PEG介导高山红景天原生质体融合获同源四倍体研究

目的:获得高山红景天同源四倍体新材料。方法:用高山红景天愈伤组织原生质体为材料,进行了40%PEG6000介导的原生质体融合,对融合后原生质体进行了低密度、低融点琼脂包埋培养。按原生质体大小对融合原生质体进行了活体标记,建立了起源于单个原生质体的单细胞姊妹系,获得同源四倍体材料。结果:新生子细胞、中期细胞及其原生质体的直径RD与RM均与公式RD=0.793 7RM大致相符。未融合的二倍体、两原生质体融合产物直径的变化范围分别为16.7μm≤R21.3μm,21.0μm≤R′26.8μm,两者直径范围存在部分重叠。融合原生质体培养时,接种密度以1×104个/mL为宜,在此密度条件下植板率为20.3%,单细胞起源的姊妹系微克隆生长迅速,易于进行标记、彼此分离并继续培养;染色体计数的结果表明,二倍体、四倍体单细胞姊妹系再生植株染色体数目分别为26,52,不同节位叶片经流式细胞仪检测了DNA含量,证实没有嵌合体的存在。结论:本研究为高山红景天多倍体育种提供了科学依据。     

铁皮石斛与绞股蓝原生质体融合的初步研究

目的 探索铁皮石斛与绞股蓝原生质体杂交融合，为中药材的改良提供新途径。方法两种原生质体通过PEG法进行成对融合，融合子培养在添加BA 2mg／L及NAA 1mg／L改良的MS液体培养基中。结果分离得到了高产量、活力强、纯度高的铁皮石斛及绞股蓝叶肉原生质体。结论融合获得了有活力的杂种细胞，培养3d后，杂种细胞开始分裂，共进行了3次分裂。     

探析原生质体融合技术在微生物菌种选育中的运用

文章以原生质体融合技术为研究对象,从原生质体融合技术的一般步骤,能够对原生质体融合及分离动作产生影响的因素分析入手,结合原生质体融合技术与微生物菌种选育的共性特征,对其在微生物菌种选育中的四方面应用问题（①.菌种遗传特性的改良;②.菌种发酵特性的优化;③.菌种质粒的有效转移;）进行了较为详细的分析与阐述,并据此论证了将原生质体融合技术合理运用于微生物菌种选育工作在进一步提高微生物菌种选育工作质量与工作效率的过程中所起到的至关重要的作用与意义.     

茯苓原生质体融合种栽培试验初报

首次报道用原生质体融合技术对茯苓作生物工程育种，取得融合菌种，在空徽霍山县境内进行野外栽培试验的结果．亲本P1、p578经茯苓菌丝体原生质体分离、融合、标记和融合子检出、培养和鉴定等步骤后，制成栽培种F1、与P1、P578同时进行了对比栽培。试验结果：P1均产为0．5kg／窖，P578为2．20kg／窖；F1为1．73kg／窖；F1产量介于2个亲本之间，产量不够理想，对其原因作了初步分析。     

细胞融合构建红景天苷高转化菌株及固态发酵工艺优化

目的 构建红景天苷高转化菌株,并对红景天的固态发酵工艺进行优化.方法 以黑曲霉菌株H35和H42为出发菌株,将双亲株的原生质体分别进行紫外和热灭活后进行原生质体融合,通过重氮盐比色法初筛和HPLC复筛得到一融合菌株(Rc14);并运用"复杂定向调控技术"对红景天固态发酵工艺进行优化.结果 在最佳固态发酵工艺条件下,Rc14发酵后红景天苷含量比发酵前提高140%,酪醇含量提高277%,总有效成分含量增加了176%.结论 利用融合菌株Rc14固态发酵红景天的工艺在红景天的工业生产中具有很高的应用价值.     

根癌农杆菌对云南红豆杉原生质体的转化

本文介绍了根癌农杆菌T—DNA对云南红豆杉原生质体的转化，分析了转化系的紫杉醇合成能力。实验以生长20d的云南红豆杉幼茎诱导的淡黄色愈伤组织为材料，经酶解可分离出大量有活力的原生质体。在由B5无机盐、KM有机成分、3．0mg／L2，4-D、0．1mg／LKT和0．45mol／L果糖组成的培养基中培养1周后，原生质体再生细胞持续分裂形成细胞团。根癌农杆菌对原生质体的转化能力与原生质体生长状态及菌株相关。虽然刚分离的或已再生细胞壁的原生质体不能被根癌农杆菌转化，但由10个以上细胞组成的原生质体克隆和根癌农杆菌B6S3菌株共培养后可实现T—DNA转化，高压纸电泳检测转化系具有冠瘿碱的合成，转化率约为5％。HPLC证实转化系具有合成紫杉醇的能力，但不同转化系中紫杉醇含量变异很大，最高含量为0．076％，是对照愈伤组织的6倍，表明T—DNA的插入改变了培养细胞对紫杉醇的合成。获得的高产转化系细胞生长比对照低，但继代培养中其生长和紫杉醇积累基本保持稳定。尽管转化系合成紫杉醇能力远未达到商业化生产的要求，但研究通过T—DNA对原生质体的转化而实现插入诱变，可以为分离高产紫杉醇优良细胞系提供单细胞筛选系统。     

根癌农杆菌对云南红豆杉原生质体的转化

本文介绍了根癌农杆菌T-DNA对云南红豆杉原生质体的转化,分析了转化系的紫杉醇合成能力。实验以生长20 d的云南红豆杉幼茎诱导的淡黄色愈伤组织为材料,经酶解可分离出大量有活力的原生质体。在由B5无机盐、KM有机成分、3.0 mg/L 2,4-D、0.1mg/L KT和0.45 mol/L果糖组成的培养基中培养1周后,原生质体再生细胞持续分裂形成细胞团。根癌农杆菌对原生质体的转化能力与原生质体生长状态及菌株相关。虽然刚分离的或已再生细胞壁的原生质体不能被根癌农杆菌转化,但由10个以上细胞组成的原生质体克隆和根癌农杆菌B6S3菌株共培养后可实现T-DNA转化,高压纸电泳检测转化系具有冠瘿碱的合成,转化率约为5％。HPLC证实转化系具有合成紫杉醇的能力,但不同转化系中紫杉醇含量变异很大,最高含量为0.076％,是对照愈伤组织的6倍,表明T-DNA的插入改变了培养细胞对紫杉醇的合成。获得的高产转化系细胞生长比对照低,但继代培养中其生长和紫杉醇积累基本保持稳定。尽管转化系合成紫杉醇能力远未达到商业化生产的要求,但研究通过T-DNA对原生质体的转化而实现插入诱变,可以为分离高产紫杉醇优良细胞系提供单细胞筛选系统。     

用东北红豆杉培养细胞的原生质体高效生产紫杉醇

作者首次测定了从东北红豆杉 Taxuscuspidata 培养细胞中大量分离有活力的原生质体的适宜条件,通过原生质体的分离培养,定量分析了细胞中紫杉醇的分布,并评价了用原生质体生产紫杉醇的潜力。从该植物种子诱生培养细胞,使用的WP 培养液含2mg/L α-萘乙酸(NAA)、20g/L 葡萄糖,固体培养基除含上述成分外增加200mg/L 琼脂糖凝胶。液、固培养基的传     

枯草芽孢杆菌的基因组重排初步研究

目的:获得产高活性豆豉溶栓酶的枯草芽孢杆菌突变株.方法:用紫外诱变得到突变株,观察诱变效应,筛选透明圈直径与菌落直径比值大(HC值)的突变株,进行原生质体融合,筛选酶活高的菌株.结果:紫外诱变得到2株HC比值大的菌落;当溶菌酶为100 mg·L~(-1),处理时间为45 min进行原生质体融合时,效果最好;当PEG为40%时,原生质体融合率最大;最后筛选出酶活可达2 013 U·mL~(-1)的突变株.结论:通过紫外诱变和原生质体融合,得到高活力的菌株.     

高山红景天叶肉原生质体分离培养与植株再生

目的 利用高山红景天组培苗叶片分离得到原生质体,经培养后获得再生植株.方法 研究了外植体前期预处理、外植体大小、酶液配比、酶液中甘露醇浓度等影响原生质分离的相关因素,确定最优分离条件.结果 用于原生质体分离的外植体无需黑暗预培养便可进行原生质体分离,外植体叶片长度大于1.5 cm为宜.获得原生质体的酶液组成为:1.0%纤维素酶Onzuka R-10+0.5%果胶酶Macerozyme R-10+10 mmol/L CaCl2·2H2O+0.1%MES+0.7 mmol/L KH2PO4+0.5 mol/L甘露醇,在25℃条件下酶解4 h,原生质体最高产量为39.43×106个/g鲜质量.原生质体活力为78.6%.原生质体培养基为1/2MS+1 mg/L 2,4-D+0.5 mg/LZT+0.5 mol/L甘露醇+500 mg/L水解酪蛋白.浅层培养40 d时形成小愈伤组织.愈伤组织在MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA诱导产生不定芽,不定芽转入1/2MS基本培养基可获完整再生植株.结论 本研究为高山红景天多倍体育种提供了科学依据.     

中草药植物细胞工程研究进展

简要介绍了植物细胞工程各主要分支学科在中草药研究中的应用及其进展情况。包括原生质体培养、单倍体育种、植物体细胞的种质保存、中草植物细胞培养生产次生产物、植物快速繁殖技术、体细胞胚胎发生和人工种子等。     

天麻伴生菌——紫褐小菇原生质体遗传转化体系的构建北大核心CSCD

萌发菌是天麻伴生菌,促进天麻种子的萌发,萌发菌促进天麻种子的互作机制的解析对天麻的有性繁殖技术创新有着至关重要的作用,但是萌发菌遗传转化技术体系的缺乏限制了两者互作机制的解析。该文从原生质体酶解体系、抗性标记筛选、再生培养基筛选、瞬时转化进行等方面分析,建立萌发菌的原生质体遗传转化体系。萌发菌菌丝在复合酶酶解8 h和4 000 r·min^(-1)离心沉淀,原生质体的质量和数量较好;萌发菌最佳再生培养基为RMV培养基;以50 mg·mL^(-1)潮霉素为最佳抗性筛选标记;载体pLH-HygB-HuSHXG-GFP-HdSHXG转化进入萌发菌原生质体且GFP基因成功表达。萌发菌原生质体转化体系成果构建,为萌发菌功能基因研究奠定了基础,进而为萌发菌与天麻种子共生萌发的分子机制研究提供技术支撑。     

破布木果基因组DNA不同提取方法比较研究

目的采用不同方法对维药破布木果基因组DNA进行提取,为破布木果基因组DNA的研究提供参考。方法采用改良CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)法和改良SDS(十二烷基磺酸钠)法提取破布木果基因组DNA,并采用分光光度法和琼脂糖凝胶电泳技术检测提取DNA的纯度和浓度。结果分光光度法检测结果表明,用改良CTAB法提取的基因组DNA纯度优于改良SDS法,无蛋白质和RNA污染。琼脂糖凝胶电泳结果表明,2种方法提取得到的基因组DNA电泳图谱均有明显的主带出现,但改良SDS法提取的基因组DNA降解较多。结论改良CTAB法可以提取相对较高质量的破布木果基因组DNA。     

桑黄菌原生质体的分离与再生研究

目的：研究桑黄菌原生质体分离与再生的条件。方法：研究以菌丝体为材料的不同酶解条件对桑黄菌原生质体产量的影响及不同再生条件对桑黄菌原生质体再生率的影响。结果：在1.5%溶壁酶＋0.5%崩溃酶的混合酶系、酶解温度为30 ℃、菌龄为8 d、蔗糖为酶解渗透压稳定剂、酶解时间为3 h的条件下,桑黄菌原生质体分离产量较高,但兼顾菌丝量和原生质体的再生,较适宜的菌龄为10 d,较适宜的酶解渗透压稳定剂是甘露醇。另外用甘露醇作为培养基渗透压稳定剂、用加桑枝的马铃薯葡萄糖再生培养基进行再生,桑黄菌原生质体再生率较高。结论：在综合考虑桑黄菌原生质体的产量与再生的前提下,获得了使桑黄菌原生质体产量与再生率均较高的试验条件。     

3种瞬时表达体系研究1个白木香倍半萜合酶的亚细胞定位

目的 研究1个白木香倍半萜合酶（ASS）的亚细胞定位,确定其功能区域,并比较3种瞬时表达体系在亚细胞定位研究中的优劣。方法 从白木香愈伤组织中提取总RNA,采用特异引物RT-PCR方法克隆倍半萜合酶ASS基因,并连接于pEZS-NL载体和pFGC5941GFP改造载体上,分别构建pFGC5941-GFP-ASS、pEZS-NL-ASS-GFP 2种植物表达载体,分别利用根癌农杆菌侵染烟草叶片、基因枪轰击洋葱表皮细胞、PEG转化白木香原生质体3种技术进行瞬时转化表达,激光共聚焦显微镜下观察表达出的绿色荧光蛋白（GFP）融合蛋白的亚细胞定位。结果 在烟草叶片表皮细胞、洋葱表皮细胞及白木香原生质体中,融合蛋白绿色荧光均能被观察到。ASS基因与GFP的融合蛋白产物在烟草叶片中定位于胞质,在洋葱表皮中定位于胞质和细胞核,白木香原生质体中定位于胞质和质体。结论 ASS基因在白木香原生质体胞质及质体定位;对3种体系的结果比较表明,应用不同体系研究蛋白的亚细胞定位可能出现不同的结果,这可能与同源或异源表达的植物细胞的特性有关。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外培养

[目的]通过实验探索并验证行之有效的体外骨髓间充质干细胞分离、纯化、培养的方法。[方法]采用密度梯度离心法和贴壁培养法相结合的方法对骨髓间充质干细胞进行体外培养。[结果]原代细胞10d左右达85%以上融合,传代后细胞约1周左右达85%以上融合;传至5代细胞形态呈较一致的长梭形。[结论]运用贴壁培养法和密度梯度离心法相结合的方法对骨髓间充质干细胞进行体外培养,可获得足够数量纯度较高的骨髓间充质干细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外培养

[目的]通过实验探索并验证行之有效的体外骨髓间充质干细胞分离、纯化、培养的方法。[方法]采用密度梯度离心法和贴壁培养法相结合的方法对骨髓间充质干细胞进行体外培养。[结果]原代细胞10d左右达85%以上融合,传代后细胞约1周左右达85%以上融合;传至5代细胞形态呈较一致的长梭形。[结论]运用贴壁培养法和密度梯度离心法相结合的方法对骨髓间充质干细胞进行体外培养,可获得足够数量纯度较高的骨髓间充质干细胞。     

单细胞测序技术与中医药前沿研究

单细胞测序技术是在单个细胞水平上，对基因组、转录组、表观组进行高通量测序的新技术，能够揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态，是研究细胞异质性的有力工具。近十年来涌现出大量基于这项技术的生物细胞异质性研究，应用于肿瘤学、胚胎发育、神经生物学、免疫学等多个研究领域。在中医药领域科研中刚开始崭露头角，已经有利用单细胞测序进行中医方剂、中药作用机制等的科学研究。通过介绍单细胞测序技术概况以及现阶段在医学领域研究中的应用，论述单细胞测序在中医学研究中的可应用方向，拓展中医研究思路和方法，为探索中医药的现代化研究提供了新的支撑，大大加快传统中医药与现代生命科学技术的结合。     

羽扇豆育种中组织培养技术的应用

由于不亲合性,故至今为止,常规羽扇豆育种只限于种内杂交,所以,羽扇豆育种者对两种体外技术特别感兴趣,即:种间杂种胚的营救及原生质体融合,因为羽扇豆在组织培养中仍属于没有驯服的种,所以,这些方法的应用仍未脱离实验室水平。胚的营救必须当一个胚完全形成的情况下才有可能。例如:在L.mutablilis×L.hartwegin杂交中产生胚,而这些胚停留在球状体后期。在这些败育的胚中有一些能进行离体培养,条件是它们离开母体植株的     

韩国赤芝全基因组重测序分析

目的：探索韩国赤芝与中国赤芝CGMCC5.0026间在基因组水平上存在的差异,为赤芝的遗传育种提供研究基础。方法：采用高通量重测序技术,对韩国赤芝进行全基因组重测序,并对单核苷酸多态位点突变（SNP）、小片段插入缺失变异（InDel）、结构变异（SV）进行检测和注释。对DNA水平变异基因进行KEGG、GO、COG、NR、SwissProt数据库注释。结果：韩国赤芝重测序覆盖深度为44 ×,与中国赤芝CGMCC5.0026相比,共发现10607个基因发生非同义SNP,4774个InDel和1428个SV,共导致9469个基因发生变异。这些变异基因中有转录因子86个,细胞色素P450 195个。结论：本研究通过对中国赤芝和韩国赤芝基因组序列进行比较,为赤芝的分子标记育种和对完善灵芝模式真菌研究体系提供了基础。