肝细胞癌组织中乙肝病毒HBx-d382突变体S区基因分析

目的分析肝细胞癌组织中乙肝病毒HBx-d382突变体S基因和前S基因,了解其变异情况。方法采用巢式PCR和琼脂糖凝胶电泳的方法对16份肝细胞癌组织中乙肝病毒S基因和前S基因进行扩增和分析。选择HBxd382突变体S基因和前S基因目的片段进行回收、纯化、克隆和测序,并与HBV参考序列进行比对。结果16份肝癌组织中有9份存在HBx-d382突变体,HBx-d382突变体肝癌组织S基因和前S基因检出率分别为11.11%(1/9)、44.44%(4/9),且50.00%的肝癌组织前S基因PCR扩增产物出现了多条带。HBx-d382突变体S基因和前S基因目的片段与HBV参考序列(AF282917)比对,一致性介于98.08%至98.97%。结论 HBx-d382突变体肝癌组织中部分检出了S基因和前S基因,前S基因比S基因更容易发生突变。     

选择性剪接变异体的RT-PCR检测及结果分析

目的 利用RT-PCR方法检测并分析mRNA选择性剪接变异体.方法 针对糖原合成酶激酶(GSK)3β和B细胞转位基因( BTG)3基因变异体差别设计引物,利用RT-PCR扩增后进行电泳和克隆DNA测序.结果 GSK3β和BTG3的RT-PCR产物电泳均出现3条带,经过电泳和克隆DNA测序发现GSK-3β中上面2条带为同一产物.对BTG3上(位于319 bp)、下(位于70 bp)2条带进一步PCR扩增后测序,结果发现3个条带均为同一产物.结论 RT-PCR法检测选择性剪接产物操作方便,对Western蛋白印迹结果评价具有指导意义,但是产生的非特异条带可能是由于某种特殊原因造成,如选择性剪接部位的特异核酸序列,需DNA测序做进一步确定.     

三种方法对日本血吸虫抗原cDNA克隆的筛选和鉴定

利用融源表达、平板裂解法和PCR扩增三种不同方法分别对日本血吸虫抗原cDNA基因进行鉴定和分析,8个免疫筛选阳性克隆均能在大肠杆菌中以融合蛋白的形式表达,表达蛋白分子量为140～150kDa,抗原cDNA基因经限制性内切酶EcoRI酶解后,琼脂糖凝胶电泳显示其大小为700～900bp,PCR能扩增出特异性条带。结果表明,上述三种方法能从蛋白质和核酸水平有效地鉴定血吸虫抗原cDNA基因。     

应用AFLP法检测小鼠高、低转移性肝癌细胞株基因组的遗传差异

目的：应用AFLP技术检测小鼠高、低转移性肝癌细胞株基因组的遗传改变，以期发现与肿瘤转移相关的DNA片段或基因。方法：肿瘤组织基因组DNA经限制性内切酶酶切，连接特异性接头，采用25对与接头相识别的引物进行扩增，扩增产物经含溴化乙锭的1．5％琼脂糖凝胶电泳，紫外透视仪分析，照相，回收差异片段，克隆测序，结果：25对引物均扩增出清晰条带，21对引物扩增结果显示高低转移性肝癌无差异，4对引物扩增结果显示二者之间有差异，表现为扩增带的有无，4条回收片段中的1条片段克隆成功并测序，结论：AFLP技术适用于肿瘤易感基因的筛选，小鼠肝癌的转移可能与基因组不稳定性有关，所得差异片段是否与转移相关有待进一步鉴定。     

抑癌基因PTEN在肝细胞肝癌中的表达及意义

目的:探讨肝细胞肝癌中抑癌基因PTEN的表达情况及临床病理意义。方法:应用免疫组织化学(S-P法)技术检测了42例肝细胞肝癌及其相应的癌旁组织中PTEN和的表达情况。结果:42例癌旁组织PTEN全部阳性表达,肝细胞肝癌组织中PTEN阳性表达率47.6%。42例肝细胞肝癌组织中高分化癌的阳性率为68.7%,低分化癌阳性率38.5%,PTEN蛋白在肝癌组织中的阳性表达与组织分化程度明显相关。结论:肝细胞肝癌组织中存在较高比例的PTEN蛋白阴性表达,说明在肝细胞肝癌的发生发展中PTEN基因失活起着重要作用,它的阳性表达可能有一定的预后意义。     

应用AFLP法检测小鼠黑色素瘤B16基因组的变异

目的 应用AFLP技术检测小鼠黑色素瘤B16的遗传改变。方法 肿瘤及正常组织基因组DNA经限制性内切酶酶切,连接特异性接头,采用20条与接相识别的引物进行扩增,扩增产物经含溴化乙锭的1．5％琼脂糖凝胶电泳,紫外透视仪分析,照相。结果 20条引物均扩增出清晰条带,20条引物扩增结果显示B16瘤细胞株与移植瘤基因组间无差异。17条引物扩增结果显示肿瘤与正常组织间无差异,3条引物扩增结果显示肿瘤与正常组织间有差异,表现为扩增带的丢失或增加。结论 黑色素瘤的发生可能与基因组不稳定性有关。     

人PTEN基因表达载体的构建及其在U251细胞株中的表达

目的:克隆人野生型和突变型PTEN的cDNA,并构建其表达载体,探讨其表达质粒在人胶质瘤U251细胞中的表达情况。方法:分别从新鲜胎盘组织和结肠癌组织中提取总RNA,采用RT-PCR的方法扩增人野生型和突变型PTEN基因全长cDNA,分别克隆入pMD18-T载体上,经PCR、酶切鉴定均为阳性的克隆,进行核苷酸序列分析,再分别将两段基因定向克隆入pcDNA3.1(+)载体中构建表达载体。结果:反转录PCR扩增后的产物,在约1.4kb处出现明亮的特异性条带,pcDNA-PTEN-WT细胞的生长曲线生长速度较另3种细胞明显减慢。结论:转染入U251细胞,发现突变型PTEN蛋白对细胞生长无明显抑制作用,而野生型PTEN蛋白对细胞生长有明显抑制作用。     

获取充足肺腺癌及同源正常组织全长cDNA有效方法的探讨

目的 获取肺腺癌及同源正常组织完整的RNA分子，并由此逆转录成全长cDNA，经各种杂交手段，筛选未知基因片段。方法 从肺腺癌及同源正常组织中分别提取总RNA，经琼脂糖凝胶电泳确认RNA未降解后，在oligodT-primer的引导下，将mRNA逆转录成ds cDNA,并在ds cDNA上游及下游连接上不同的适配子（adaptor)，连接适配子的ds cDNA分别在不同的引物引导下，经PCR扩增并富集出大量的全长cDNA。结果 扩增出肺腺癌及同源正常组织的全长cDNA，肺正常组织的cDNA基因片段在0.3-1.9kb之间，而肺腺癌的片段在0.3-4.5kb之间。结论 长距离cDNA PCR是从微量ds cDNA起始材料中获得大量的全长cDNA信息的有效方法。     

胃癌组织中Caveolin-1基因外显子2甲基化状态检测

目的：应用甲基化特异性PCR（MSP）技术检测胃癌组织中Caveotin-1基因外显子2启动子区域5’端CpG岛甲基化状况,探讨Caveolin-1基因甲基化在胃癌发生发展中的作用．方法：收集30例胃癌组织和6例距肿瘤5cm以上的癌旁正常胃组织,运用标准蛋白酶K消化、酚-氯仿抽提法提取组织中基因组DNA,采用CpGenome DNA Modification Kit对DNA进行修饰后以甲基化特异性引物及非甲基化引物进行PCR,通过琼脂糖凝胶电泳及产物测序判定结果．结果：6例癌旁正常胃组织Caveolin-1基因外显子2启动子区域5＇端CpG岛均为甲基化阴性．30例胃癌组织中有27例甲基化阳性,甲基化率为90％（27／30）．其中16例胃癌组织（53．3％）仅有甲基化引物扩增出目的条带,表现为完全甲基化;11例胃癌组织（36．7％）甲基化与非甲基化引物均扩增出目的条带,表现为部分甲基化．统计结果显示胃癌组织中Caveolin-1基因外显子2启动子区域甲基化率显著高于癌旁正常胃组织．结论：胃癌组织中存在Caveolin-1基因外显子2启动子区域高甲基化,且可能参与胃癌的早期过程．     

肝细胞肝癌组织中FN和PTEN基因表达水平及意义*

目的：研究FN和PTEN基因在肝细胞肝癌中的表达情况,探讨其在肝细胞肝癌发生发展中的作用及意义。方法：应用荧光实时定量PCR方法,检测84例肝细胞肝癌及癌旁组织中FN蛋白、PTEN蛋白、mRNA表达情况。分析FN和PTEN基因表达及肝细胞肝癌的关系。结果：FN蛋白主要定位于肝癌细胞外基质中。FN mRNA在肝细胞肝癌中的阳性率为79.76%,高于癌旁肝组织的阳性率9.52%,差异具有统计学意义（P<0.05）。PTEN蛋白明确定位于肝细胞胞质内。PTEN mRNA在肝细胞肝癌中的阳性率为38.09%,明显低于癌旁肝组织的阳性率100%,差异具有统计学意义（P<0.05）。FN在合并癌栓,淋巴结转移,AFP阳性,肿瘤数目多发的肝癌组织中的表达高,而在不同分化程度及不同肿瘤直径的肝癌组织中表达差异无统计学意义;PTEN在低分化肝癌细胞,合并癌栓,AFP阳性,淋巴结转移,肿瘤直径≥2cm的肝癌组织中表达较低,而在不同肿瘤数目的肝癌组织中表达无统计学意义,PTEN蛋白表达与HBsAg无关,与组织学分级及转移有关。结论：肝癌组织中FN mRNA的表达量高于癌旁组织,而肝癌组织中PTEN mRNA的表达量低于癌旁组织,FN和PTEN基因可能与肝细胞肝癌的发生发展有关,其可能在肝癌的发生发展、侵袭转移中起一定的促进或抑制作用。     

人肝细胞癌中PTEN基因的DNA杂交及突变分析

目的　研究人肝细胞癌中ＰＴＥＮ基因缺失及第５、第８外显子突变。方法　应用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测人肝细胞癌中ＰＴＥＮ基因限制性片段长度多态性和纯合性缺失、半合性缺失、片段缺失。应用聚合酶链单链构象多态性（ＰＣＲＳＳＣＰ）检查ＰＴＥＮ基因的第５、第８外显子的突变。结果　Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果显示,所有３４例肝细胞癌中ＰＴＥＮ基因未见限制性片段长度多态性或纯合性缺失、半合性缺失、片段缺失。ＰＣＲＳＳＣＰ检测发现,２例肝细胞癌第５外显子ＰＣＲ产物均显示１条额外电泳迁移带,突变率为５．９％（２／３４）。另２例肝细胞癌第８外显子ＰＣＲ产物呈现额外电泳迁移带,突变率为５．９％（２／３４）,合计突变率为１１．８％（４／３４）。结论　所检３４例人肝细胞癌中ＰＴＥＮ基因未见纯合性缺失、半合性缺失、片段缺失,但存在突变。     

喉鳞癌蛋白酪氨酸磷酸酶基因突变及甲基化研究

目的研究喉鳞状细胞癌(简称鳞癌)蛋白酪氨酸磷酸酶(PTEN)基因突变和启动子甲基化状况。方法应用聚合酶链反应-单链构像多态性方法(PCR-SSCP)分析银染系统,检测喉鳞状细胞癌新鲜或冰冻组织中PTEN基因第5、第8外显子的突变,采用甲基化敏感聚合酶链反应方法(MSP)分析喉癌及正常喉组织PTEN基因启动子过甲基化。结果PTEN基因突变均发生在喉鳞癌中,占17.5%(7/40),其中第5外显子有6例发生突变,突变率15.0%(6/40),这6例中有低分化3例,中分化3例,无高分化;淋巴结转移占83.3%(5/6)。第8外显子仅有1例发生突变,突变率为2.5%(1/40),该病例虽无淋巴结转移,但病理为低分化。40例喉鳞癌组织中,有40.0%(16/40)例PTEN基因启动子区甲基化,9例喉正常组织中未发现甲基化,喉癌中有2例既有第5外显子突变发生,又有启动子甲基化,占5.0%;有1例既有第8外显子突变,又有启动子甲基化,占2.5%。结论PTEN基因启动子甲基化及基因突变是其在喉鳞癌中失活的原因,并且该基因失活可能与喉鳞癌演进有关。     

CD44v6和PTEN基因蛋白表达与肝细胞癌转移和预后的关系

目的探讨CD44v6和PTEN表达与肝细胞癌(HCC)转移和预后的关系.方法应用免疫组织化学方法,检测分析110例HCC组织中CD44v6及PTEN基因蛋白表达,结合随访资料分析.结果在HCC中,CD44v6和PTEN阳性表达率分别为42.7%(47/110)和33.6%(37/110).CD44v6阳性表达的HCC转移率高(P<0.05)、分化程度低和5年生存率低(P<0.05).PTEN阳性表达的HCC转移率低(P<0.05)、分化程度高和5年生存率高(P<0.05).结论 CD44v6和 PTEN表达与HCC 转移和患者生存期密切相关,检测CD44v6和PTEN蛋白的表达可作为判断HCC预后的参考指标.     

Survivin和PTEN蛋白在肝癌中表达关系探讨

目的:探讨Survivin和PTEN蛋白与肝癌临床病理因素的关系以及两蛋白表达之间的可能关系。方法:免疫组化方法检测51例肝癌组织石蜡切片中Survivin和PTEN蛋白的表达。分析蛋白的表达情况与肝癌临床病理因素的关系。结果:(1)Survivin蛋白在肝癌中阳性表达33例(64.70%),阳性表达率和表达强度与肝癌的病理分级有关。(2)PTEN蛋白在肝癌中阳性表达24例(47.06%),其阳性表达率和表达强度与肝癌的病理分级和癌栓形成有关。(3)在同一组织中,Survivin高表达者,其PTEN蛋白表达较低。结论:肝癌中Survivin激活与上调,PTEN失活、下调或缺失,共同参与调控肝癌分化和转移。     

肝细胞癌与肝内胆管癌间基因表型差异分析

目的：通过对肝细胞癌（HCC）和肝内胆管癌（ICC）之间抑癌基因（tumor suppressor gene,TSG）和微卫星（ni-crosatellite,MS）变异谱特点进行对比分析，了解这两种肝脏最常见恶性肿瘤在基因发生路径上的差异。方法：采用微组织切割法，从石蜡包埋的组织切片中提取基因组DNA进行直接测序，对33例信息处（杂合性）HCC和22例ICC进行了6种TSG杂合性缺失（loss of heterozygosity,LOH）的检测，并对其中10例HCC和全部22例ICC做7个MS的LOH分析。结果：6种TSG的变异情况在HCC依次为：p53(4/5,80.0%)、OGG1(2/4,50.0%）、（5/12，41.7%）、RB1(1/5,20.0%）、DCC（0/4，0%）、MCC（0/3，0%）；在ICC为：APC（11/16，68.8%）、DCC（6/13，46.2%）、OGG1（5/12，41.7%）、p53(6/16,37.5%)、RB1（2/9，22.2%）、MCC（1/7，14.3%）。HCC和ICC中7个MS的LOH发生率分别为30.0%(3/10)和59.1%（13/22）。7个MS在HCC中仅有2个发生LOH，而在ICC中则全部出现LOH，其中与p16/MTS-1和MXI-1基因连锁的4个MS仅在ICC中出现LOH。结论：HCC和ICC之间TSG和MS存在着明显不同的LOH谱，推测两者在发生过程中可能沿循各自不同的分子路径。对LOH基因谱成员的分析，有助于进一步认识HCC和ICC发生的分子机制。     

STUDY ON SMALL HEPATOCELLULAR CARCINOMA AND ITS EXTENSION

This paper surranarizes the “study on small hepatocellular carcinoma and its extension“ in Liver Cancer lrmtitute, Zhongshan Ho6pital of Shanghai Medical University during the past 25 years. The results indicared that it was an important approach to obtain long-term HCC survivors, of the 239 patients with 5-year survival, small HCC resection accounted for 51.4%. It was an effective approach to improve the prognosis of HCC in the entire series, the 5-year survival of inpatients treated in authorst institution was 4.8% in 1958-1970, 12.2% in 1971-1983, and 46. 7% in 1984-1995t which were correlated to the increase proportion of small HCC resection in the series; it was more effective as compared to large HCC resection,the 5 year survival was 61.3 %(n=645) versus 33.6% (n=950). Extensions of small HCC study included early detection and treatment of small recurrenx HCC, of the 147 patients with re-resection, the 5-year survival was 48.9% calculated from the time of first resection. Another extension was conversion of large HCC into small HCC, using muhimodality combination treatment, 72 out of the 663 patients with surgically verified unresectable HCCs have been converted to resectable, 5 year survival being 62.1%, which was comparable to that of small HCC resection. Studies on related basic aspect of small HCC such as cell origin of recurrence, and molecular aspect of small HCC * indicated that biological characteristics, particularly the tumor invasiveness, remained the key link for further prolong survival after small HCC resection. Recently, a“patient-like“ human HCC metastatic model in nude mice has been established. Experimental interventions have also been tried. Clinical trials for prevention of recurrence after small HCC resection have shown preliminary encouraging results. However, the “cost-effectiveness“ of screening, the invasiveness of HCC, the multieentrie origin, the coexisted Chilcl C cirrhosis, etc. , remained great challenge.     

miR-590-5p和miR-590-3p参与肝细胞肝癌发展的机制

目的研究miR-590的两个臂—miR-590-5p和miR-590-3p对肝癌细胞增殖能力的影响,以及参与肿瘤发生发展的机制。
方法利用miRNA芯片、QPCR对肝癌标本和各细胞株miR-590的表达谱系进行分析和验证。通过脂质体将miR-590 mimic或
inhibitor 转染正常肝细胞或肝癌细胞,MTT生长曲线分析和软琼脂克隆形成实验检测转染后细胞增殖及存活能力的变化。
Targetscan预测miR-590-5p和miR-590-3p的靶基因,并通过萤光素酶报告系统以及western blot进行验证。结果miRNA芯片
结果显示3个肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma, HCC）组织相对于癌旁正常组织,miR-590-5p和miR-590-3p表达上调。通
过QPCR验证了10 例临床HCC肿瘤标本发现80%的HCC组织相对于癌旁组织miR-590-5p 和miR-590-3p 均同步显著上调。
QPCR结果进一步发现,HepG2、Hep3B、Huh7三株HCC细胞株相对于正常肝细胞株L-O2 miR-590-5p/3p同样表达上调。MTT
和软琼脂克隆形成结果显示,L-O2 分别过表达miR-590-5p 和miR-590-3p,细胞的增殖能力都显著增加（P<0.05）;而HepG2、
Hep3B、Huh7分别下调miR-590-5p和miR-590-3p的表达后,细胞的增殖能力也都显著降低（P<0.05）。Targetscan预测,PDCD4
和PTEN 分别作为miR-590-5p 和miR-590-3p 的潜在靶基因。萤光素酶报告系统以及western blot 结果显示miR-590-5p 和
miR-590-3p 可以分别直接下调靶基因PDCD4 和PTEN的表达（P<0.05）。进一步我们发现miR-590-3p 通过下调PTEN激活
PI3K-AKT信号通路,促进AKT1-S473的磷酸化水平。结论在HCC发展过程中miR-590扮演着重要的致癌因子角色,我们结
果发现miR-590的两个臂都具有促进肿瘤发生的生物学功能,它们分别通过靶向调节抑癌基因PDCD4和PTEN的表达来促进
HCC细胞的增殖和存活,并激活核心的PI3K-AKT肿瘤信号通路。由此可见miR-590 在HCC发生发展过程中具有重要的意
义,也可作为临床诊治潜在的新靶标。
     

结肠癌PTEN基因点突变的PCR-SSCP检测

①目的：探讨PTEN基因突变在结肠癌发病机制中的作用。②方法：采用聚合酶链反应(PCR)、结合单链构象多态性分析(PCR—SSCP)，对34例散发性结肠癌病人的癌组织及其癌旁组织的PTEN基因第5、7、8外显子进行点突变检测。③结果：34例结肠癌组织中有2例检测到PTEN基因突变，突变率为5．88％，其中exon7突变1例，exon8A突变1例，34例癌旁组织未检测到突变，二者差别无显著性(P=0.130)；低分化腺癌及黏液癌组织中PTEN基因突变的发生率为12．5％．中、高分化腺癌中PTEN基因突变的发生率为0，二者比较差异无显著性(P=0.214)。④PTEN基因的突变与结肠癌的发病、发展和恶化无关。     

PTEN蛋白在肝细胞肝癌中的表达及意义

目的 探讨PTEN蛋白在肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC)中的表达及其临床病理意义。方法 应用免疫组织化学SP法，用PTEN兔抗人多克隆抗体检测56例HCC组织，17例肝硬化组织和3例正常肝组织中PTEN蛋白的表达，同时结合临床病理进行分析。结果 56例HCC组织中，PTEN蛋白的阳性表达率为71％（40／56），其中低分化HCC的阳性率最低，为57％（12／21）。G1，G2级与G3级HCC组织中的PTEN蛋白阳性表达率具有显性差异（P＜0．05）。17例肝硬化组织中，阳性表达率为94％（16／17）。HCC与肝硬化组织中PTEN蛋白的表达具有显性差异（P＜0．05）。HCC组织中存在较高比例的PTEN蛋白表达缺失，且恶性程度最高的HCC组织中，PTEN蛋白的阳性表达率最低。结论 在HCC的发生发展过程中，PTEN蛋白表达缺失起着一定作用，且其缺失主要发生于肝癌晚期。这对判断患的预后具有一定的意义。     

Abnormal Change of p53 Gene in Gastric and PrecancerousLesions and APC Gene Deletion in Gastric Carcinoma and Near Tissues

Hypothesisoftumorsuppressorgenehadbeenproposedtwentyyearsag0['],butthefirstsuppressorgeneRb(retinoblas-toma)wasseparatedandcloneduntill986[z].Suppressorgene,includingp53andAPCgenes,n0whasbecomenew"hot"subjectintheareaoftumorresearch.p53genemutation,deleti0nandAPCgenedele-tionoccurredinsomehumantumorsandtheremaybesomerelationbetweenAPCgeneandp53genedeletion[3-7]-Inthispa-per,PCR-RFLP,PCR-SSCPmeth0dswereusedtoanalyzep53,APCgenealterationsingastriccancerandprecancerouslesi0nsinordertoin…