Pfs25蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA的建立

目的:制备恶性疟原虫子孢子囊表面膜蛋白Pfs25的单克隆抗体( mAb),建立检测Pfs25蛋白的双抗体夹心ELISA方法.方法:纯化毕赤酵母表达的重组Pfs25蛋白,并免疫BALB/c小鼠,采用骨髓瘤细胞Sp2/0与免疫BALB/c鼠脾细胞杂交的细胞融合技术,通过间接ELISA检测获得分泌抗Pfs25抗体的阳性杂交瘤细胞株,通过免疫F1鼠诱生腹水,纯化腹水,并进行mAb的各项生物学鉴定.辣根过氧化物酶(HRP)标记纯化后的抗体,以4B7为包被抗体,1B4为酶标抗体,建立了双抗体夹心ELISA法.结果:获得3株抗Pfs25的杂交瘤细胞株,其中2株有良好的稳定性和特异性.并建立了双抗体夹心ELISA检测法,检测有效范围在0.07～1 mg/mL,其检测灵敏度为41.6 ng/mL.结论:成功制备抗Pfs25蛋白的单克隆抗体,并建立了一种可用于Pfs25蛋白检测的双抗体夹心ELISA法,为Pfs25蛋白制备传播阻断型疟疾疫苗奠定了基础.     

抗青霉素单克隆抗体的制备及初步应用

目的:制备抗青霉素的单克隆抗体(mAb)并建立双抗体夹心ELISA检测方法,对临床上引起青霉素过敏反应的过敏原青霉噻唑蛋白进行研究。方法:将半抗原青霉素和载体蛋白偶联后免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术建立稳定分泌抗青霉素mAb的杂交瘤细胞株。常规制备腹水,用辛酸-硫酸铵法纯化,并对纯化的mAb进行特异性鉴定。通过对不同抗体组合的分析和条件的优化,建立检测过敏原的双抗体夹心ELISA方法。结果:经细胞融合、筛选及克隆化,共获得9株稳定分泌抗青霉素mAb的杂交瘤细胞株,其中5株亲和力较高。建立了双抗体夹心ELISA相对定量检测方法,该方法灵敏度达到870 U/L,平均回收率为107.81%,批内变异系数平均为6.7%,批间变异系数平均为9.3%,可用于A群链球菌制剂中青霉噻唑蛋白的检测。结论:成功地制备了抗青霉素的mAb,并建立了相对定量检测青霉噻唑蛋白的双抗体夹心ELISA法。     

抗人生长转化因子15单克隆抗体制备及鉴定

目的:制备抗人生长转化因子15(GDF15)单克隆抗体(mAb)并鉴定其特性。方法:构建GDF15原核表达载体pGEX-4T-2-gdf15,诱导表达并纯化GST-GDF15融合蛋白。以该融合蛋白免疫BALB/c小鼠,取小鼠的脾细胞与同系小鼠Sp2/0骨髓瘤细胞常规融合,依次进行阳性杂交瘤细胞株的筛选及亚克隆,最终获得稳定分泌抗GDF15 mAb杂交瘤细胞株。以间接ELISA法检测抗体效价;Western blot鉴定抗体特异性;免疫共沉淀法初步检测在肝癌患者血清中GDF15表达水平。结果:获得1株稳定分泌抗人GDF15 mAb杂交瘤细胞株,命名为9G3;抗体免疫球蛋白亚类为IgG1,轻链为κ型;免疫共沉淀及质谱分析证实抗GDF15 mAb9G3能与肝癌患者血清中GDF15蛋白特异性结合并且GDF15水平在肝癌患者血清中较正常人显著升高。结论:成功制备了抗人GDF15mAb,为后期肝癌早期诊断试剂盒的开发奠定了良好的基础。     

抗鸡白细胞介素4单克隆抗体的制备及其鉴定北大核心CSCD

目的制备抗鸡白细胞介素4(ChIL-4)单克隆抗体(mAb)并进行鉴定。方法以重组鸡IL-4(GST-ChIL-4)作为免疫原免疫8周龄BALB/c小鼠,以重组蛋白His-ChIL-4作为检测抗原建立筛选阳性杂交瘤细胞株的间接ELISA;以有限稀释法制备稳定分泌抗ChIL-4 mAb细胞株;采用间接ELISA、间接免疫荧光法(IFA)以及Western blot法分析mAb的特异性。结果获得4株抗ChIL-4的mAb,分别命名为6A8、18F12、19F1、20G3,腹水mAb的ELISA效价为(1.6~6.4)×104;ELISA、IFA及Western blot结果显示该4株mAb均是特异针对重组ChIL-4的mAb,不具有识别重组牛IL-4、鸡γ干扰素(IFN-γ)等其他蛋白的能力。结论成功制备了抗ChIL-4的mAb。     

脑钠肽单克隆抗体的制备及临床应用研究

目的:制备抗脑钠肽(BNP32)单克隆抗体(mAb),并利用双抗体夹心ELISA法建立BNP抗原检测技术,应用于临床心脏患者脑钠肽水平的检测。方法:以基因工程原核重组表达BNP抗原免疫BALB/c小鼠,利用常规杂交瘤技术制备mAb,mAb经纯化和HRP标记后,利用双抗体夹心ELISA法筛选检测BNP32蛋白的最佳配对mAb,以其建立BNP32抗原检测技术,并与临床BNP检测的标准实验做平行比较。结果:成功筛选到16株稳定分泌抗BNP32mAb的杂交瘤细胞株,16株mAb的亚型分别为IgG1、IgG2a和IgM,并从中筛选出最佳mAb配对组合,该组合对BNP32蛋白的检测灵敏度为20ng/L。建立的双抗体夹心BNP检测ELISA法与临床BNP检测的标准实验平行比较具有很好的一致性(kappa值=0.828),两者没有统计学意义(P0.05)。结论:成功地建立了BNP32抗原的双抗体夹心ELISA法检测技术,并能够很好地运用于临床心衰患者BNP指标的检测。     

抗禽流感病毒M2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备抗禽流感病毒M2蛋白的单克隆抗体(mAb)并进行特性鉴定.方法:利用纯化的融合蛋白GST-M2免疫BALB/c小鼠,然后以GST-M2 和 GST分别作为ELISA抗原进行筛选,选择GST-M2抗原检测强阳性、GST抗原检测阴性的杂交瘤细胞进行克隆,建立能稳定分泌抗AIV M2 mAb的杂交瘤细胞株.mAb的效价采用间接ELISA和琼脂扩散试验(AGP)测定,用夹心ELISA测定Ig亚类,Western blot、抗原捕获ELISA、间接免疫荧光及免疫组化染色法检测 mAb 的特性.结果:得到4株分泌抗禽流感病毒M2蛋白的mAb的杂交瘤细胞株1E1、2F8、4E3 和 5D6,小鼠腹水中抗体的ELISA效价大于210×100、AGP效价大于1:4.抗体亚类鉴定1E1和4E3为IgG2a,2178和5G6为IgG2b.抗原捕获ELISA表明,2F8 wAb能与H5、H9亚型AIV发生特异性反应,而不能与鸡新城疫病毒(NDV)和鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)反应.IFA和免疫组化试验表明,2F8 mAb能够与感染了禽流感病毒的MDCK细胞以及鸡体组织细胞发生特异性结合.结论:本研究获得4株抗禽流感病毒M2蛋白的mAb,其中2F8mAb的效价高、特异性强,可作为检测AIV方法的核心试剂.     

缺失PRD的人FOXP3单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备抗脯氨酸富含区缺失的人FOXP3(△PRD-hFOXP3)的单克隆抗体(mAb),为进一步研究人FOXP3各片段功能奠定基础。方法:以纯化的△PRD-hFOXP3重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞Sp2/0进行常规融合,经筛选及克隆化建立2株分泌抗△PRD-hFOXP3的mAb杂交瘤细胞株;利用核型分析、间接ELISA及Western blot分别鉴定了杂交瘤的细胞核型、抗体的效价与特异性。结果:筛选到2株可稳定分泌抗△PRD-hFOXP3的mAb的细胞株,分别命名为1A2和3A11;2株抗体均为IgG1,腹水经ELISA方法测定效价均可达1∶105;Western blot显示这2株杂交瘤分泌的mAb均可与△PRD-hFOXP3蛋白特异性地结合。结论:成功获得2株能稳定分泌特异性抗△PRD-hFOXP3的mAb的杂交瘤细胞株,可用于人FOXP3的进一步研究及相关试剂的研发等。     

鼠抗人天冬酰胺合成酶(ASNS)单克隆抗体的制备与肿瘤表达检测

目的:通过制备抗天冬酰胺合成酶(ASNS)单克隆抗体(mAb),检测ASNS在不同肿瘤中的表达,探索其表达的意义。方法:诱导表达融合蛋白MS2-ASNS,以纯化的MS2-ASNS蛋白免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与Sp2/0融合,以融合蛋白MS2-ASNS和MS2-PAI通过间接ELISA双筛和有限稀释克隆化,获得稳定分泌抗ASNS mAb的杂交瘤细胞株。间接ELISA和Western blot方法对抗ASNS mAb效价、特异性及亲和力进行鉴定。IHC技术检测ASNS在肿瘤细胞株及肿瘤组织中的表达。结果:获得2株能高效分泌特异性抗ASNS mAb的杂交瘤细胞株F4-15、F4-16,亚类均为IgG2a。间接ELISA结果表明制备的抗体有很好的特异性,抗体效价均达到1∶5×105。Western blot鉴定抗ASNS mAb能特异性识别肿瘤细胞株中的ASNS。IHC技术检测天然ASNS在胃癌细胞株SGC-7901和肝癌细胞株SMMC-7721、BEL-7402、HepG2及肺癌、食管癌组织中均为胞质表达。结论:制备的抗ASNSmAb特异性强,可检测ASNS在多种肿瘤中的表达,为进一步研究ASNS在特定肿瘤如中线鼻/鼻型NK/T细胞淋巴瘤中的表达奠定了基础。     

蛇毒C型凝集素类似蛋白Agkisacutacin单克隆抗体的制备和鉴定

目的:制备并鉴定抗蛇毒C型凝聚素类蛋白Agkisacutacin的单克隆抗体(mAb)。方法:以Agkisacutacin蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,通过常规的细胞融合方法制备抗Agkisacutacin蛋白的mAb。用间接ELISA法检测杂交瘤细胞分泌mAb的稳定性。用荧光染色法做杂交瘤细胞的核型分析。用Western blot检测mAb的特异性。结果:获得3株可稳定分泌抗AgkisacutacinmAb的杂交瘤细胞株。结论:成功制备了抗Agkisacutacin的mAb,为检测Agkisacutacin蛋白作为新型抗血栓药物的体内代谢规律的方法和研究抗血栓的机制提供了重要的工具。     

抗SARS冠状病毒M蛋白片段单克隆抗体的制备与初步鉴定

目的:制备抗SARS冠状病毒(SARS-CoV)M蛋白N端1~43氨基酸(aa)单克隆抗体(mAb),并对其特性进行初步鉴定。方法:用纯化的SARS-M/GST融合蛋白抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗M蛋白片段的mAb。用间接ELISA法筛选能分泌抗M蛋白片段mAb的杂交瘤细胞株。Westernblot和间接ELISA鉴定所获mAb的特异性,并用小鼠mAb亚类测定试剂盒检测所获的mAbIg亚类。为分析mAb识别位点,进一步将M蛋白片段截短为部分重叠的2段表达,以Westernblot初步定位mAb识别位点。结果:获得1株可分泌特异性抗SARS-CoVM蛋白片段的mAb杂交瘤细胞株(3H9),Ig亚类鉴定为IgG2a,轻链为κ型。Westernblot显示其mAb可特异识别SARS-CoVM蛋白N端1~43aa,间接ELISA证实mAb可与包被于聚苯乙烯微孔板上的SARS病毒全蛋白抗原发生特异性反应,其识别位点位于M蛋白N端16~28aa。结论:成功获得1株抗SARS-CoVM蛋白N端1~43aamAb杂交瘤细胞,并初步定位其识别位点。     

β-Netrin抗原表位的分析及其抗体的制备与鉴定

目的:制备抗神经细胞突起生长诱向因子(β-Netrin)的多克隆抗体(pAb)和单克隆抗体(mAb),并对其特异性进行鉴定。方法:应用GoldKey软件分析人βNetrinC末端结构域氨基酸的序列(共114个氨基酸),确定抗原表位并人工合成多肽。然后采用碳化二亚胺法,将合成肽与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联作为抗原,免疫BALB/c小鼠。取免疫小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞常规融合,依次进行HAT选择培养,间接ELISA法筛选阳性的杂交瘤细胞并克隆化。对分泌的mAb的效价、Ig亚类(型)及特异性,分别用间接ELISA和Westernblot进行鉴定。同时,通过免疫细胞化学染色鉴定抗体的特异性。另外,以偶联的分子免疫新西兰白兔,制备抗β-Netrin的pAb,用Westernblot鉴定其特异性。结果:以确定的此16个氨基酸的序列NH2-FRGKRT-LYPESWTDRG-COOH作为抗原表位,以人工合成多肽与BSA偶联作为免疫原,获得3株可稳定分泌特异性抗β-Netrin mAb的杂交瘤细胞。免疫细胞化学染色结果表明,这3株抗体均能特异性地识别细胞中的抗原。另外,制备了高效价的抗β-Netrin的pAb,并能特异性地识别原核表达的β-Netrin蛋白。结论:采用人工合成多肽作为半抗原成功地制备出抗β-Netrin的pAb和mAb。     

抗HCV HVR1模拟合成肽单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的:制备抗-HCV高变区1(HVR1)合成肽单克隆抗体(mAb),并对其特性进行鉴定。方法:以固相合成的HCV HVR1合成肽与牛血清白蛋白(BSA)偶联后,免疫8周龄的BALB/c小鼠。采用杂交瘤技术,取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合,制备抗-HCV HVR1 mAb。经HAT、HT选择培养及有限稀释法进行克隆化后,用相关的试剂盒鉴定小鼠mAb的Ig亚类;经中和抑制后用ELISA法检测mAb的特异性;用间接ELISA法检测mAb腹水的效价及相对亲和常数。结果:获得1株可分泌抗-HCV HVR1合成肽特异性mAb的杂交瘤细胞1A9G9F11。该株mAb的Ig亚类为IgG3;腹水效价为3.125×10-5;相对亲和常数为1.0×106L/mol。该株mAb与HBsAg、HBeAg、HBcAg、HAAg、牛血清白蛋白、酪蛋白和胸腺5肽均无交叉反应,与HCV HVR1合成肽-牛血清白蛋白出现特异性反应。结论:成功地建立了1株可分泌抗-HCV HVR1 mAb的杂交瘤细胞1A9G9F11,为进一步的实验研究提供了重要的制剂。     

抗血小板膜糖蛋白Ib单克隆抗体的制备、鉴定及其功能的初步研究

目的:制备抗人血小板膜糖蛋白Ib(GPIb)单克隆抗体(mAb),并进行生化鉴定与初步探讨其临床应用.方法:采用血小板免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合.经间接ELISA法筛选和克隆化培养,获得1株抗人GPIb mAb的杂交瘤细胞,纯化其腹水获得mAb;免疫双扩散鉴定其抗体亚类;流式细胞术和免疫放射法鉴定...     

抗牛碱性成纤维细胞生长因子单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的：制备抗牛碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)单克隆抗体(mAh)，并鉴定其亚类，建立ELISA检测bFGF含量的方法。方法：应用基因重组的牛bFGF免疫BALB／c小鼠，通过细胞融合，建立分泌抗bFGF mAh的杂交瘤细胞株。应用免疫沉淀技术鉴定抗bFGF mAh的亚类；应用基因重组的牛bFGF免疫青紫蓝兔，制备抗bFGF的多抗血清；将抗bFGF mAb及兔抗血清用Protein A亲和层析纯化后，建立检测bFGF含量的ELISA方法。结果：共获得3株稳定分泌抗bFGF mAb的杂交瘤细胞株；它们所分泌的mAb均为IgG1；采用夹心ELISA法检测bFGF的敏感性达ng水平。结论：抗bFGF mAb(IgG1)和多克隆抗体制备为临床应用及相关研究提供了必要的试剂。     

抗人可溶性间皮素相关蛋白单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的:制备鼠抗人可溶性间皮素相关蛋白(SMR)的单克隆抗体(mAb),鉴定其生物学特性。方法:应用计算机通过综合预测对间皮素(MSLN)进行B-细胞表位预测。合成相应肽段并免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备mAb,利用免疫细胞化学和Western blot分析对所制备的mAb进行鉴定。结果:综合预测方法分析间皮素的抗原表位可能于153-162、282-292及471-481氨基酸残基或其附近,选择性合成了可能性最高的位于471-481氨基酸残基的可溶性间皮素相关蛋白表位,制备了mAb(2H10),经免疫细胞化学和Western blot分析该抗体具有较高的特异性。结论:成功地制备了鼠抗人可溶性间皮素相关蛋白的mAb(2H10),该抗体具有较高的特异性,为进一步利用ELISA对可溶性间皮素相关蛋白进行检测奠定了基础。     

抗创伤弧菌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及特性鉴定

目的:制备高效、特异的抗创伤弧菌的单克隆抗体(mAb),并进行特性鉴定。方法:用创伤弧菌菌体蛋白抗原免疫小鼠,利用杂交瘤细胞融合技术,制备抗创伤弧菌的杂交瘤细胞株。用ELISA法及Western blot等筛选、鉴定其与创伤弧菌溶血素蛋白(vvhA)及其他重要海洋细菌的交叉反应性和效价。结果:共获得5株抗创伤弧菌的mAb,鉴定结果表明,5株mAb均具有良好的特异性和免疫反应性。结论:获得5株抗创伤弧菌的特异性mAb,为建立创伤弧菌快速检测试剂盒提供了重要制剂。     

阪崎肠杆菌单克隆抗体的制备与特性鉴定

目的:制备抗阪崎肠杆菌的单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定。方法:采用灭活的阪崎肠杆菌菌体为抗原,免疫BALB/c小鼠,取血清效价高的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,mAb亚类检测试剂盒鉴定单克隆抗体的亚型,通过Western blot和间接ELISA法鉴定该单克隆抗体的特性、效价及mAb相对亲和力。结果:获得2株能稳定分泌抗阪崎肠杆菌mAb的杂交瘤细胞株,分别命名为1H7、2B12,抗体Ig亚类分别为IgG1和IgG2b;交叉反应显示单抗具有良好的特异性;ELISA分析表明制备的单抗效价在1×107～2×107,相对亲和常数达109L/mol,染色体鉴定分别为104和106条,符合杂交瘤细胞的特性。结论:抗阪崎肠杆菌单克隆抗体的成功制备为其快速检测方法的建立奠定了基础。     

抗人LSECtin单克隆抗体的制备与初步鉴定

目的:制备抗肝脏、淋巴结窦内皮细胞C型凝集素(LSECtin)单克隆抗体(mAb),并进行特性鉴定。方法:采用原核表达的LSECtin免疫BALB/c小鼠,以间接ELISA法筛选分泌特异性mAb的杂交瘤细胞,采用蛋白印迹、间接免疫荧光、流式细胞术和免疫组化染色法鉴定mAb的特异性。结果:共获得8株可稳定分泌mAb的杂交瘤细胞株。mAb的Ig亚类均为IgG,效价达1∶106~1∶107。这些mAb均可识别转染3T3细胞膜上的人LSECtin,6株mAb可特异识别肝脏窦内皮细胞。结论:成功地制备8株抗LSECtin的mAb,经免疫印迹、流式细胞术和免疫组化染色检测,这些mAb的特异性良好,为研究LSECtin的功能提供了有力的试剂。     

抗二羰基/L-木酮糖还原酶单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗人二羰基/L-木酮糖还原酶(Dicarbon-yl/L-xylulosereductase,DCXR)的单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定。方法将正常成人肝组织匀浆离心并分离线粒体,用线粒体总蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备mAb,并通过间接ELISA法、Westernblot及免疫组化的方法对mAb进行特性鉴定,通过免疫沉淀联合质谱、Uni-ZAPXR表达文库筛选鉴定抗原。结果获得1株可稳定分泌抗人DCXRmAb的杂交瘤细胞系。mAb的Ig亚类(型)为IgG1(κ),该mAb可用于ELISA检测、Westernblot、免疫组化和免疫沉淀实验。结论成功制备了抗人DCXR的mAb,为DCXR的研究提供了有力的工具。