胞迁移和侵袭的机制。方法:MTT检测SSD对细胞增殖的影响。划痕实验和Transwell迁移实验研究SSD对细胞迁移能力的影响。Transwell侵袭实验研究SSD对细胞侵袭能力的影响。Western-blot检测SSD对上皮间质转化（epithelial mesenchymal transformation，EMT）相关蛋白（E-cadherin、N-cadherin和Vimentin）表达的影响。克隆球形成实验研究SSD对细胞干性的影响。结果:在划痕实验和Transwell迁移实验中，SSD显著抑制SW480的迁移能力（P<0.05）。在Transwell侵袭实验中，SSD显著抑制SW480的侵袭能力（P<0.05）。SSD处理后，细胞E-cadherin的表达增高，N-cadherin和Vimentin的表达降低（P<0.05），同时SSD抑制SW480细胞克隆球的形成（P<0.05）。结论:柴胡皂苷D通过抑制EMT和细胞干性抑制人结直肠癌细胞SW480的迁移和侵袭。     

石蒜碱通过TGF-β/Smad 信号通路调控自噬抑制食管癌细胞增殖

目的:探讨石蒜碱对食管癌细胞增殖的影响,并分析其机制。方法:细胞计数8（CCK-8）法分析细胞增殖抑制率,MDC染色法检测自噬泡,Western blot法分析LC3II/LC3I、Beclin-1、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、p-Smad2/Smad2水平,观察3-MA对石蒜碱调控自噬和凋亡的影响。裸鼠成瘤实验验证石蒜碱对裸鼠体内瘤体的瘤重、瘤体积及自噬、p-Smad2/Smad2水平的影响。结果:2、4、8、16、32、64 μmol/L的石蒜碱抑制ECA109细胞增殖（F=22.412,P＜0.05）,IC50值为（15.56±2.16）μmol/L。4、8、16 μmol/L石蒜碱促进自噬泡的产生,增加LC3II/LC3I、Beclin-1水平,降低TGF-β1、p-Smad2/Smad2水平（P＜0.05）;3-MA可以逆转石蒜碱对自噬、凋亡及TGF-β/Smad信号通路和Bcl-2/Bax信号通路的影响;体内实验显示,100 mg/kg石蒜碱能降低瘤体体积、瘤体质量,下调p-Smad2/Smad2水平,上调LC3II/LC3I水平（P＜0.05）。3-MA可以逆转石蒜碱对瘤体体积、瘤体质量及LC3II/LC3I、p-Smad2/Smad2水平的影响。结论:石蒜碱能抑制ECA109细胞的增殖,促进细胞凋亡,对体内ECA109细胞移植瘤抑瘤效果明显,其机制与调控TGF-β/Smad信号通路激活自噬有关。     

VEGFR-TKIs药物诱导角质形成细胞自噬与角化过度的机制研究

目的:探讨血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（vascular epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors,VEGFR-TKIs）诱导角质形成细胞自噬与角化过度的机制,从而初步探索该药物诱导手足皮肤反应（hand foot skin reaction,HFSR）的机制。方法:利用不同浓度的VEGFR-TKIs代表药物索拉非尼和阿帕替尼分别干预人角质形成细胞株HaCaT及肝癌细胞株HepG2,MTT法检测两种药物对HaCaT及肿瘤细胞增殖的影响。利用自噬抑制剂3-MA预处理HaCaT后,再联合索拉非尼或阿帕替尼干预细胞,流式细胞术检测各组药物对HaCaT细胞周期的影响。Western-blot法检测自噬相关Beclin 1、LC3-I/II和角蛋白K1、K10的表达变化。结果:MTT结果显示,0.1～0.4 μmol/L的索拉非尼和0.1～0.3 μmol/L阿帕替尼对HaCaT细胞均有显著的增殖促进作用,但该浓度对肝癌细胞株HepG2却表现为增殖抑制。流式细胞术检测发现索拉非尼和阿帕替尼可诱导更多HaCaT细胞进入增殖期,但联合自噬抑制剂3-MA后,增殖期细胞显著减少。Western-blot结果发现,索拉非尼和阿帕替尼均能增加HaCaT细胞中自噬相关蛋白Beclin 1、LC3-II、K1和K10的表达,而联合3-MA后,Beclin 1、LC3-II、K1、K10表达水平较单用索拉非尼或阿帕替尼显著降低。结论:索拉非尼、阿帕替尼等VEGFR-TKIs药物诱导的HFSR的发病过程与细胞自噬相关,自噬可作为防治HFSR的潜在靶点。     

20（S）-人参皂苷Rg3对肝癌细胞自噬介导的索拉非尼敏感性的影响

目的 探索中药单体20（S）-人参皂苷Rg3（Rg3）对肝癌细胞自噬介导的索拉非尼药物敏感性的影响。方法 以人肝癌细胞株Hep3B为观察对象,分别接受Rg3、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）、索拉非尼、Rg3+索拉非尼和3-MA+索拉非尼处理,采用MTT法检测Hep3B细胞对Rg3、索拉非尼及3 MA的敏感性,CCK-8法检测Rg3、3-MA分别联合索拉非尼后对Hep3B细胞的增殖抑制作用,q值判断联合用药效果;LC3 Conversion实验及LC3 Turnover实验检测Rg3和索拉非尼对Hep3B细胞自噬的影响,Western blotting检测Rg3和索拉非尼对自噬相关蛋白Beclin1、LC3-Ⅰ／LC3-Ⅱ、p62水平的影响。结果 MTT检测显示,3种药物对Hep3B细胞的增殖抑制作用呈剂量和时间依赖性。CCK-8检测显示,低、中浓度（0.5、1 μg／ml）索拉非尼联合Rg3或3 MA对Hep3B细胞抑制作用均增强（P均＜0.01）,表现为协同作用;高浓度（2 μg／ml）索拉非尼联合Rg3亦呈抑制增强作用（P＜0.05）,但联合3-MA的差异无统计学意义（P＞0.05）,高浓度索拉非尼与两药联合后均表现为相加作用。LC3 Conversion实验显示,随着药物作用时间的延长,Rg3及索拉非尼均使LC3-Ⅱ蛋白水平逐渐升高;LC3 Turnover实验显示,索拉非尼联合溶酶体抑制剂氯喹（CQ）后,LC3-Ⅱ蛋白水平明显升高（P＜0.01）,而Rg3联合CQ前后则无明显差异（P＞0.05）。Western blotting检测显示,与对照组相比,Rg3、索拉非尼均可使Beclin1蛋白表达升高（P＜0.01）,索拉非尼联合3-MA后Beclin1水平明显降低（P＜0.01）,而联合Rg3后下降不明显（P＞0.5）。三药均可使LC3-Ⅱ水平升高（P＜0.05）,索拉非尼联合Rg3后LC3-Ⅱ水平高于索拉非尼单药（P＜0.01）,而联合3-MA后LC3-Ⅱ水平无明显变化（P＞0.05）。3-MA、索拉非尼作用后,p62蛋白水平明显低于对照组（P＜0.05）,索拉非尼联合Rg3后p62水平明显升高（P＜0.01）,联合3-MA后水平明显降低（P＜0.01）。结论 索拉非尼可通过增加Beclin1的表达诱导肝癌细胞自噬导致药物敏感性下降,Rg3可增加索拉非尼的敏感性,其机制可能是通过抑制自噬降解从而抑制肝癌自噬活性来实现的。     

3-甲基腺嘌呤对蛋白酶体抑制剂MG132抗卵巢癌A2870细胞作用的影响

目的:研究PI3K通路自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)对蛋白酶体抑制剂MG132抗卵巢癌A2870细胞作用的影响。方法:不同浓度MG132处理A2870细胞后,MTT法及Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞的生存率及凋亡改变,吖啶橙(AO)染色和Western-Blot法检测酸性自噬泡的形成及自噬特异性蛋白LC3的变化。3-MA联合MG132处理A2870细胞,MTT法检测细胞的生存率,AO染色和Western blot法检测自噬的改变。结果:MG132可诱导A2870卵巢癌细胞发生增殖抑制及凋亡,同时,酸性自噬泡形成及LC3-I向LC3-Ⅱ的转化增强。而3-MA联合MG132明显降低A2870细胞的生存率,但不改变MG132诱导的A2870细胞的自噬水平。结论:3-MA对MG132抗A2870卵巢癌细胞的增强作用与自噬无关。MG132诱导A2870细胞发生的自噬与PI3K通路无关。     

自噬对人肺腺癌细胞放疗敏感性的影响

目的 探讨自噬对人肺腺癌细胞放疗敏感性的影响。 方法 采用透射电镜和荧光显微镜检测亲本人肺腺癌细胞SPC-A1和耐药细胞SPC-A1／DTX放疗前后的自噬活性。应用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）预处理经射线照射后的细胞,应用Western blotting检测自噬相关蛋白标志物LC3、p62和Beclin-1蛋白表达的变化,流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期分布变化。四甲基偶氮唑盐和克隆形成实验分别检测抑制自噬后细胞生存和增殖能力的改变情况。 结果 化疗耐药的人肺腺癌耐多西他赛细胞SPC-A1／DTX比亲本细胞更耐受放疗,接受相同放疗剂量后增殖能力更强;前者较后者自噬小体较多、带绿色荧光蛋白标签的LC3荧光密度明显增多,自噬相关蛋白标志物表达更加明显（P＜0.05）。放射线同时可引起两种细胞株自噬水平的增高。自噬抑制剂3-MA预先处理耐药细胞并接受放疗后,可显著抑制自噬标志物LC3和Beclin-1,上调p62表达（P＜0.05）,并降低SPC-A1／DTX细胞的生存和增殖能力,放射敏感的G2／M期细胞比例和凋亡率增加,差异均有统计学意义（P＜0.05）。 结论 自噬为SPC-A1／DTX细胞耐受放射治疗提供了一个自我保护的机制。自噬能够增强人肺腺癌耐多西他赛细胞的放疗抵抗,而抑制自噬有可能是逆转人肺腺癌细胞放、化疗耐受的一个策略。     

马鞭草总黄酮通过AKT/mTOR信号通路调控自噬抑制肝癌细胞增殖

目的:分析马鞭草总黄酮(total flavonoids of verbena officinalis L.,TFV)对肝癌细胞自噬和增殖的影响,并探讨其机制。方法:MDC染色法检测自噬泡水平,Western印迹检测自噬相关蛋白水平,运用3-甲基腺嘌呤(3-MA)、雷帕霉素(RAPA)研究TFV对自噬、细胞增殖的影响,MTT法检测细胞存活率。裸鼠成瘤实验验证TFV对裸鼠体内瘤体的瘤重、瘤体积及自噬相关蛋白水平的影响。结果:TFV能增加HepG2、Huh-7细胞中MDC染色标记的荧光颗粒,并伴随浓度的上调明显增加,促进HepG2、Huh-7细胞中自噬蛋白Beclin-1、LC3 II/LC3 I水平表达,降低p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR水平(P<0.05)。与TFV组比较,TFV+3-MA组抑制率、LC3 II/LC3 I明显降低,p-mTOR/mTOR明显增加(P<0.05);与TFV组比较,TFV+RAPA组抑制率、LC3 II/LC3 I明显增加,p-mTOR/mTOR明显降低(P<0.05);与TFV组比较,TFV+3-MA组裸鼠瘤体LC3 II/...     

miR-18a对胶质瘤细胞增殖和自噬的影响

目的:探讨miR-18a在神经胶质瘤细胞增殖和自噬中的作用。方法:采用瞬时转染的方法将miR-18a inhibitor及其阴性对照(negative control inhibitor,NC inhibitor)分别转染大鼠C6胶质瘤细胞;实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测miR-18a在C6胶质瘤细胞中的表达;CCK-8法检测转染miR-18a inhibitor后C6细胞的增殖活性;mCherry-EGFP-LC3B质粒瞬时转染各组细胞,以动态监测自噬通量;Western blot检测敲低miR-18a后C6细胞中自噬相关蛋白LC3、p62、Beclin1的表达情况;RT-qPCR检测转染miR-18a抑制剂后C6细胞中自噬相关基因Beclin1和LC3B的相对表达水平。结果:RT-qPCR结果显示,与NC inhibitor组相比,miR-18a inhibitor组的miR-18a表达量显著降低（P＜0.05）。敲低miR-18a后显著抑制C6胶质瘤细胞的增殖（P＜0.05）。倒置荧光显微镜下观察到抑制miR-18a后可阻断自噬流,抑制自噬小体和溶酶体融合。抑制miR-18a可使胶质瘤细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin1蛋白的相对表达量显著降低（P＜0.05）,p62蛋白的相对表达量明显升高（P＜0.05）。敲低miR-18a后能抑制胶质瘤细胞中的Beclin1和LC3B mRNA表达（P＜0.05）。结论:miR-18a下调可抑制胶质瘤细胞的增殖和自噬。     

Prucalopride通过促进自噬抑制胶质瘤细胞U251增殖

目的:研究Prucalopride对胶质瘤U251细胞增殖、自噬、凋亡的影响,并探讨其相关信号通路。方法:通过CCK8检测细胞增殖的变化;Transwell检测迁移和侵袭的变化;细胞流式实验、Western blot检测细胞凋亡的变化;Western blot检测自噬相关蛋白LC3、Beclin1、p62的表达;AKT/mTOR通路相关蛋白的变化。结果:CCK8显示Prucalopride显著抑制U251细胞的增殖（P＜0.05）;Transwell侵袭实验显示Prucalopride可以抑制脑胶质瘤细胞的迁移和侵袭（P＜0.05）;细胞流式实验显示Prucalopride促进U251细胞的凋亡（P＜0.05）,Prucalopride处理后细胞凋亡相关蛋白Bax、Active Caspase3水平升高,Bcl-2表达降低;自噬相关蛋LC3、Beclin1表达上调,p62表达下调;p-AKT蛋白和p-mTOR蛋白水平显著降低。结论:Prucalopride通过抑制AKT/mTOR信号通路激活自噬抑制U251细胞增殖和迁移,促进其凋亡。