ENO1多克隆抗体的制备与初步鉴定

目的制备抗Enolase 1的兔多克隆抗体(pAb)并进行特异性鉴定。方法以人宫颈癌细胞系HeLa细胞cDNA为模板,构建重组表达质粒pET-32a-ENO1。His-ENO1融合蛋白在大肠杆菌中高效表达,纯化后作为免疫原制备兔多克隆抗体。采用ELISA、Western blot和免疫组化法鉴定抗ENO1兔多克隆抗体针对重组蛋白和天然蛋白的特异性。结果 His-ENO1融合蛋白在相对分子质量约29 000处呈现明显表达条带。Western blot鉴定表明,制备的抗ENO1兔多克隆抗体可特异性地识别ENO1重组蛋白和不同肿瘤细胞系HeLa、MCF7、HepG2和K562中的ENO1蛋白。免疫组化结果表明该多抗可特异性识别肾组织中的ENO1蛋白。结论成功制备出兔抗人ENO1抗血清,为进一步研究ENO1的功能奠定了基础。     

兔抗小鼠IL-23p19多克隆抗体的制备和鉴定

目的制备兔抗小鼠白细胞介素23p19(IL-23p19)多克隆抗体。方法利用分子克隆技术构建重组表达质粒p ET-16b-IL-23p19,转化大肠杆菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,SDS-PAGE及Western blot法分析鉴定蛋白,镍柱亲和层析纯化制备蛋白;以此蛋白为免疫抗原免疫新西兰大白兔,获得抗血清,并利用亲和层析法纯化抗血清,制备兔抗小鼠IL-23p19多克隆抗体;采用ELISA检测抗体效价;Western blot法检测抗体特异性。结果重组表达载体p ET-16b-IL-23p19构建正确且IL-23p19蛋白能够在大肠杆菌BL21(DE3)中有效表达。通过多次IL-23p19蛋白免疫新西兰大白兔,成功制备兔抗小鼠IL-23p19多克隆抗体。ELISA检测确定新西兰大白兔血清效价达1∶256 000,Western blot法证实兔抗小鼠IL-23p19多克隆抗体能特异性识别小鼠IL-23p19蛋白。结论成功制备了兔抗小鼠IL-23p19多克隆抗体,抗体具有高的效价和较好的特异性。     

人肠道病毒71型VPO蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的:原核表达并纯化人肠道病毒71型(EV71)VPO蛋白,免疫豚鼠制备多克隆抗体,并鉴定其用于EV71检测的反应性和特异性.方法:PCR方法扩增VPO基因,构建原核表达质粒pET-VPO并转化大肠杆菌,诱导表达并纯化VPO重组蛋白,免疫豚鼠制备抗VPO多克隆抗体,ELISA方法检测抗VPO抗体效价,细胞免疫荧光和Western blot方法鉴定抗体特异性.结果:VPO重组蛋白在大肠杆菌BL21中高效表达,制备的抗VPO抗体效价为1:106.细胞免疫荧光及Western blot检测结果显示,抗VPO多克隆抗体可以识别原核表达及EV71感染细胞中的VPO蛋白.结论:原核表达了EV71的VPO蛋白并制备出抗VPO多克隆抗体,为EV71的临床诊断、疫苗开发和分子病毒学研究提供了新的研究工具和手段.     

生殖支原体粘附素蛋白MgPa的表达及其多克隆抗体的制备与纯化

目的:制备并纯化生殖支原体(Mg)粘附素蛋白(MgPa)的多克隆抗体,为进一步探讨MgPa的生物学功能及其在Mg的临床诊断与预防方面的应用提供实验基础。方法:构建原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达生殖支原体粘附素蛋白(rMgPa′),重组蛋白经Western blot鉴定后用Ni-NAT亲和层析柱纯化,然后免疫新西兰兔以制备兔抗rMgPa′血清。用饱和硫酸铵法和溴化氰活化的琼脂糖4B亲和层析柱纯化多克隆抗体,并经Western blot鉴定免疫血清的特异性,用间接ELISA法检测免疫血清的效价。结果:在大肠杆菌中成功表达一分子量约为37kD的6×His-rMgPa′融合蛋白,免疫新西兰兔后获得了相应的多克隆抗体,利用饱和硫酸铵法和亲和层析法纯化后得到具有较高纯度的多克隆抗体,SDS-PAGE分析的结果表明所制备的多克隆抗体分子量约为150kD,Western blot结果表明制备的抗体具有较高的特异性,ELISA结果显示抗体的效价为1∶25600。结论:成功制备了高效价、高特异性的兔抗rMgPa′的多克隆抗体,为进一步研究MgPa的生物学功能、Mg的临床诊断与预防提供了重要的实验基础。     

人高迁移率族B1的表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

目的以原核表达的人高迁移率族B1(High mobihty group box 1,HMGB1)蛋白为免疫原免疫日本大耳白兔,制备其兔多克隆抗体并进行鉴定。方法将人HMGB1 cDNA克隆于原核表达载体pQE-80L并转化大肠杆菌DH5α,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导HMGB1表达,Ni^2 -NTA层析纯化后,用其免疫兔。以ELISA检测抗体效价,Western blot鉴定抗体特异性。结果成功表达并纯化了人HMGB1蛋白,纯化后纯度可达96％;ELISA法测定抗体效价为1：25600;Western blot结果显示所制备的抗体可特异性与人HMGB1蛋白结合。结论成功制备了兔抗人HMGB1多克隆抗体,为进一步研究HMGB1与相关疾病的关系打下了基础。     

线粒体铁转运蛋白2(mitoferrin 2/SLC25A28)的原核表达及兔多克隆抗体制备

目的 构建人线粒体铁转运蛋白2(mitoferrin 2/SLC25A28)的原核表达质粒，进行蛋白表达和纯化，制备兔抗多克隆抗体并进行初步鉴定。方法 构建pET28a(+)-SLC25A28-His原核表达质粒，转化至BL21(DE3)大肠杆菌，采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达。提取蛋白包涵体，并用8 mol/L尿素溶解，His-NTA柱纯化。获得纯化SLC25A28蛋白免疫新西兰大白兔制备SLC25A28多克隆抗体，Western blot法鉴定SLC25A28抗体特异性。结果 成功构建pET28a(+)-SLC25A28-His原核表达载体质粒，并在BL21(DE3)大肠杆菌中成功诱导表达SLC25A28蛋白，蛋白纯度约为90%, Western blot法证明制备的抗体能特异性识别小鼠睾丸组织中的SLC25A28蛋白。结论 成功对人SLC25A28进行了原核表达，并制备了具有特异性的兔抗人SLC25A28多克隆抗体。     

HPV16型E7重组蛋白的表达及其多克隆抗体的制备

目的制备人乳头瘤病毒(HPV)16型E7原核表达蛋白及其多克隆抗体。方法用PCR方法从宫颈癌组织中扩增HPV16 E7基因,克隆至pET21a(+)载体并构建pET21a(+)/HPV16 E7重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导后表达重组蛋白,用Ni-NTA亲和层析法纯化并经SDS-PAGE及Western blot分析鉴定;纯化的HPV16 E7重组蛋白免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体,用ELISA检测多克隆抗体的效价,并用Western blot法及免疫荧光技术分析多克隆抗体的特异性。结果 HPV16 E7重组蛋白可通过原核表达系统进行表达和纯化;通过兔免疫后可制备特异性的多克隆IgG抗体,效价达1∶30 000;经Western blot法和免疫荧光染色结果证实兔多克隆抗体可特异性识别HPV16 E7蛋白。结论成功进行了HPV16 E7原核表达并制备了HPV16 E7兔多克隆抗体。     

兔抗人APE1多克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备兔抗人脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶多克隆抗体并进行鉴定.方法:以纯化的全长APE1蛋白为抗原, 采用改良的快速免疫法制备兔抗人APE1多克隆抗体并进行特异性亲和纯化, ELISA、Western blot和免疫组化检测制备抗体的效价和特异性.结果:ELISA检测显示该抗体的效价达到1:128 000, 相对亲和力常数为8.96×10-6 mol/L.Western blot显示该抗体能与APE1蛋白特异性结合, 免疫组化检测显示阳性反应产物主要定位于细胞核.此外, 该抗体还可用于小鼠和大鼠组织APE1蛋白的检测.结论:制备的多克隆抗体特异性和效价良好, 不仅为今后深入研究人APE1蛋白的性质与功能提供了有用的实验工具, 还可用于检测小鼠和大鼠组织中APE1蛋白的表达.     

人肠道病毒71型VP0蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的:原核表达并纯化人肠道病毒71型(EV71)VP0蛋白,免疫豚鼠制备多克隆抗体,并鉴定其用于EV71检测的反应性和特异性。方法:PCR方法扩增VP0基因,构建原核表达质粒pET-VP0并转化大肠杆菌,诱导表达并纯化VP0重组蛋白,免疫豚鼠制备抗VP0多克隆抗体,ELISA方法检测抗VP0抗体效价,细胞免疫荧光和Western blot方法鉴定抗体特异性。结果:VP0重组蛋白在大肠杆菌BL21中高效表达,制备的抗VP0抗体效价为1∶106。细胞免疫荧光及Western blot检测结果显示,抗VP0多克隆抗体可以识别原核表达及EV71感染细胞中的VP0蛋白。结论:原核表达了EV71的VP0蛋白并制备出抗VP0多克隆抗体,为EV71的临床诊断、疫苗开发和分子病毒学研究提供了新的研究工具和手段。     

果蝇jumeaux蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

目的原核表达及纯化重组果蝇jumeaux(jumu)蛋白,制备大鼠抗果蝇jumu多克隆抗体。方法用RT-PCR方法扩增jumu基因,并将其克隆到原核表达载体pRSETA中,转化大肠杆菌BL21(DE3)并用IPTG诱导His-jumu融合蛋白的表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blot方法鉴定基因片段的正确性及蛋白表达的特异性后,用Ni-NTA亲和层析柱纯化带有6×His标签的融合蛋白,用纯化后的蛋白免疫SD大鼠制备多克隆抗体。以Western blot、免疫荧光染色法鉴定抗体的特异性,并用制备的抗体检测jumu在果蝇不同器官中的表达情况。结果成功构建了pRSETA-jumu原核表达质粒,jumu融合蛋白在大肠杆菌内高表达并纯化,免疫SD大鼠得到抗jumu多克隆抗体。用Western blot和免疫荧光染色检测发现制备的抗体有较强的特异性,并能检测内源性蛋白。通过免疫荧光染色发现jumu的表达存在组织特异性,且在唾液腺中的表达量最高。结论成功获得了抗jumu蛋白的特异性抗体,为进一步研究jumu蛋白的功能和作用机制奠定了基础。     

人类新基因CTRP4的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:构建新基因CTRP4的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化rhCTRP4-his蛋白,制备和鉴定小鼠抗人CTRP4多克隆抗体,为进一步研究人类新基因CTRP4的生物学功能奠定基础。方法:从pcDNA3.1-myc/his(-)B-hCTRP4重组载体中通过PCR的方法扩增CTRP4基因ORF中不含信号肽的目的基因片段,将得到的片段双酶切定向插入pET-32a中,构建原核表达载体pET-32a-hCTRP4。构建好的质粒在E.coli BL21(DE3)中进行诱导、表达,通过镍亲和层析柱纯化融合蛋白,SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度。将pcDNA3.1-myc/his(-)B-hCTRP4重组质粒和纯化好的融合蛋白依次免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体。并对抗体进行纯化、效价测定以及特异性鉴定。结果:DNA测序证实构建的pET-32a-hCTRP4重组表达载体含有hCTRP4编码序列,其序列比对分析与GenBank中公布序列一致,质粒在E.coli中表达相对分子质量(Mr)为35 000的目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析纯度为95%以上。ELISA法检测抗体效价为1∶20 000,Westernblot、免疫荧光细胞化学和免疫组化分析显示抗体能特异性识别重组hCTRP4以及天然状态hCTRP4蛋白。结论:成功构建了hCTRP4蛋白的原核表达载体,并获得较高纯度的融合蛋白,制备了高效价、高特异性的多克隆抗体。     

细胞分选蛋白17多克隆抗体的制备和鉴定及在小鼠体内的表达 

目的 制备细胞分选蛋白家族成员细胞分选蛋白17（SNX17）的多克隆抗体,为深入研究SNX17奠定基础。方法 PCR扩增编码人SNX17C端270个氨基酸的cDNA片段,DNA重组入原核表达载体pGEX-4T-1和pMal-C2x,转化大肠杆菌BL-21(DE3)菌株,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导分别表达GST-SNX17C端和MBP-SNX17C端融合蛋白。采用电泳纯化的GST-SNX17C端融合蛋白于第1天,第28天,第42天3次免疫新西兰白兔。采用亲和层析和分子筛纯化的MBP-SNX17C端融合蛋白,酶联免疫吸附（ELISA）法检测血清中多克隆抗体的效价,于第56天取兔全血,析出血清,纯化IgG。免疫印迹法检测SNX17兔多克隆抗体的有效性和特异性, 免疫印迹法检测小鼠30种器官中SNX17的表达。结果 成功构建了pGEX-4T-1/SNX17C端     

人肥大细胞类糜蛋白酶基因的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

目的:克隆人肥大细胞类糜蛋白酶cDNA,并进行原核表达,制备重组蛋白免疫家兔,制备兔抗类糜蛋白酶多克隆抗体。方法:用RT-PCR技术克隆类糜蛋白酶cDNA,用Gateway技术构建表达载体,以大肠杆菌为宿主,用L-阿拉伯糖诱导重组肥大细胞类糜蛋白酶的表达,经Ni-NTA-Agarose柱层析纯化后,以其为免疫原制备兔抗类糜蛋白酶多抗,并以间接ELISA测定抗体效价,以Westernblot鉴定抗体的特异性。结果:成功地克隆了人肥大细胞类糜蛋白酶cDNA,并在大肠杆菌BL21-AI中表达成功,用纯化的重组类糜蛋白酶为免疫原,免疫家兔制备了兔抗类糜蛋白酶抗体,ELISA结果显示效价达1:12800,Western blot分析表明该抗体能特异结合类糜蛋白酶。结论:以纯化的重组类糜蛋白酶为免疫原,成功地制备了效价及特异性较高的兔抗类糜蛋白酶抗体,为进一步建立简便的类糜蛋白酶检测方法及研究类糜蛋白酶生物学功能奠定了良好的基础。     

PIWIL4的克隆及其抗体制备和初步应用

目的 制备兔抗人PIWIL4的多克隆抗体,鉴定其特异性,并应用该抗体检测内源性PIWIL4在人各细胞系中的表达差异及细胞定位.方法 构建原核表达质粒pGEX-5X-1-PIWIL4,转化大肠杆菌BL21,PIWIL4蛋白经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.融合蛋白通过切胶纯化后免疫家兔制备抗体血清.以间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体效价,Western blot鉴定抗体特异性及检测PIWILA在各细胞系中的表达差异,免疫荧光染色观察PIWIL4的细胞定位.结果 成功构建原核表达质粒,表达并纯化PIWIL4蛋白.免疫大白兔后得到PIWIL4多克隆抗体,ELISA检测抗体效价为1:20 000,Western blot和免疫组化确定抗体具有高度特异性,并成功地应用该抗体检测到PIWIL4在人多种细胞系中的表达差异及细胞定位.结论 PIWIL4蛋白及其多克隆抗体的成功制备,为进一步研究PIWILA的生物学功能奠定了基础.     

PIWIL4的克隆及其抗体制备和初步应用

目的制备兔抗人PIWIL4的多克隆抗体,鉴定其特异性,并应用该抗体检测内源性PIWIL4在人各细胞系中的表达差异及细胞定位。方法构建原核表达质粒pGEX-5X-1．PIWIL4,转化大肠杆菌BL21,PIWIL4蛋白经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。融合蛋白通过切胶纯化后免疫家兔制备抗体血清。以间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测抗体效价,Westernblot鉴定抗体特异性及检测PIWIL4在各细胞系中的表达差异,免疫荧光染色观察PIWIL4的细胞定位。结果成功构建原核表达质粒,表达并纯化PIWIL4蛋白。免疫大白兔后得到PIWIL4多克隆抗体,ELISA检测抗体效价为1：20000,Westernblot和免疫组化确定抗体具有高度特异性,并成功地应用该抗体检测到PIWIL4在人多种细胞系中的表达差异及细胞定位。结论PIWIL4蛋白及其多克隆抗体的成功制备,为进一步研究PIWIL4的生物学功能奠定了基础。     

PIWIL4的克隆及其抗体制备和初步应用

目的 制备兔抗人PIWIL4的多克隆抗体,鉴定其特异性,并应用该抗体检测内源性PIWIL4在人各细胞系中的表达差异及细胞定位.方法 构建原核表达质粒pGEX-5X-1-PIWIL4,转化大肠杆菌BL21,PIWIL4蛋白经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.融合蛋白通过切胶纯化后免疫家兔制备抗体血清.以间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体效价,Western blot鉴定抗体特异性及检测PIWILA在各细胞系中的表达差异,免疫荧光染色观察PIWIL4的细胞定位.结果 成功构建原核表达质粒,表达并纯化PIWIL4蛋白.免疫大白兔后得到PIWIL4多克隆抗体,ELISA检测抗体效价为1:20 000,Western blot和免疫组化确定抗体具有高度特异性,并成功地应用该抗体检测到PIWIL4在人多种细胞系中的表达差异及细胞定位.结论 PIWIL4蛋白及其多克隆抗体的成功制备,为进一步研究PIWILA的生物学功能奠定了基础.     

人Fkbp19的多克隆抗体的制备

目的:制备针对人Fkbp19的多克隆抗体,为进一步研究Fkbp19基因的功能奠定基础。方法:利用鉴定正确的重组原核表达载体pET21a-Fkbp19,在大肠杆菌BL21-DE3中诱导表达,应用Ni-NTA亲和层析法获得纯度较高的原核表达蛋白,并免疫家兔制备多克隆抗体,Western blot及免疫荧光的方法检测抗体对乳腺癌细胞中内源性Fkbp19蛋白的识别能力。结果:成功地在大肠杆菌中实现了His-Fkbp19融合蛋白的表达,经纯化后免疫家兔得到了高滴度的多克隆抗体,该抗体可以用Western blot的方法检测内源性Fkbp19蛋白。结论:所制备的多克隆抗体可以用于Fkbp19的Western blot检测。     

抗人木糖基转移酶蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备兔抗人木糖基转移酶（XT-I）蛋白的多克隆抗体，并对其特异性进行鉴定。方法：应用DNAssist软件分析XT-I蛋白的抗原表位，从中选择优势抗原表位，通过引物优化设计，PCR拼接并扩增相应区域DNA片段，将其插入原核表达载体pGEX-4T-2，转化大肠杆菌ER2566，获得融合表达产物。将纯化的可溶性蛋白GST-XT作为抗原，免疫新西兰大白兔，制备抗XT-I蛋白的多克隆抗体，ELISA间接法测定效价。GST柱亲和层析法纯化抗体，采用Westem blot法鉴定该抗体的特异性和生物学活性。结果：确定XT-I的N端氨基酸序列QKHQPELAKKPPSRQKELLKRKLEQQEKGKG（175-205）为抗原表位，成功构建了重组表达载体，表达融合蛋白GST-XT，并以其为抗原，免疫新西兰大白兔，制备了抗XT-I蛋白的多克隆抗体。ELISA证实其效价高达1：640000：Western blot结果显示：该抗体可与人涎腺腺样囊性癌肺转移细胞株ACC-M中表达的XT-I蛋白特异性结合。结论：获得具有高特异性的兔抗人XT-I蛋白多克隆抗体，为涎腺肿瘤性肌上皮细胞蛋白多糖生物合成的研究提供了特异性抗体。     

果蝇硒蛋白D-SelK原核表达及多克隆抗体制备

目的:克隆编码果蝇硒蛋白D-SelK结构基因并在大肠杆菌中表达,纯化后制备兔抗D-SelK的抗体。方法:利用PCR从pGM-T-D-SelK质粒中扩增D-SelK基因,构建重组表达质粒pGEX-6p-1-D-SelK,以重组质粒转化E.coli BL21(DE3),筛选阳性重组菌株,IPTG诱导目的蛋白表达,通过变性、电泳纯化D-SelK蛋白,SDS-PAGE和Westem blot方法鉴定目的蛋白的表达;以表达的D-SelK蛋白免疫家兔,制备抗D-SelK的多克隆抗体并进行效价及特异性鉴定。结果:扩增了D-SelK基因,克隆于表达载体pGEX-6p-1中,PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,测序证实正确。经诱导在大肠杆菌中表达出目的蛋白,纯化后免疫家兔,能有效地刺激特异性抗体的产生,抗血清的效价达到1∶51 200以上,且具有良好的特异性。结论:已成功构建D-SelK基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;制备出兔抗D-SelK抗体,效价及特异性均良好,这为进一步研究功能特异性的D-SelK提供了有效的手段。     

annexinA2基因片段的克隆、表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的:构建人源annexinA2基因片段的原核表达载体,表达并纯化蛋白,制备多克隆抗体.方法:从GenBank(BC093056.1) 中获得人源annexinA2基因的cDNA序列并根据不含信号肽的编码序列设计引物,用PCR的方法扩增编码annexinA2基因部分序列,将其克隆到原核表达载体pET28a(+)中表达annexinA2的蛋白.表达的蛋白产物利用切胶回收的方法纯化,用His抗体进行Western blot 鉴定.用纯化的目的蛋白作为抗原免疫日本大耳白兔,获得annexinA2的抗血清,通过ELISA测定兔多克隆抗体的滴度.在CaSki细胞内采用细胞免疫荧光(CIF)和流式细胞术(FCM)检测内源annexinA2蛋白的表达,用于鉴定制备的多克隆抗体特异性.结果:通过双酶切及测序证实原核表达质粒pET28a(+)-annexinA2构建成功,可在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中诱导高表达,得到相对分子质量约28 000的annexinA2蛋白.纯化的蛋白免疫日本大白兔后,产生特异的高滴度的抗体(ELISA 滴度达 1:640 000).CIF和 FCM 结果显示抗血清与肿瘤细胞表达的annexinA2有高度特异的结合活性.结论:构建了annexinA2的原核表达质粒并获得高纯度的蛋白,免疫动物后,获得了特异、高效价的多克隆抗体,为人源annexinA2蛋白的生物学功能及肿瘤治疗的研究提供了实验基础.