PSMA基因疫苗抑瘤效应及免疫机制的实验研究

目的： 观察表达前列腺特异性膜抗原(PSMA)基因疫苗在荷瘤小鼠模型中抑瘤效应并探讨其免疫机制,为前列腺癌的预防和免疫治疗提供实验基础。方法: 将PSMA基因疫苗肌注入BALB/c小鼠体内,检测其血清中PSMA抗体水平并观察脾T细胞的增殖效应和杀细胞毒效应,以sp2/0-PSMA细胞攻击免疫后小鼠,观察小鼠的成瘤率、肿瘤大小、平均瘤重及生存率,评价PSMA基因疫苗的抑瘤效应。结果: PSMA基因疫苗可诱导实验组小鼠产生PSMA抗体,脾T细胞的增殖效应和杀细胞毒效应,在一定时间内随着免疫次数的增加和时间的延长,抗体水平、脾细胞的增殖和杀细胞毒效应均呈上升趋势。与对照组相比较,实验组小鼠成瘤率低,无瘤生存期延长,肿瘤生长缓慢。结论: PSMA基因疫苗能诱导实验组小鼠产生特异性体液及细胞免疫应答,且有明显的抑瘤效应。     

人β防御素-2与前列腺癌特异性膜抗原嵌合蛋白真核表达质粒构建及其诱导的小鼠特异性免疫应答

探索人β防御素2 (h BD- 2 )和前列腺特异性膜抗原(PSMA)共表达重组核酸疫苗针对前列腺癌的免疫治疗。研究以pc DNA3.1为载体,构建重组质粒pc DNA3.1/PSMA和pc DNA3.1/h BD- 2 - PSMA,通过RT- PCR和免疫组化检测其表达。免疫小鼠后,进行血清中抗体检测,CD4 、CD8 T淋巴细胞数目测定及CTL 特异性杀伤作用检测。结果显示构建的质粒转染COS- 7细胞后能表达目的基因,免疫小鼠后能在体内持久表达,可以诱导产生特异性抗体,能有效的刺激T细胞增生,诱导特异性CTL 反应。当以h BD- 2作为免疫佐剂时,CTL 活性更强。本研究成功的构建了含PSMA的表达质粒,免疫小鼠可以诱导出有效的体液和细胞免疫,为前列腺癌的免疫治疗奠定了一定的实验基础     

TH细胞在记忆性CTL介导的肿瘤抑制中的作用研究

目的 观察记忆性CTL的抑瘤作用是否需要抗原特异性TH细胞的辅助。方法 表达OVAT细胞表位SIINFEKL特异性TCR的T细胞转输RAG^-l-小鼠，经相应T细胞表位多肽刺激后产生记忆性CTL，将此记忆性CTL转输已产生特异性和非特异性TH细胞的C57BL／6小鼠体内并接种肿瘤细胞EG7。结果 经T细胞表位多肽免疫后，SIINFEKL特异性TCR T细胞成功在RAG^-l-小鼠体内增殖并分化为记忆性CTL；抗原特异性TH细胞可辅助产生较多效应性CTL但并没有完全的肿瘤抑制作用；记忆性CTL的完全抑瘤活性需要抗原特异性TH细胞的辅助。结论机体对肿瘤的长期完全杀伤作用不但需要肿瘤特异性抗原诱导产生的记忆性CTL，而且需要特异性TH细胞的辅助，肿瘤疫苗的设计必须包括特异性的CTL表位多肽和辅助性TH细胞多肽。     

表达CRT-E2融合蛋白肿瘤疫苗诱导特异性抗肿瘤免疫应答

目的:探讨表达钙网蛋白(Calreticulin,CRT)和HPV E2融合蛋白的肿瘤疫苗在小鼠体内诱导的抗肿瘤免疫应答.方法:转染重组质粒得到高表达CRT、E2和CRT-E2融合蛋白的肿瘤细胞,作为肿瘤疫苗隔周两次腹腔注射免疫小鼠,17天后观察成瘤率,检测NK细胞杀伤活性、特异性T细胞增殖能力、CIL活性以及睥淋巴细胞分泌IFN-γ水平,并观察荷瘤小鼠生存期.结果:高表达CRT-E2融合蛋白肿瘤疫苗免疫小鼠后,其成瘤率明显低于其他实验组,NK细胞杀伤活性、特异性T细胞增殖能力、CTL活性和脾淋巴细胞分泌IFN-γ水平均显著高于其它实验组(P＜0.01),生存期也明显延长(P＜0.01).结论:小鼠体内实验显示,表达CRT-E2融合蛋白肿瘤疫苗能够诱导特异性CD8+T细胞免疫应答和NK细胞活性,显著抑制了肿瘤生长.     

人β防御素-2与前列腺癌特异性膜抗原嵌合蛋白真核表达质粒构建及其诱导的小鼠特异性免疫应答

探索人β防御素2(hBF)-2)和前列腺特异性膜抗原(PSMA)共表达重组核酸疫苗对前列腺癌的免疫治疗。研究以pcDNA3．1为载体,构建重组质粒pcDNA3．1／PSMA和pcDNA3．1／hBD-2-PSMA．通过RT-PCR和免疫组化检测其表达。并免疫小鼠,进行血清中抗体检测．CD4^ 、CD8^ T淋巴细胞数目测定及CTL特异性杀伤作用检测。结果显示构建的质粒转染COS-7细胞后能表达目的基因,     

pcDNA3.1+/MAGE-3 DNA疫苗诱导特异性抗肿瘤免疫应答的实验研究

目的：构建pcDNA3.1+/MAGE-3 DNA疫苗，观察其在小鼠体内诱导特异性抗肿瘤免疫应答的能力。方法： 通过RT-PCR构建重组表达质粒pcDNA3.1+/MAGE-3；以pcDNA3.1+/MAGE-3 DNA疫苗免疫已接种肿瘤细胞的小鼠，每10 d重复免疫1次，共3次，以pcDNA3.1+、PBS为对照。末次免疫后5 d检测血清中MAGE-3抗体滴度、小鼠脾淋巴细胞的细胞毒T细胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）杀伤活性、细胞因子IL-2和IFN-γ的浓度，同时计算抑瘤率。结果： 成功构建了pcDNA3.1+/MAGE-3 DNA疫苗，用此疫苗免疫已接种B16/MAGE-3细胞的小鼠后，能诱导小鼠脾淋巴细胞MAGE-3特异性的杀伤活性，脾细胞培养上清中细胞因子IL-2和IFN-γ的浓度明显增高，血清中抗MAGE-3抗体在1∶20滴度时阳性，肿瘤生长被显著抑制，与pcDNA3.1+组、PBS组相比，差异显著（P＜0.01）。结论： 成功构建了pcDNA3.1+/MAGE-3 DNA疫苗，该疫苗在小鼠体内既能激活CTL杀伤活性和CD4+ T细胞活性，又能激活体液免疫反应，从而诱导出特异性的抗肿瘤免疫应答。     

肠癌RNA转染小鼠骨髓来源单核细胞的抗肿瘤效应

目的 :以提取的CT 2 6小鼠结肠癌细胞RNA作为抗原物质 ,体外转染骨髓来源的单核细胞 ,回输小鼠体内 ,观察其抗肿瘤效应 ;同时平行比较传统肿瘤冻融抗原体外冲击单核细胞的抗肿瘤效应。方法 :小鼠骨髓细胞体外以GM CSF诱导培养获取单核细胞 ,流式细胞仪检测纯度 ;Trizol法提取获得CT 2 6细胞总RNA ,应用TransMessenger体外转染单核细胞 ,对照组单核细胞以肿瘤冻融抗原冲击 ;LDH释放法检测小鼠体内CTL杀伤活性 ,观察各组小鼠成瘤情况及生存期。结果 :小鼠骨髓细胞经诱导培养后 ,获得大量高纯度的单核细胞 ,流式细胞仪检测CD11b >95 % ;提取的CT 2 6细胞总RNA体外经Trans Messenger介导转染单核细胞后 ,回输小鼠 ,可以诱导体内生成高水平的特异性细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)活性 ,使小鼠获得抵抗后继CT2 6细胞攻击的免疫保护能力 ,并显著高于肿瘤冻融抗原冲击的单核细胞回输组。结论 :抗原提呈细胞经肿瘤总RNA转染后 ,可以诱导机体产生CTL ,有效地诱发特异性抗肿瘤免疫功能     

Flt3L及CCL5对prime/boost免疫策略中抗原特异性免疫应答的增强及抗肿瘤作用

目的:研究Flt3L与CCL5作为联合佐剂在prime/boost免疫策略中对HBc抗原特异性免疫应答的增强及抗肿瘤作用.方法:将两种细胞因子质粒与携带HBc抗原的DNA疫苗经肌内注射法共免疫小鼠, 免疫3次后再用原核表达的HBc颗粒蛋白或HBc DNA疫苗加强, 观察对稳定表达HBcAg 的小鼠黑色素瘤细胞(B16-HBc)的生长抑制作用;并分别采用MTT法检测荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖、流式细胞术检测脾CD8 T淋巴细胞中IFN-γ表达、ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清IL-2、IL-4含量及乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测特异性CTL杀伤活性.结果:与对照组相比, 佐剂联合DNA疫苗免疫经蛋白加强组(DDP/Adj)显著抑制肿瘤生长;佐剂联合DNA疫苗免疫组(DDD/Adj)及DDP/Adj组均可促进特异性淋巴细胞增殖反应(P＜0.05), 且DDP/Adj 高于DDD/Adj组(P＜0.05);DDD/Adj 及DDP/Adj组小鼠脾脏CD8 T淋巴细胞中IFN-γ表达、IL-2 表达水平及CTL杀靶活性均高于对照组(P＜0.01或P＜0.05), IL-4 表达水平在各组无显著区别(P＞0.05).结论:在prime/boost免疫策略中, 采用Flt3L与CCL5两种细胞因子联合应用可显著促进荷瘤小鼠产生抗原特异性免疫应答及抗肿瘤作用.     

基因疫苗pcDNA3．0．PSMA肿瘤细胞模型的建立

目的 构建表达前列腺特异性膜抗原（PSMA）的肿瘤细胞模型，为基因疫苗的抑瘤效应研究及免疫机制的探讨提供实验材料。方法 脂质体转染法分别将PSMA．pcDNA3．0质粒和pcDNA3．0质粒转染至SP2／0细胞,G418筛选后获得了稳定生长的阳性克隆细胞株。RT．PCR、间接免疫荧光法、Westernblot检测PSMA蛋白的表达。结果 RT．PCR、间接免疫荧光法和Westernblot均证明转染了PSMA．pcDNA3．0质粒的SP2／0细胞表达PSMA。结论 成功建立了稳定表达PSMA的小鼠肿瘤细胞模型．最终为前列腺癌的预防和免疫治疗研究打下了坚实的基础。     

用糖基化磷脂酰肌醇B7-1锚定肿瘤细胞膜进行免疫治疗

目的 研制抗肿瘤免疫治疗的新疫苗.方法 用蛋白转化法将B7-1锚定在肿瘤细胞膜上,免疫C57BL-6小鼠后,一组小鼠取脾细胞进行T细胞扩增和细胞毒T淋巴细胞(CTL)功能检测,另一组小鼠进行肿瘤细胞接种试验.结果 用GPI-B7-1修饰的肿瘤细胞膜免疫小鼠后诱发了肿瘤特异性T细胞扩增和CTL.且该疫苗有一定的保护小鼠免受肿瘤细胞侵袭的作用.结论 GPI蛋白转化法为人类抗肿瘤免疫治疗提供了新的、有效的修饰肿瘤细胞膜的方法.     

Co-administration of a DNA vaccine encoding the prostate specific membrane antigen and CpG oligodeoxynucleotides suppresses tumor growth

BACKGROUND: Prostate-specific membrane antigen (PSMA) is a well characterized prostate-specific tumor associated antigen. Its expression is elevated in prostate carcinoma, particularly in metastatic and recurrent lesions. These observations suggest that PSMA can be used as immune target to induce tumor cell-specific recognition by the host and, consequently tumor rejection. We utilized a DNA-based vaccine to specifically enhance PSMA expression. An immune modulator, such as CpG oligodeoxynucleotides which promote Th1-type immune responses was combined to increase the efficacy of tumor recognition and elimination. METHODS: A eukaryotic expression plasmid pCDNA3.1-PSMA encoding full-length PSMA was constructed. C57BL/6 mice were immunized with endotoxin-free pCDNA3.1-PSMA alone or in combination with CpG oligodeoxynucleotides by intramuscular injection. After 4 immunizations, PSMA specific antibodies and cytotoxic T lymphocyte reactivity were measured. Immunized C57BL/6 mice were also challenged subcutaneously with B16 cells transfected with PSMA to evaluate suppression of tumor growth. RESULTS: Vaccine-specific cytotoxic T lymphocytes reactive with B16 cells expressing PSMA could be induced with this treatment schedule. Immune protection was observed in vaccinated mice as indicated by increased tumor growth in the control group (100%) compared with the groups vaccinated with DNA alone (66.7%) or DNA plus CpG oligodeoxynucleotides (50%) respectively. Average tumor volume was smaller in vaccinated groups and tumor-free survival time was prolonged by the vaccination. CONCLUSION: The current findings suggest that specific anti-tumor immune response can be induced by DNA vaccines expressing PSMA. In addition, the suppression of in vivo growth of tumor cells expressing PSMA was augmented by CpG oligodeoxynucleotides. This strategy may provide a new venue for the treatment of carcinoma of prostate after failure of standard therapy.     

HPV16型E7C亚基因与共激活分子B7-1协同诱导E7特异性CTL研究

目的利用去除Ｅ７的转化活性而保留其抗原性的Ｅ７Ｃ亚基因研制防治ＨＰＶ１６相关疾病的疫苗,并进一步探索利用Ｂ７－１研制更佳活化细胞免疫的加强疫苗。方法用ＰＣＲ方法扩增获得Ｅ７Ｃ后,插入真核表达质粒获得ｐＬＮＣＥ７Ｃ,体外真核细胞中证实其具有表达能力后,在Ｃ５７ＢＬ／６小鼠后腿肌肉内直接进行裸ＤＮＡ接种免疫,或与ｐＬＮＣｍＢ７－１联合免疫接种,用５１Ｃｒ释放法体外分析经免疫鼠的细胞毒性Ｔ淋巴细胞活性。结果经免疫小鼠获得较好的Ｅ７特异性ＣＴＬ活性;若Ｅ７Ｃ与小鼠Ｂ７－１的表达质粒联合接种,则活性明显得到加强。结论Ｅ７Ｃ可以用于ＨＰＶ１６ＤＮＡ疫苗研制,Ｂ７－１具有推广应用价值     

DNA免疫激发针对肾母细胞瘤CTL效应初步研究

目的 将鼠源肾母细胞瘤WT1基因一段序列(WT1y)构建于真核表达质粒pCDNA3.1( ),通过小鼠和体外细胞模型初步研究所激发的针对肾母细胞瘤CTL效应.方法 人工合成WT1基因一段序列,含有HLA-A*2402锚定残基的9个氨基酸.构建重组真核表达质粒pCDNA3.1( )/WT1y.免疫Balb/c小鼠,通过ELISA方法检测体液免疫反应;分离脾淋巴细胞,FCM检测脾淋巴细胞中CD4/CD8;将分离的脾淋巴细胞与小鼠肾母细胞瘤细胞共培养,检测其体外溶解组织相容性抗原型别一致的外源性靶细胞能力.结果 构建的重组质粒经测序鉴定,与GenBank中登录的序列完全一致;免疫组小鼠T淋巴细胞增殖及CTL活性均明显优于对照组(P＜0.01);体外具有较强溶解靶细胞的功能.结论 WT1基因的DNA疫苗初步研究具有很强的CTL效应,为小儿肾母细胞瘤的治疗提供了新的思路.     

Potent Systemic Antitumor Immunity Induced by Vaccination with Chemotactic-Prostate Tumor Associated Antigen Gene-Modified Tumor Cell and Blockade of B7-H1

We previously reported that several DNA fragments from human prostate-specific membrane antigen (hPSM), mouse prostatic acid phosphatase (mPAP), and human prostate-specific antigen (hPSA) genes were selected and fused to create a novel hPSM-mPAP-hPSA fusion gene (named 3P gene), and human secondary lymphoid tissue chemokine (SLC), 3P, and human IgG Fc genes were inserted into pcDNA3.1 to construct a DNA vaccine, designated pSLC-3P-Fc. In this report, to establish a more efficient treatment for immunotherapy against prostate cancer, the construct was transfected into B16F10 to generate gene-modified tumor cell vaccine (named B16F10-SLC-3P-Fc). In poorly immunogenic B16F10 mouse melanoma model, the immunization with B16F10-SLC-3P-Fc resulted in a strong antitumor response and 50% of tumor-bearing mice achieved long-term survival (>120 days). In vivo depletion of lymphocytes indicated that CD8⁺ T cells were involved in the direct tumor killing, whereas CD4⁺ T lymphocytes were required for the induction of CD8⁺ CTL response in B16F10-SLC-3P-Fc-immunized mice. Splenocytes from B16F10-SLC-3P-Fc-immunized mice specifically recognized and lysed PSM, PAP, PSA, and 3P expressing tumor cells. The combined therapy of B16F10-SLC-3P-Fc plus anti-B7-H1 MAbs further enhanced the immune response. Rechallenge experiment showed that a persistent memory response was successfully induced by the combined therapy. These observations suggest pSLC-3P-Fc-modified tumor cells could serve as a vaccine against prostate cancer, and the therapy combined with anti-B7-H1 MAbs further enhanced the antitumor immune response.     

布氏杆菌pCDNA3.1-L7/L12核酸疫苗的构建及其免疫学评价

目的 获得布氏杆菌保护性抗原L2／L12重组蛋白及pCDNA3．1-L7／L12重组质粒，并比较其诱导特异性免疫应答的能力。方法 PCR扩增布氏杆菌核蛋白L7／L12基因分别构建至原核表达载体PET32a( )和真核表达载体pCDNA3.1( )中；pET32a-L7／L12重组质粒转化BL21(DE3)，所表达蛋白经SDS-PAGE、免疫印迹分析、纯化后免疫小鼠；pCDNA3.1-12／L12重组质粒配以GM-CSF同时肌肉注射免疫小鼠，3次免疫后测定免疫功能进行免疫效果的评价。结果ELISA、Western blot检测到免疫鼠体内有特异性抗体产生，蛋白苗所诱导的抗体效价远远高于DNA疫苗；通过淋巴细胞增殖实验、细胞因子和CD分子测定表明DNA疫苗以诱发TH1型免疫为主。结论 所构建的布氏杆菌DNA疫苗和蛋白苗均具有诱导特异性细胞和体液免疫应答的能力，DNA疫苗诱导产生的细胞免疫反应强于蛋白苗，可作为潜在的布氏菌新型疫苗，有进一步研究的意义。     

OAZI-1 蛋白复合物在小鼠体内诱导特异性抗肿瘤效应的研究

目的:在实验动物的水平上分析来源于肿瘤细胞的鸟氨酸脱羧酶抗酶抑制因子-1(Ornithine decarboxylaseantizyme inhibitor-1,OAZI-1) 蛋白复合物能否在小鼠体内诱导特异性抗肿瘤效应。方法:用包被有OAZI-1 抗体的免疫磁珠从B16-F1 小鼠黑色素瘤细胞中分离OAZI-1 蛋白复合物,用此复合物免疫小鼠后, 再在小鼠皮下接种B16-F1 活细胞,然后观察接种瘤在小鼠体内的成瘤及生长状况。ELISA 法用于检测免疫小鼠血清中IFN-γ含量。乳酸脱氢酶释放实验(LDH)检测免疫小鼠脾脏淋巴细胞对B16-F1 细胞的杀伤效应。上述动物实验用原核表达纯化的OAZI-1 蛋白和PBS 免疫的小鼠作为对照。结果:与对照小鼠相比,接种OAZI-1 蛋白复合物的小鼠脾淋巴细胞(效应细胞)对B16-F1 黑素瘤细胞(靶细胞)具有更强的杀伤能力。在三种不同的效：靶比下(10 ：1、50 ：1、100 ：1),该组小鼠脾淋巴细胞对靶细胞的杀伤活性分别为46.2%、59.5% 和92.5%,显著性高于接种纯化OAZI-1 蛋白组(36.1%、26.8% 和45.9%)和接种PBS 组(24.6%、24.0% 和27.2%)小鼠脾淋巴细胞。此外,接种OAZI-1 蛋白复合物的小鼠血清中抗肿瘤细胞因子IFN-γ含量(538.3 pg/ ml)也显著性高于接种纯化OAZI-1 蛋白组(256.2 pg/ ml)和接种PBS 组(131.0 pg/ ml)小鼠。上述方法免疫的小鼠在皮下再接种B16-F1 活细胞后,免疫OAZI-1 蛋白复合物组小鼠成瘤率为40%,而PBS 组和纯化OAZI-1 蛋白组小鼠成瘤率为100%,且接种瘤在OAZI-1 蛋白复合物免疫小鼠体内生长更为缓慢。结论:从B16-F1 肿瘤细胞中分离的OAZI-1 蛋白复合物中可能含有肿瘤抗原,用此复合物接种小鼠能在实验动物体内诱导抗肿瘤免疫杀伤活性。