基于高通量测序技术的实验动物沙门氏菌检测方法的建立与评价

目的建立基于高通量测序技术的实验动物沙门氏菌检测方法,应用于实验动物沙门氏菌的检测。方法提取小鼠粪便DNA样本,分别针对16S r DNA区域、23S r DNA区域、16S~23S r DNA IS、23S~5S r DNA IS、gyr B优选区域设计通用引物,对各个引物进行测试分析,优化扩增条件并建库,利用Illumina高通量测序技术检测区分42个样本中的沙门氏菌,评价该方法的特异性和稳定性。结果筛选发现沙门氏菌的菌种分类优选区域为gyr B基因,gyr B基因引物序列为FP5’-AACCACCGCAATCAGACCTT3’,FP5’-AGCCACGAAACCTTCACYA-3’。对引物进行优化,确定最佳扩增条件及样品上样量并正式建库,通过高通量测序和序列分析能检测出42个样品中极微量的沙门氏菌,检测方法稳定,灵敏度高,检测限可达0~102的cfu。结论本实验利用高通量测序技术,建立了一套完整检测实验动物沙门氏菌的生物体系,能检测出实验动物体内极微量的沙门氏菌,检测方法稳定性好,灵敏度高,可沿用至其他种类病原微生物的检测。     

多重PCR技术检测病毒性肝炎相关病毒的研究

目的建立一种快速、特异的可同时检测血中多种病毒性肝炎相关病毒的多重PCR方法。方法参照各病毒特异性核酸序列,按多重PCR引物设计的特殊要求设计引物,以核酸测序确证扩增产物,用标准病毒株及临床阳性血清样本DNA、RNA为模板优化PCR反应体系和反应条件,建立病毒性肝炎相关病毒多重PCR检测方法。应用建立的多重检测方法对120例ALT升高的血清标本进行多重检测,并将检测结果与单一PCR检测结果进行比较。结果采用多重PCR技术可同时对EBV、TTV、HBV、HSV 4种DNA病毒进行扩增;采用多重RT-PCR技术可同时对Cox-V、HEV、HCV 3种RNA病毒进行扩增。各病原体单一及多重扩增条带均清晰、均一,无非特异性扩增条带,片段长度与理论值一致;核酸测序证实各扩增产物属各病原体特异性基因片段。临床标本检测多重感染率为19.2%,与单一检测结果一致。结论建立的多重PCR检测方法稳定可靠,敏感度、特异度好,适用于病毒性肝炎相关病毒的实验室诊断与临床筛查。     

用于CMV启动子序列检测的绝对定量PCR方法的建立及验证

目的建立和验证用于CMV启动子序列检测的绝对定量PCR方法。方法针对CMV启动子序列设计探针和引物,用SYBR Green I熔解曲线分析引物扩增的特异性。对反应体系进行系统优化。用含CMV启动子的基因治疗产品和质粒标准品验证建立的PCR方法。结果上游引物为5’-AGACTTGGAAATCCCCGTGAGT-3’,下游引物为5’-CGTATTAGTCATCGC-TATTACCATGGT-3’,探针为5’-AACCGCTATCCACGCCCATTGATG-3’。扩增的特异性较强,反应体系优化后能达到较高的灵敏度。Ct值的变异系数都小于2%。标准曲线的定量范围为1.5×102～1.5×107拷贝,灵敏度为30拷贝。质粒标准品和基因治疗产品的扩增效率相近。结论建立了检测CMV启动子序列的绝对定量PCR方法。     

仙台病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立

目的: 建立一种快捷、灵敏的检测方法,即反转录-环介导等温扩增方法(RT-LAMP)用于仙台病毒(SeV)的检测。方法: 根据GenBank 公布的SeV序列,在其保守区域设计了多套LAMP引物,利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320C仪监测反应进程并筛选最佳引物、反应条件,建立对SeV核酸进行特异性扩增的RT-LAMP 检测方法,并可通过加入目测荧光检测试剂肉眼判断结果。对所建立的方法进行了敏感性、特异性评估并对92份样品进行了检测。结果: 该方法在63℃恒温下作用60min,SeV RNA获得了高效率的特异性扩增,与其余常见小鼠病毒无交叉反应;其敏感性高,最低检出量为2.1TCID50SeV,比RT-PCR方法高102倍。在反应结束后加入荧光检测试剂肉眼判断结果,与RealTime Turbidimeter LA-320 仪监测结果一致。通过对92份样品的RT-LAMP,RT-PCR和间接ELISA方法的检测比对,三者符合率为100%。 结论: 本研究建立的SV RT- LAMP 检测方法具有快速、特异、灵敏,操作简单的特点,具有良好的应用前景。     

自建两轮PCR法对低载量HBV DNA S区基因的扩增及实验条件优化

目的 探究低载量HBV DNA S区基因扩增的可行性并对实验条件进行优化,为隐匿性HBV感染(OBI)患者HBV DNA S区基因突变检测提供依据.方法 采用传统巢式PCR和自建两轮PCR方法扩增6例低HBV DNA载量(100～200 IU/mL)和22例更低HBV DNA载量(20～99 IU/mL)的血清样本中HBV DNA S区基因,并对引物序列、引物量、PCR产物模板稀释倍数、退火温度、PCR反应循环数、PCR总反应体系等条件进行优化.PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后,切割目的条带凝胶进行克隆测序,然后对克隆测序结果进行核酸序列BLAST比对确认.结果 设计3对巢式PCR引物(P1～P3),扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化后,6例低HBV DNA载量的血清样本中仅2例经巢式PCR扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,22例更低HBV DNA载量样本无一例扩增成功.自建两轮PCR法设计了P4～P15共12对引物,扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化并筛选出P13为最佳引物后,6例低HBV DNA载量的血清样本全部扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列;15例(15/22,68.18％)更低HBV DNA载量的样本扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,经PCR产物克隆测序均证实为HBV DNA S区基因,该15例样本中HBV DNA载量最低为20.1 IU/mL.结论 基于引物P13自建的两轮PCR法更适用于低载量HBV DNA S区基因的扩增,扩增效率和特异性均优于传统巢式PCR;扩增产物可进一步应用于OBI者HBV DNA S区基因序列突变分析.     

3种致病菌MCSP的序列分析及其在细菌检测和鉴定中的应用

目的建立一种利用MCSP的PCR扩增产物快速检测和鉴别细菌的方法.方法分析3种致病菌MCSP序列,针对不同细菌的MCSP的冷休克域的基因序列,设计了一对通用PCR引物,直接以细菌体为模板,相同条件下同时扩增多种细菌的MCSP基因序列.结果对Touchdown PCR条件进行优化后,同时扩增出3种细菌MCSP基因序列,经过电泳和基因测序,确认PCR扩增产物即为扩增靶序列.结论具有高度同源性不同种细菌的MCSP基因片段之间存在足够的碱基差异,将细菌鉴别至种,甚至鉴别至属.与16s rRNA相比较更具有实用价值.与基因芯片技术相结合,提供了一种快速检测和鉴别诊断细菌的方法.     

奇异变形杆菌、洛菲氏不动杆菌16s rRNA 3'-23s rRNA 5'间序列的克隆及测序

目的：对奇异变形杆菌、洛菲氏不动杆菌16s rRNA3’～23s rRNA 5’间序列（16S～23S rRNA intergenic spacer region，ISR）进行克隆测序，为分子探针技术鉴定两菌奠定基础。方法：针对临床常见致病菌16s rRNA3’～23s rRNA5’间序列两端的16S及23SrRNA保守序列设计PCR扩增的通用引物，对两菌进行扩增，利用PMD-18 T Vector质粒对两菌的PCR产物进行T载体克隆构建，测序后申报Genbank。结果：两菌的通用引物扩增产物构建的T载体克隆，测序结果经Blast分析，确定为两菌的ISR序列，申报Genbank获得接收。结论：成功的对奇异变形杆菌、洛菲氏不动杆菌ISR序列进行了克隆测序，该序列可以用于两种菌的通用引物PCR扩增技术鉴定。     

Alu-反向PCR检测HIV-1整合位点方法的建立

目的建立Alu-反向PCR检测整合型HIV-1DNA的实验方法。方法收集18例HIV-1感染者及12例健康者的抗凝血标本,根据整合型HIV-1DNA的特点设计引物,第一轮PCR5’端引物来自于人类保守的Alu序列,3’端引物来自于HIV-1gag序列,扩增片段包含了整合位点上游的人类基因组DNA序列和整合的HIV-1DNA序列。经PstⅠ酶切后进行自身片段环化,以此为模板设计针对HIV-1LTR和gag保守区域引物,进行巢式PCR。结果 16例HIV-1感染者成功扩增出目的片段,12例健康者均为阴性。结论本实验建立的检测整合型HIV-1的方法为进一步研究HIV病毒储藏库机制提供了参考。     

2种PCR方法扩增盐藻肌动蛋白基因3'旁侧序列比较

目的：比较扩增盐藻肌动蛋白基因3’旁侧序列的2种PCR方法。方法：用pvuⅡ、EcoR Ⅴ和StuⅠ3种限制性内切酶消化盐藻基因组DNA后，供2种PCR用，一种是连接介导法PCR(LMPCR)，与用人工合成的适配子相连并用适配子引物和盐藻肌动蛋白基因特异引物扩增未知序列；另一种是反向PCR(IPCR)，酶切后的DNA自身环化做模板，用2对基因特异引物反向扩增。结果：2轮PCR后，LMPCR中得到大量的非特异扩增产物，测序结果发现许多产物是由适配子引物AP2单独扩增引起。而反向PCR在得到pvuⅡ和Stu Ⅰ消化的自连文库中扩增得到2．5kb特异产物，经测序发现，片段两侧为基因特异引物，部分序列与已知序列相一致。Southern也进一步证实了IPCR扩增片段来源于盐藻基因组DNA。结论：IPCR技术在克隆基因旁侧序列时优于LMPCR方法。     

猪伪狂犬病病毒PCR检测方法的初步建立

目的 建立猪伪狂犬病病毒(PrV)的PCR检测方法 .方法 根据PrV gB基因序列,应用primer 5.0软件自行设计、合成一对引物进行PCR反应,优化反应条件,建立检测 PrV的PCR方法 ,并应用于临床样品的检测.结果 以PrV上海株细胞培养物DNA为模板,扩增出263 bp的特异性条带,对扩增产物进行克隆测序和BLAST在线比对,与 GenBank中PrV的gB序列一致.对临床样品进行PCR检测,与病毒分离结果 一致.结论 所建立的PCR方法 敏感、特异,可用于实验用猪伪狂犬病病毒的快速检测.     

寨卡病毒基因序列分析及核酸检测方法

目的 分析寨卡病毒基因组序列特征,建立寨卡病毒的核酸检测方法.方法 构建81种虫媒传播黄病毒和寨卡病毒的系统进化树,比较寨卡病毒与登革病毒4型、日本脑炎病毒的核酸和氨基酸序列差异,分析亚洲型和非洲型寨卡病毒基因变异位点,尤其是中国的4株输入性寨卡病毒基因序列.通过比较亚洲型和非洲型寨卡病毒全基因组核酸序列,设计一组寨卡病毒实时荧光定量PCR检测的引物和探针,并检测其敏感性与特异性.结果 81种虫媒传播黄病毒中,寨卡病毒与Spondweni、Kedougou病毒同源性最近.全基因组核酸序列比较结果显示寨卡病毒与登革病毒4型的同源性比日本脑炎病毒更近,而氨基酸序列比较结果显示寨卡病毒与日本脑炎病毒的同源性更近.与传统亚洲型寨卡病毒比较,广东GD01株有5个氨基酸突变位点,广东GDZ16001株有3个,浙江ZJ03株有6个,赣县VE Ganxian株有33个.所设计的PCR引物和探针对质粒标准品检测呈阳性,检测下限为100拷贝/mL,对细胞培养的寨卡病毒RNA检测呈阳性,而对登革病毒1～4型和日本脑炎病毒检测呈阴性.结论 寨卡病毒与Spondweni病毒同源性最近,赣县VE Ganxian株的高变异显示寨卡病毒正在快速变异.本研究设计的PCR引物和探针可用于亚洲型和非洲型寨卡病毒株检测,具有较高的敏感性和特异性.     

一种基于NASBA技术的新型快速肠道病毒检测方法的应用研究

目的: 基于核酸等温扩增技术(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)荧光分子信标探针检测技术,进行肠道病毒的快速检测与辅助诊断?方法:根据Genebank上肠道病毒5′端非编码区序列,设计特异性引物与捕获探针,应用纳米技术对商品化磁珠进行偶联,NASBA方法进行扩增,NucliSens读数仪检测,荧光定量RT-PCR方法进行验证,同时验证NASBA方法的特异性?灵敏度和重复性?结果:该方法对肠道病毒具有高度特异性,与RSV等呼吸道相关病毒均无交叉反应,反应体系具有很高的稳定性?结论:本研究应用的肠道病毒NASBA检测方法特异?灵敏?快速简便,适用于肠道病毒的日常监测和爆发疫情的应急诊断?     

多重荧光定量PCR检测婴幼儿腹泻病毒感染及其临床应用

目的:建立一种能同时检测婴幼儿腹泻粪便中常见病毒的多重荧光定量 PCR技术。方法:根据GenBank上几种病毒基因组保守序列设计引物序列,建立多重荧光定量PCR方法,对所建立的多重荧光定量PCR方法的特异性、灵敏性及重复性进行验证;并以所建立的方法对150例婴幼儿病毒性腹泻患者粪便标本进行检测。结果:所建立的多重荧光定量PCR检测方法具有很好的特异性,灵敏性检测可达102拷贝/mL,检测不同病毒核酸浓度各自的检测 Ct 值标准差均较小,变异系数均低于1.0%,具有较好的重复性;检测150 份粪便标本,多重荧光定量 PCR 的检出率为36%,胶体金方法检出率为38.67%,两者比较差别无统计学意义（χ2= 6.91,P > 0.05）。多重荧光定量 PCR方法中轮状病毒、腺病毒、诺如病毒、星状病毒的检出率分别为12.67%、6.00%、13.33%和4.00%,测序结果与已知病毒株基因都具有高度同源性。结论:所建立的多重荧光定量PCR方法快速、特异、灵敏,可以作为临床病原诊断的一个重要工具且适用于流行病学调查研究。     

全人源抗狂犬病病毒G蛋白单链抗体制备及中和活性鉴定

目的:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,筛选针对狂犬病病毒G蛋白不同表位的单链抗体(scFv)并鉴定其中和活性?方法:分离130例经狂犬病疫苗免疫接种志愿者的外周血淋巴细胞,提取总RNA,逆转录制备cDNA,构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库?以纯化的狂犬病病毒G蛋白包板筛选,对阳性克隆进行可溶性表达,并鉴定中和活性?结果:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,库容为5.0 × 107,经核酸序列分析,证实插入片段为scFv?经过5轮筛选,从富集的次级抗体库中随机挑出140个克隆,通过phage-ELISA鉴定得到4株核酸序列不同的scFv抗体?经His-Trap纯化后进行中和活性鉴定,获得1株有中和活性的scFv,其中和效价为0.13 IU/mg?结论:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,获得1株具有中和活性的抗狂犬病病毒G蛋白scFv抗体,为进一步研发狂犬病治疗性抗体药物奠定了基础?     

聚合酶链反应中引物的计算机辅助筛选

利用计算机辅助筛选聚合酶链反应（ＰＣＲ）的扩增引物。计算机程序根据引物筛选规则编写。这些规则包括：①引物的３′端均以ＧＣ对结尾；②引物的长度为１８～的个寡核苷酸；③每个引物中的ＧＣ含量为４５％～６０％；④避免引物自身及引物之间的同源性。由此我们设计了ＳＲＳ小鼠白血病病毒的引物，成功地扩增了３．４ｋｂ的大片段目的基因。实验结果证明了由此法筛选出来的引物的有效性和特异性。     

仙台病毒黑龙江省地方株的分离与鉴定

目的自本省普通级实验动物中分离并鉴定出仙台病毒地方毒株,为建立仙台病毒血清抗体检测方法奠定基础。方法通过鸡胚尿囊腔传代自普通级小鼠肺脏分离病毒,经血凝实验、血凝阻断实验和结构基因序列测定对分离得到的病毒进行鉴定;大量繁殖病毒并通过蔗糖密度梯度离心纯化,免疫动物制备阳性血清,用标准试剂盒检测阳性血清效价。结果自150份小鼠肺脏分离到2株有血凝性的病毒,经形态学、血清学和结构基因序列测定鉴定为仙台病毒,命名为SV-HLJ。SV-HLJ与标准毒株Fushimi核蛋白基因(N)的核苷酸、氨基酸同源性分别为99·6%和99·0%。结论分离并鉴定出了仙台病毒黑龙江省地方毒株,为检测试剂盒的研制奠定了基础。     

核酸试纸条快速检测蜡样芽胞杆菌entFM毒素基因方法的建立

目的 基于核酸试纸条技术,建立一种快速检测蜡样芽胞杆菌entFM毒素基因的方法。 方法 煮沸法提取蜡样芽胞杆菌DNA,以蜡样芽胞杆菌entFM毒素基因作为靶基因,采用NCBI primer-BLAST 5.0软件设计特异性引物并通过克隆转化鉴定PCR产物,建立并组装核酸试纸条,评价核酸试纸条的特异性、灵敏度和稳定性。 结果 蜡样芽胞杆菌DNA浓度为300 mg?L^－1,纯度约为1.60。PCR产物阳性条带经切胶回收、克隆转化和测序比对,与GenBank数据库中已登记的entFM相似性为100%。在pH值7.0条件下,每100 μL 胶体金溶液加入3.3 μg链霉亲和素浓度标记,质控线浓度为1.8 g?L^－1,检测线浓度为1 g?L^－1时,硝酸纤维素膜上质控线与检测线均可与PCR产物反应出现清晰的红色条带。按照最适条件组装成核酸试纸条,PCR产物6 μL,样品展开液100 μL,检测10 min后可观察结果。核酸试纸条特异性与电泳结果一致,仅蜡样芽胞杆菌为阳性结果,与金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌、大肠埃希菌和沙门氏菌皆无交叉反应,为阴性结果;灵敏度检测,核酸试纸条DNA质量浓度同时降至10^－3 mg?L^－1仍可准确检测,普通PCR电泳结果显示DNA质量浓度同时降至10^－1 mg?L^－1出现目的条带,核酸试纸条比普通PCR灵敏度提高100倍;稳定性检测,核酸试纸条在第6、9和12个月进行检测稳定性一致。 结论 建立的核酸试纸条检测蜡样芽胞杆菌entFM毒素基因灵敏度高、特异性强且具有良好稳定性,适用于快速鉴别蜡样芽胞杆菌entFM毒素基因。     

先天致畸病原体感染多重PCR检测方法的建立

目的：建立先天多种病原体（ＴＯＲＣＨ）感染的多重ＰＣＲ诊断方法。方法：选择弓形虫、巨细胞病毒、Ⅰ型和Ⅱ型单纯疱疹病毒特异性基因片段,按照多重ＰＣＲ引物设计的特殊要求,各设计一对引物,以四种病原体标准株为模板进行扩增。找出各病原体最佳扩增条件,再进行综合分析,最终找到一个理想的多得扩增条件,结果：各病原体扩增片段及多重ＰＣＲ扩增条带均清晰、均一,产量较高,无非特异扩增,片段长度与理论值一致;ＤＮＡ测     

乙型脑炎病毒TaqMan逆转录聚合酶链反应检测方法的建立

目的采用TaqMan技术，研究建立实时荧光逆转录聚合酶链反应技术（RT—PCR）检测乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis，JEV）的效果。方法根据JEV非结构蛋白基因NS3基因序列（GenBank序列号，U15763），结合生物学软件序列比对分析，设计1对特异性引物和TaqMan寡核苷酸探针，优化荧光RT～PCR反应条件后，以模板梯度稀释法及相关毒株对比扩增检验测定方法的敏感度和特异性。结果引物和探针最佳浓度均为0．20uM，复性温度为55℃。方法至少检测出1 copy／止病毒RNA，与流感、麻疹、腮腺炎、风疹、水痘等病毒均无交叉反应。从病毒核酸提取至完成检测仅需3hr左右。结论所建立的JEV病毒TaqMan荧光RT—PCR方法敏感特异，有助于JEV感染的实验室早期快速诊断。     

登革病毒Taqman双重荧光PCR分型研究

目的建立鉴定登革病毒型别的双重实时Taqman PCR反应体系,以准确快速鉴定登革病毒型别。方法根据GenBank上已发表的登革病毒四个型别的全基因序列,进行对比分析,分别设计登革病毒的四个型别引物和探针,登革I、III型探针用FAM-TAMARA标记,登革II、IV型探针用JOE-TAMARA标记。经过条件优化后,建立检测登革病毒I/II型和III/IV型的两套双重实时荧光RT-PCR方法,扩增四型登革病毒RNA、登革病毒阴性样本和登革病毒RNA稀释样本,检测方法的特异性、重复性和检测限性。结果通过设计筛选序列和优化反应条件,建立登革病毒I、II型和登革病毒III、IV型的双重荧光PCR反应体系,通过试验证明,所建立的方法具有良好的特异性、重复性和检测限性,能准确快速地对登革病毒进行分型。结论建立了一种快速双重荧光PCR方法能同时对登革病毒进行分型和鉴定。