OmpR对伤寒沙门菌侵袭上皮细胞能力的影响

目的: 研究OmpR对伤寒沙门菌侵袭力的影响及相关分子机制。方法: 利用空载体对照株(WT pBAD33)、ompR缺陷株(ΔompR pBAD33)和ompR回补株(C ΔompR)进行HeLa细胞侵袭实验,探究伤寒沙门菌OmpR对于HeLa细胞侵袭力的影响。进一步用荧光实时定量PCR(qRT PCR)、凝胶阻滞实验(EMSA)分析伤寒沙门菌OmpR对侵袭相关基因iagA、invF、prgH的调控作用。结果： 成功制备伤寒沙门菌C ΔompR。在HeLa细胞侵袭实验中,ΔompR pBAD33侵袭力显著低于WT pBAD33(P<0.01),而C ΔompR侵袭能力较ΔompR pBAD33明显升高（P<0.01）;qRT PCR结果显示,ΔompR pBAD33中侵袭相关基因iagA、invF、prgH的转录水平较WT pBAD33明显下降(P<0.01);EMSA结果表明,OmpR可直接与prgH基因启动子区域结合,与iagA和invF基因启动子区域未有结合。 结论： OmpR通过直接调节prgH和间接调节iagA、invF增加侵袭相关基因的表达,从而增强伤寒沙门菌对上皮细胞的侵袭力。     

宿主整合因子对伤寒沙门菌动力的影响

目的: 探究宿主整合因子(integration host factor，IHF)对伤寒沙门菌动力的影响及其潜在机制。方法: 选用IHF两个亚基HimA和HimD的基因缺失株(△himA pBAD、△himD-pBAD），并构建相应回补株(himA-C、himD-C)，进行细菌动力实验，观察himA和himD对伤寒沙门菌动力的影响。通过实时荧光定量PCR比较野生株(WT-pBAD)与△himA-pBAD、野生株与△himD-pBAD中鞭毛相关基因flhD、fliA和fljB等mRNA表达差异，分析IHF对鞭毛基因的调控作用。结果： 与WT-pBAD相比，△himA-pBAD和△himD pBAD动力均明显减弱(P均<0.05)，himA-C、himD-C动力则基本一致。与WT pBAD相比，△himA pBAD、△himD-pBAD中鞭毛相关基因flhD、fliA和fljB的mRNA表达均显著降低(P<0.01或<0.05)。结论： IHF可能通过正向调节鞭毛相关基因flhD、fliA和fljB等转录，增强伤寒沙门菌的动力。     

SsrB对伤寒沙门菌氧应激早期基因表达的调节

目的:研究伤寒沙门菌ssrB基因在氧应激早期对其他基因表达的调节.方法:通过同源重组的方法利用自杀质粒制备伤寒沙门菌ssrB基因缺陷变异株;采用伤寒沙门菌全基因组芯片比较野生株和ssrB基因缺陷变异株在氧应激早期的基因表达差异,并对其中部分表达差异基因进行实时定量PCR验证;利用HeLa细胞进行细菌侵袭实验,研究ssr...     

伤寒沙门菌rpoE基因缺陷变异株的制备及其生存能力

目的为深入研究rpoE基因在伤寒沙门菌侵袭致病中的作用,制备rpoE基因缺陷变异株;观察rpoE基因缺陷变异株在应激条件下的生存能力。方法根据伤寒沙门菌rpoE基因序列,设计PCR特异性引物,制备rpoE基因缺陷性同源性核苷酸片段导入自杀质粒PGMB151后再导入伤寒沙门菌野生株,进行同源重组,用PCR观察重组现象;绘制生长曲线,对比rpoE基因缺陷变异株与野生株在应激条件下的生存情况。结果PCR及序列分析证实,缺陷变异株的rpoE基因缺失288个碱基;生长曲线提示rpoE基因缺陷变异株在氧、酸、高渗应激条件下生存能力明显低于野生株,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论成功构建了伤寒沙门菌rpoE基因缺陷株,并发现在氧、酸、高渗应激条件下其生存能力明显降低,为进一步研究其在伤寒沙门菌中的功能奠定了基础。     

伤寒沙门菌OmpR缺陷变异株制备与分泌蛋白初析

目的观察伤寒沙门菌调节蛋白OmpR的调节作用，制备伤寒沙门菌OmpR缺陷变异株，并比较分析野生株和OmpR缺陷变异株在不同渗透压环境培养下的分泌蛋白。方法用自杀质粒pGMB151介导同源性重组方法制备伤寒沙门菌OmpR缺陷变异株，用PCR方法观察重组现象，变异株经测序和外膜蛋白的SDS—PAG电泳鉴定，用SDS—PAG电泳结合Western blot比较分析野生株和OmpR缺陷变异株在高、低渗透压环境培养下的SipC等分泌蛋白。结果成功制备伤寒沙门菌OmpR缺陷变异株，并发现变异株中，包括SipC、鞭毛素蛋白在内的多种蛋白的表达分泌有明显差异。结论伤寒沙门菌OmpR在不同的渗透压下分别影响SipC、鞭毛素蛋白等多种蛋白的表达分泌。     

伤寒沙门菌不同生长期和不同应激下非编码RNA ArpH的表达

［摘要］目的: 探讨伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Typhi,S. Typhi) 在不同生长时期和不同应激条件下非编码RNA ArpH的表达水平,以及双组分调节系统和氧应激调节因子对ArpH的调控作用。方法: 利用RNA印迹、qRT PCR分析伤寒沙门菌在不同生长期ArpH的表达;利用qRT PCR分析伤寒沙门菌在酸、氧、高渗和热等不同应激环境下ArpH的表达;利用qRT PCR分析伤寒沙门菌双组分调节系统基因(ompR、rcsB)和氧应激调节因子基因(oxyR)对ArpH表达的影响。结果： ArpH在伤寒沙门菌的对数晚期表达量最高,在从对数早期开始到达稳态期的转变中,其表达量逐渐增加,而进入稳态期后明显回落;ArpH表达水平在酸应激下明显下降,氧应激下明显增高,而高渗应激和42℃热应激下ArpH的表达无显著变化;当ompR、rcsB和oxyR基因缺失时,ArpH表达量均明显下降。结论： ArpH参与伤寒沙门菌对酸、氧应激的调节;伤寒沙门菌双组分调节系统OmpR、RcsB和氧应激调节因子OxyR对ArpH均有正向调控作用。     

小RNA SbfR增强伤寒沙门菌动力和侵袭力

目的: 探究小RNA SbfR对伤寒沙门菌动力和侵袭力的影响及其潜在机制。方法: 用前期构建的SbfR缺陷株（△SbfR+pBAD/Myc HisA）、SbfR回补株（△SbfR＋pBAD/Myc HisA SbfR）和空载体株（WT+pBAD/Myc HisA）进行细菌动力实验和HeLa细胞侵袭实验,观察SbfR对伤寒沙门菌的动力和对HeLa细胞侵袭力的影响。通过基因芯片分析SbfR缺陷株与回补株全基因组表达的差异,并进一步用qRT PCR分析SbfR对2个鞭毛和2个侵袭相关基因的调控作用。结果： 与空载体株、SbfR回补株比较,SbfR缺陷株动力和侵袭力均明显下降（P＜0.01或0.05）;缺陷株鞭毛和侵袭相关基因的转录表达水平均比回补株明显下降（均P＜0.05）。 结论： SbfR通过促进鞭毛和侵袭相关基因的表达,增强伤寒沙门菌的动力和侵袭力。     

伤寒沙门菌核糖核酸酶 G对胞内非编码RNA T3956水平的影响

目的: 研究伤寒沙门菌核糖核酸酶G（RNase G）对非编码RNA（ncRNA）T3956胞内水平的影响。方法: 利用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌RNase G基因（rng）缺陷变异株;利用重组质粒pBAD将rng导入rng缺陷变异株,构建rng缺陷回补株;通过实时定量PCR分别比较伤寒沙门菌野生株、rng缺陷变异株、回补株等在不同生长时期的ncRNA T3956水平。结果: 成功制备伤寒沙门菌rng缺陷变异株、rng缺陷回补株和空质粒对照株; 实时定量PCR结果表明,rng缺陷株中T3956的胞内水平较野生株有所升高,并且在对数中期和稳态期升高得更加明显,而回补株胞内T3956的水平又得到恢复。结论: 伤寒沙门菌RNase G能够参与对胞内ncRNA T3956水平的调控,并且在细菌对数生长中期和稳态期作用更为明显。     

非编码 RNA AsrC 对巨噬细胞中伤寒沙门菌生存能力的影响

目的:研究伤寒沙门菌非编码RNA Asr C对其在巨噬细胞中生存能力的影响及机制。方法:用Asr C高表达菌株和空质粒对照株分别感染巨噬细胞12,24 h,检测伤寒沙门菌在感染细胞中的生存能力;qRT-PCR检测asr C、rse C、rpo E mRNA的表达水平;蛋白质印迹检测自噬标志蛋白LC3的表达。结果:与空质粒对照株相比,Asr C高表达菌株感染巨噬细胞12,24 h后在巨噬细胞中的生存能力明显下降(P均<0.01),asr C mRNA表达水平增加(P均<0.05),对侧靶基因rse C mRNA的表达水平增高(P均<0.05),而rpo E mRNA的表达水平无明显变化(P>0.05);Asr C高表达菌株自噬标志蛋白LC3的表达与空质粒对照株间的差异无统计学意义(P>0.05)。结论:伤寒沙门菌非编码RNA Asr C高表达可降低其在巨噬细胞中的生存能力,可能与自噬无直接关系。     

H:z66抗体应激后伤寒沙门菌fliG基因缺陷株与野生株基因表达的差异

目的:观察伤寒沙门菌鞭毛转子蛋白基因fliG在H:z66抗体应激后对其他基因表达的影响。方法:利用自杀质粒介导的同源重组法制备伤寒沙门菌fliG基因缺陷变异株;利用伤寒沙门菌全基因组芯片分析技术,比较伤寒沙门菌野生株和fliG基因缺陷变异株在H:z66抗体应激后的基因表达谱差异,并选择部分表达有差异的基因进行实时定量PCR验证。结果:经PCR验证及序列比对,伤寒沙门菌fliG基因缺陷变异株制备成功;基因表达谱比较结果表明,与野生株相比,伤寒沙门菌fliG基因缺陷变异株在H:z66抗体应激后有21个基因表达上调,7个基因表达下调;实时定量PCR结果与芯片结果一致。结论:fliG基因在伤寒沙门菌受到H:z66抗体刺激后的基因表达调控中发挥一定作用。     

OxyR蛋白对不同应激条件下伤寒沙门菌生存能力的影响

目的：研究OxyR蛋白对伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Typhi, S.Typhi)在应激条件下生存能力的影响。方法：用λ-Red系统制备S.Typhi oxyR基因缺陷变异株;通过重组质粒pBAD/gⅢ将oxyR基因和pBAD/gⅢ空质粒分别导入oxyR基因缺陷变异株;构建oxyR缺陷回补株和oxyR缺陷回补空质粒株;制作生长曲线,观察野生株、oxyR缺陷株、oxyR缺陷回补株及oxyR缺陷回补空质粒株在不同应激条件下的生长状况;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析OxyR对S.Typhi氧化调节相关基因表达的影响。结果：成功制备S.Typhi oxyR基因缺陷变异株、oxyR基因缺陷回补株和空质粒对照株;生长能力分析结果表明,与野生株相比,oxyR缺陷株在氧应激时生长缓慢(P<0.05),oxyR缺陷回补株的生长能力得到恢复;qRT-PCR结果显示,在氧应激时OxyR蛋白可以抑制hemH基因的表达,活化uxuA基因的表达。结论：OxyR蛋白参与S.Typhi对氧应激的调节,为进一步研究S.Typhi 的致病性奠定了基础。     

VPA0961对副溶血弧菌运动能力的调控

目的: 构建vpa0961基因突变株及其回补株,并初步探究VPA0961对副溶血弧菌运动能力的调控作用。方法: 以副溶血弧菌RIMD2210633野生株的基因组DNA为模板,PCR扩增得到vpa0961的同源臂融合片段,并克隆至自杀质粒pDS132多克隆位点。将pDS132重组质粒通过结合转移的方式转入野生株,进而通过同源重组方法替换原始vpa0961,制备vpa0961无痕突变株(Δvpa0961)。PCR扩增vpa0961整个编码区序列,并将其直接克隆入pBAD33质粒,获得重组回补质粒。将回补质粒结合转移到Δvpa0961中,然后通过特异性引物PCR鉴定并外送测序以获得回补株。将副溶血弧菌的预培养物接种于游动(swimming)和爬动(swarming)平板,37℃静置培养,比较不同菌株间菌苔直径的差异。采用qRT-PCR分析鞭毛蛋白基因lafA、flaB和flaF的mRNA表达水平。结果： 特异性扩增及序列分析显示,成功构建vpa0961基因突变株和回补株;与野生株相比,Δvpa0961游动能力和爬动能力明显减弱(t=14.06,36.37,P<0.05);与野生株相比,Δvpa0961 lafA、flaB和flaF mRNA转录水平明显降低(t=185.2,56.36,50.24,P<0.05)。结论： 成功构建vpa0961的基因突变株和回补株,且VPA0961对鞭毛基因的转录具有正调控作用。     

短期胰岛素泵强化治疗对初诊2型糖尿病患者血清超敏C反应蛋白的影响

目的: 观察初诊2型糖尿病(T2DM)患者短期胰岛素泵(CSII)强化治疗前后血清超敏C反应蛋白(hs-CRP)的水平,并探讨其变化的影响因素。方法: 选取研究对象190例,其中健康对照组70例,初诊T2DM患者120例。T2DM组接受CSII强化治疗2周,比较CSII治疗前后血糖、血脂、胰岛素、稳态模型胰岛β细胞功能指数(HOMA-β)、稳态模型胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、hs-CRP等指标。结果： ①初诊T2DM组血清hs-CRP水平2.76(0.81～6.33) mg/L明显高于健康对照组0.48(0.18~0.98) mg/L,差异有统计学意义(P<0.05)。②CSII强化治疗2周后,T2DM组空腹血糖、口服葡萄糖耐量试验（OGTT）2 h血糖(2hPG)、HOMA-IR、hs-CRP水平显著下降,空腹胰岛素(FINS)、HOMA-β明显升高(P<0.01)。③简单相关分析显示治疗前后血清hs-CRP差值(Δhs-CRP)与收缩压差值(ΔSBP)、空腹血糖差值(ΔFPG)、空腹胰岛素差值(ΔFINS)、总胆固醇差值(ΔTC)、低密度脂蛋白差值(ΔLDL-C)、ΔHOMA-IR、ΔHOMA-β呈正相关(r分别为0.287、0.324、0.236、0.257、0.366、0.230、0.201,P均<0.05)。④以Δhs-CRP为因变量,以ΔSBP、ΔFPG、ΔFINS、ΔTC、ΔLDL-C、ΔHOMA-IR、ΔHOMA-β为自变量进行多元逐步回归分析,有ΔFPG(β=0.214,P<0.05)、ΔLDL-C(β=0.263,P<0.05)、ΔFINS(β=0.376,P<0.01)、ΔHOMA-β(β=0.352,P<0.01)、ΔHOMA-IR(β=0.279,P<0.05)进入方程(R2=0.363,P<0.05)。结论： 初诊T2DM患者经短期CSII强化治疗后血清hs-CRP水平明显下降,ΔFPG、ΔLDL-C、ΔFINS、ΔHOMA-β、ΔHOMA-IR是影响Δhs CRP的独立相关因素。     

OsmY缺失对伤寒沙门菌在高渗应激早期基因表达的影响

目的:研究伤寒沙门菌OsmY在高渗应激早期对其他基因表达的调节。方法:通过同源重组的方法利用自杀质粒制备伤寒沙门菌osmY基因缺陷变异株;采用伤寒沙门菌全基因组芯片比较野生株和osmY基因缺陷变异株在高渗应激早期的基因表达差异,并对其中部分表达差异基因进行实时定量PCR验证。结果:成功制备伤寒沙门菌osmY基因缺陷变异株;基因芯片结果显示,在高渗应激早期,与野生株相比,伤寒沙门菌osmY基因缺陷变异株有128个基因表达下调,有27个基因表达上调。实时定量PCR与芯片结果一致。结论:OsmY可作为一调节因子在伤寒沙门菌高渗应激早期对基因表达起重要调节作用。     

精氨酸刺激试验中不同时间点胰岛素/血糖增值对2型糖尿病患者胰岛β细胞功能的评价作用

 目的  了解精氨酸刺激试验中不同时间点胰岛素/血糖增值对2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者胰岛β细胞储备功能的评价作用,以探讨精氨酸刺激试验的简易方法。方法   2009年9月至2013年1月复旦大学附属中山医院内分泌科收治的1 730例T2DM患者,在精氨酸刺激后2、4、6 min分别采血测血糖(serum glucose,G)、真胰岛素(insulin,S)和C肽(C peptide,CP)。胰岛素/血糖的增值(ΔIS/G)作为评价胰岛β细胞功能的标准,采用相关性分析比较精氨酸刺激后2 min、4 min及6 min胰岛素/血糖的增值(Δ2IS/G、Δ4IS/G、Δ6IS/G)与胰岛β细胞功能相关性;进一步采用Bland Altman方法评价不同时间点ΔIS/G与精氨酸刺激后ΔIS/G增值的一致性。结果  T2DM患者中精氨酸刺激后每一时间点均与ΔIS/G呈显著相关(Δ2IS/G:r=0.889,P<0.01;Δ4IS/G:r=0.973,P<0.01;Δ6IS/G:r=0.903,P<0.01),其中精氨酸刺激后Δ4IS/G与精氨酸刺激后ΔIS/G相关性最强。Bland Altman分析结果表明精氨酸刺激后Δ2IS/G、Δ4IS/G及Δ6IS/G与平均ΔIS/G一致性高,且以Δ4IS/G最佳。结论   可以用精氨酸刺激后Δ4IS/G来评价T2DM胰岛β细胞的第一相胰岛素储备功能。