阻断辅因子NADPH合成对谷氨酸棒杆菌生长及产物合成的影响

该文通过敲除谷氨酸棒杆菌(C. glutamicum)中参与NADPH合成的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因(zwf)、苹果酸酶基因(malE),并将自身NADP~+-依赖型异柠檬酸脱氢酶基因(icd_(Cg))替换为变形链球菌(Streptococcus mutans) NAD~+-依赖型异柠檬酸脱氢酶基因(icd_(Sm)),构建重组菌株C. glutamicum LYSΔzwfΔmal EΔicd_(Cg)::icd_(Sm),并研究阻断NADPH合成途径对胞内腺嘌呤核苷酸、吡啶核苷酸、细胞生长、葡萄糖消耗速率、产物合成的影响。与出发菌C. glutamicum LYS相比,重组菌胞内NADH提高38. 58%,NADH/NAD~+提高53. 84%。而NADPH降低89. 51%,明显低于出发菌,NADPH/NADP~+降低93. 13%。摇瓶结果表明,重组菌葡萄糖代谢能力明显减弱,生长也相对缓慢,菌体量降低4. 36%。同时L-赖氨酸产量降低87. 69%,而在胞内积累了大量副产物,如丙酮酸、乳酸等。为进一步研究NADPH调控L-赖氨酸产生菌胞内微环境的生理机制提供了研究基础。     

不同辅因子NADPH水平对谷氨酸棒杆菌生长及产物合成的影响

由谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)分泌的初级代谢产物赖氨酸,其合成与胞内NADPH水平密切相关,但目前对谷氨酸棒杆菌中赖氨酸的生物合成与辅因子NADPH之间调节机制的理解仍然有限。作者以赖氨酸高产菌C. glutamicum XQ-5为出发菌株,通过阻断磷酸戊糖途径构建了低NADPH水平的重组菌C. glutamicum XQ-5Δzwf::pgi,使胞内每1万个细胞的NADPH量从3.57×10~(-8)μmol降低至1.12×10~(-8)μmol。接着通过强化磷酸戊糖途径构建了高NADPH水平的工程菌C. glutamicum XQ-5Δpgi::(zwf-gnd),使胞内每1万个细胞的NADPH量从3.57×10~(-8)μmol提高至1.80×10~(-7)μmol。通过摇瓶发酵,不同NADPH水平下菌株的菌体生长情况、菌体量和胞内副产物积累明显不同。利用转录组学和其他实验,发现重组菌C.glutamicum XQ-5Δpgi::(zwf-gnd)中的panD基因表达水平明显提高。当panD基因被敲除后,重组菌C. glutamicum XQ-5ΔpanDΔpgi::(zwf-gnd)的赖氨酸质量浓度从41 g/L提高至55 g/L,比出发菌C. glutamicum XQ-5提高了14.3%。数据表明,通过过表达磷酸戊糖途径来提高NADPH水平导致赖氨酸水平下降的原因之一,是panD基因表达水平的提高。这为进一步探究辅因子NADPH对赖氨酸生物合成的调控机制提供了坚实基础。     

在明串珠菌构建高产甘露醇的细胞工厂

甘露醇是一种具有多种功效的六糖醇,被广泛应用于医药、食品、化工和电子等行业。为构建高产甘露醇的明串珠菌,建立了将底盘细胞转化为高产目标产物菌株的理论：细胞工厂的“源-库”学说。通过2次同源重组,打破染色体中基因的操纵子和重叠基因模式,并将甘露醇外排泵蛋白(mannitol efflux pump, MEP)基因序列和再生NADH的酶(甲酸脱氢酶)基因序列定点插入到染色体上。蔗糖为90 g/L时,打破mep基因的操纵子和重叠基因模式的菌株甘露醇产量比原始菌株(CGMCC1.10327)提高了9.5%。原始菌株染色体上敲入一个拷贝mep基因序列的菌株,底物蔗糖能添加到120 g/L,甘露醇产量也达到55.18 g/L。CCTCC M2020762菌株染色体上敲入一个拷贝甲酸脱氢酶基因序列的菌株,底物蔗糖能添加到145 g/L,甘露醇产量也达到101.6 g/L。使细胞工厂具备更强的“源”能(NADH再生等)和更大的“库”容(提高MEP活性),实现目标产物的超高产。     

酿酒酵母抗氧化相关基因突变体对黄曲霉毒素B_1的清除作用

黄曲霉毒素(AF)是粮食作物和饲料原料中容易污染的一种强毒性和强致癌性物质,酿酒酵母具有毒素清除功能。利用HPLC分析了酿酒酵母野生菌BY4742及三株关键的抗氧化相关基因缺失菌zwf1Δ、sod2Δ、glr1Δ对黄曲霉毒素B1的清除能力。结果表明,在PBS缓冲液中存活和死亡的细胞对AFB1的清除率分别为74%～76%和71%～73%,说明酵母细胞对AFB1的清除以生物吸附作用为主。在培养基中,3种突变菌活细胞对AFB1的清除率发生不同程度的降低,其中glr1Δ的AFB1清除能力下降最明显,其次是sod2Δ,而zwf1Δ下降最少,说明这些关键的抗氧化基因的缺失会影响细胞在生长状态下对AFB1的清除作用。     

高产赤藓糖醇解脂亚罗酵母变异株的代谢酶和线粒体DNA变化

解脂亚罗酵母E4-2是赤藓糖醇发酵原始菌株Y-22的高产突变株,可以在350 m~3发酵罐上以96 h的发酵周期产生19.3 g/100mL的赤藓糖醇,对葡萄糖的转化率达到56%,比原始菌株提高约20%。对6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)酶及赤藓糖还原酶(ER)酶活力的测定未表现出明显的变化。对线粒体DNA的RAPD的比较分析结果表明,其线粒体DNA的结构发生了显著的变化,故推测此变化是其发酵性状改变的主要原因。     

基于尿嘧啶磷酸核糖转移酶为负向筛选标记的生酮古龙酸杆菌基因组无痕修饰系统的构建

通过构建尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因(upp)敲除打靶质粒,采用同源重组的方法获得了生酮古龙酸杆菌(Ketogulonigenium vulgare)的upp基因缺失突变株K.vulgareΔupp,可作为基因组无痕修饰系统底盘细胞的upp基因表达载体,转化突变株K.vulgareΔupp,获得upp基因回补菌株PBB-upp,并验证了upp作为负向筛选标记的可行性。实验结果表明:突变株Δupp在1 mg/m L的5-氟尿嘧啶培养基上可生长,野生型和回补菌株PBB-upp不能生长,3株菌对5-氟尿嘧啶的抗性存在显著差异,说明可以将upp基因作为负向筛选标记,与正向筛选标记相结合,在upp基因缺失的底盘细胞基础上通过两次同源重组,实现基因组的无痕修饰与改造。     

在酿酒酵母中重构棉子糖生物合成途径的基础研究

研究了在酿酒酵母中重构棉子糖生物合成途径,为后续高效生物合成棉子糖细胞工厂的构建奠定基础。敲除酿酒酵母中能降解棉子糖的蔗糖酶与α-半乳糖苷酶的基因构建出E1(Δsuc2::Δmel1);在此基础上,构建单基因表达拟南芥肌醇半乳糖合成酶基因gols1与gols3及棉子糖合成酶基因sip1与sip5的工程菌株,及构建双基因组合表达(gols1::sip1、gols1::sip5、gols3::sip1与gols3::sip5)工程菌株;比较工程菌株代谢产物如肌醇、UDP-半乳糖、肌醇半乳糖、蔗糖及棉子糖等生成情况,验证在酿酒酵母中重构棉子糖生物合成途径的可行性。研究表明,通过共表达外源肌醇半乳糖合成酶及棉子糖合成酶基因,并敲除能降解棉子糖的蔗糖酶与α-半乳糖苷酶的基因,在酿酒酵母中实现了棉子糖生物合成途径的重构;肌醇半乳糖合成酶与棉子糖合成酶基因的不同共表达组合,棉子糖生成量有差异;重构的棉子糖生物合成途经改变了酿酒酵母原始菌株的代谢流量。     

产香真菌M6-5的鉴定及其挥发性物质对库尔勒香梨果实采后黑斑病的抑制效果

通过形态学和分子生物学（ITS序列和tef1序列）鉴定产香真菌M6-5,采用平板对扣法测定不同生长时期的M6-5菌株对库尔勒香梨黑斑病菌链格孢菌（Alternaria alternata）的抑菌活性,采用顶空固相微萃取和气相色谱-串联质谱法检测分析其挥发性物质,以纯品形式验证并确定有效抑菌成分;使用干燥器分析M6-5菌株产生的挥发性物质对库尔勒香梨果实采后黑斑病的抑制效果。结果表明：菌株M6-5为猬木霉（Trichoderma erinaceum）,生长第5天的菌株M6-5产生的挥发性物质对链格孢菌的抑制率达到最大值,为（82.48±1.17）%,且持续期为20 d;从生长第5天的M6-5菌株中共检测出65 个组分,主要为6-戊基-2H-吡喃-2-酮、3-羟基丁酸乙酯、苯乙醇、2-烯丙基呋喃、棕榈酸甲酯等,分别占挥发性物质总量的40.12%、6.49%、4.38%、4.13%和3.48%。在挥发性物质纯品含量为714.28 μL/L时,6-戊基-2H-吡喃-2-酮、3-羟基丁酸乙酯和苯乙醇对链格孢菌的抑制率分别为（21.27±0.60）%、（41.43±2.36）%、（50.23±1.07）%。M6-5菌株产生的挥发性物质能够显著降低库尔勒香梨果实黑斑病的病斑直径,比对照组降低了42.46%。本研究可为库尔勒香梨采后黑斑病的防治提供一定参考。     

α-淀粉酶基因在肠膜明串珠菌基因表达中的应用

目的:为了验证α-amy(α-淀粉酶基因)在肠膜明串珠菌中应用的可行性,构建重组质粒并建立了肠膜明串珠菌的三亲杂交体系。方法:以大肠杆菌-明串珠菌的穿梭载体p CW4为基础,构建了携带α-amy标记的重组质粒p CW7。肠膜明串珠菌ATCC8293(Leuconostoc mesenteroides)的g6ph(6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因)表达盒插入到p CW7,并通过三亲杂交转化肠膜明串珠菌而获得重组菌株。结果:重组菌株的甘露醇产量比原始菌株提高了7%。三亲杂交中可以通过α-amy标记筛选重组子。结论:证实了α-amy标记在肠膜明串珠菌中应用的可行性。     

单核细胞性李斯特菌基因dal的敲除及其生物学特性初步分析

在单核细胞性李斯特菌(Listeria monocytogenes)野生株EGDe act A及inl B双基因缺失株(EGDeΔact AΔinl B)的基础上,利用同源重组的方法进一步构建了缺失营养基因dal的菌株(EGDe Δact AΔinl BΔdal),并对该缺失菌株生长状态、毒力基因表达水平、生物被膜的形成量及细胞侵袭等方面作进一步分析。结果显示,37℃摇床培养6 h后,缺失株的菌浓度显著低于EGDe Δact AΔinl B(P0.001),培养基中补充D-丙氨酸的缺失株生长速率与亲本株相比无显著差异;实时荧光定量聚合酶链式反应结果显示,缺失株的sig B基因表达水平变化最明显(P0.01),约下调90%;缺失株生物被膜形成量显著增加(P0.05),培养基补充D-丙氨酸后缺失株生物被膜的生成量与亲本株相比无差异;对Coca-2细胞的侵袭无影响,表明该基因对细菌生长能力及生物被膜形成具有重要的调控作用,并不影响菌株对细胞的侵袭力。此缺失株的构建为进一步研究基因dal的功能提供了理论支持。