抗禽流感病毒M2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备抗禽流感病毒M2蛋白的单克隆抗体(mAb)并进行特性鉴定.方法:利用纯化的融合蛋白GST-M2免疫BALB/c小鼠,然后以GST-M2 和 GST分别作为ELISA抗原进行筛选,选择GST-M2抗原检测强阳性、GST抗原检测阴性的杂交瘤细胞进行克隆,建立能稳定分泌抗AIV M2 mAb的杂交瘤细胞株.mAb的效价采用间接ELISA和琼脂扩散试验(AGP)测定,用夹心ELISA测定Ig亚类,Western blot、抗原捕获ELISA、间接免疫荧光及免疫组化染色法检测 mAb 的特性.结果:得到4株分泌抗禽流感病毒M2蛋白的mAb的杂交瘤细胞株1E1、2F8、4E3 和 5D6,小鼠腹水中抗体的ELISA效价大于210×100、AGP效价大于1:4.抗体亚类鉴定1E1和4E3为IgG2a,2178和5G6为IgG2b.抗原捕获ELISA表明,2F8 wAb能与H5、H9亚型AIV发生特异性反应,而不能与鸡新城疫病毒(NDV)和鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)反应.IFA和免疫组化试验表明,2F8 mAb能够与感染了禽流感病毒的MDCK细胞以及鸡体组织细胞发生特异性结合.结论:本研究获得4株抗禽流感病毒M2蛋白的mAb,其中2F8mAb的效价高、特异性强,可作为检测AIV方法的核心试剂.     

降钙素原抗原的表达及其抗体的制备与初步鉴定

目的:构建降钙素原(PCT)原核表达载体, 制备其多克隆抗体(pAb)和单克隆抗体(mAb), 并进行特性鉴定.方法:以甲状腺癌细胞cDNA文库为模板, 构建重组表达质粒pGEX- 4T-1-PCT和PET-32a-PCT, 在大肠杆菌中分别表达GST-PCT和His-PCT融合蛋白, 用His-PCT免疫家兔和BALB/c小鼠制备兔pAb和鼠mAb.通过ELISA法测定抗人PCT抗血清效价;用Western blot、 间接免疫荧光鉴定pAb的特异性.使用间接ELISA法筛选分泌特异性抗PCT的杂交瘤细胞株, 采用Western blot和间接免疫荧光鉴定mAb的特异性. 结果:构建了重组表达质粒pGEX- 4T-1-PCT和PET-32a-PCT, 并在大肠杆菌中表达、纯化.经ELISA法测得抗人PCT抗血清效价是1∶ 256 000.制备的抗PCT兔多克隆抗体可特异地识别重组和天然的PCT蛋白.获得8株可稳定分泌抗PCT的杂交瘤细胞株, 可识别重组人PCT蛋白, 其中有4株可特异性结合TT细胞质中的天然蛋白. 结论: 成功地制备出兔抗人PCT抗血清和8株抗PCT的mAb, 为进一步研究PCT在严重的细菌感染和脓毒症中的病理及生理作用奠定了基础.     

河南华溪蟹金属硫蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备小鼠抗河南华溪蟹金属硫蛋白(MT)单克隆抗体(mAb),并鉴定其免疫学特性。方法分别利用小泛素样修饰蛋白(SUMO)融合表达系统和碱性磷酸酶(phoA)分泌表达载体制备河南华溪蟹重组蛋白SUMO-MT和His-MT,以SUMO-MT为免疫抗原、His-MT为检测抗原,利用杂交瘤技术建立抗河南华溪蟹MT mAb杂交瘤细胞株。采用间接ELISA测定mAb腹水效价,Western blot法、Dot-ELISA分析mAb的特异性。结果成功建立了2株稳定分泌抗MT蛋白的mAb杂交瘤细胞株,分别命名为mAb-MT2和mAb-MT3,均属于IgG1亚类。腹水效价分别为1∶500 000、1∶1000 000,Western blot和Dot-ELISA结果证实2株mAb均能特异性识别重组MT和内源性MT。结论成功制备了具有较高特异性的河南华溪蟹MT mAb。     

S100A9蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的制备S100A9重组蛋白及其单克隆抗体(mAb),并对抗体进行特异性鉴定。方法以成人肝cDNA表达文库为模板,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-S100A9和pET-32a-S100A9。融合蛋白在大肠杆菌中表达,纯化后以His-S100A9作为免疫原制备鼠mAb。采用ELISA和Western blot法鉴定筛选抗体。挑取杂交瘤细胞株制备腹水并纯化,采用Western blot法和间接免疫荧光染色鉴定mAb的特异性。结果 GST-S100A9和His-S100A9融合蛋白均成功构建表达。共筛选到抗S100A9杂交瘤细胞18株,其中15株在Western blot检测中与重组蛋白呈强阳性反应,3株呈弱阳性反应。2株可识别肝癌组织间隙液中的S100A9天然蛋白。结论成功地制备出多株抗S100A9的mAb。     

抗MRSA-PBP2a转肽酶区蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

目的:制备和鉴定抗MRSA-PBP2a转肽酶区蛋白单克隆抗体(mAb),初步建立检测PBP2a的乳胶凝集方法。方法:以基因工程重组PBP2a转肽酶区蛋白为抗原,免疫BALB/c小鼠,制备鼠源性mAb,间接ELISA鉴定IgG亚类、腹水效价及亲和常数,Western blot检测mAb的特异性,用所得mAb致敏聚苯乙烯乳胶,建立检测PBP2a的乳胶凝集方法。结果:筛选出2株能稳定分泌抗PBP2a mAb的杂交瘤细胞株F1和F2,免疫球蛋白亚类均为IgG1类;腹水效价为0.5×106~1×106,亲和力常数分别为1.57×108M-1和5.43×109M-1。Western blot显示F1、F2抗体均能有效识别重组PBP2a转肽酶区蛋白及MRSA临床分离株中的天然PBP2a,用mAb F2建立了乳胶凝集法,敏感性达1mg/L。结论:获得2株特异性好、亲和力高、能稳定分泌抗PBP2a mAb的杂交瘤细胞株,为研制MRSA快速鉴定试剂盒奠定了良好的基础。     

Clusterin抗原的表达、抗体制备及其初步鉴定

目的:制备Clusterin(CLU)多克隆和单克隆抗体(mAb),并进行特性鉴定.方法:以成人肝cDNA表达文库为模板,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-CLU和PET-32a-CLU.GST-CLU融合蛋白在大肠杆菌中表达,被作为免疫原制备兔多抗和鼠mAb.采用ELISA法和Western blot鉴定抗CLU抗血清在重组蛋白和天然蛋白中的特异性.采用Western blot,间接免疫荧光,免疫组化鉴定mAb的特异性.结果:GST-CLU融合蛋白在相对分子质量(Mr)约54 000处呈现明显表达条带.Western blot鉴定表明,制备的抗CLU兔多克隆抗体可特异地识别成人肝总蛋白中Mr约52 000和58 000的CLU蛋白.获得9株可稳定分泌抗CLU的杂交瘤细胞株可识别重组人CLU蛋白,其中有2株可特异性结合HepG2细胞质中的蛋白,4株可特异性结合成人肝脏组织肝细胞质中的蛋白.结论:成功地制备出兔抗人CLU抗血清和9株抗CLU的mAb,为进一步研究CLU在肿瘤中的功能奠定了实验基础.     

牛肿瘤坏死因子α小鼠单克隆抗体的制备

目的制备抗牛肿瘤坏死因子α(BoTNF-α)的单克隆抗体(mAb)。方法以原核系统表达的带有组蛋白(His)标签的重组牛TNF-α蛋白(rHis-BoTNF-α)为免疫原,带有谷胱甘肽硫转移酶(GST)标签的重组牛TNF-α蛋白(rGST-BoTNF-α)为检测原,采用杂交瘤细胞技术制备mAb。Western blot法检测mAb与rHis-BoTNF-α和rGST-BoTNF-α的反应性,间接ELISA检测mAb效价、特异性以及mAb与商品化重组BoTNF-α的反应性,流式细胞术分析mAb识别天然抗原的活性。结果成功筛选出7株稳定分泌抗rBoTNF-αmAb的杂交瘤细胞株。结果证明7株mAb均具有良好的反应性及特异性。流式细胞术分析显示mAb 4G4具有良好的识别天然抗原的活性。结论成功制备了抗BoTNF-α的mAb。     

鼠抗人天冬酰胺合成酶(ASNS)单克隆抗体的制备与肿瘤表达检测

目的:通过制备抗天冬酰胺合成酶(ASNS)单克隆抗体(mAb),检测ASNS在不同肿瘤中的表达,探索其表达的意义。方法:诱导表达融合蛋白MS2-ASNS,以纯化的MS2-ASNS蛋白免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与Sp2/0融合,以融合蛋白MS2-ASNS和MS2-PAI通过间接ELISA双筛和有限稀释克隆化,获得稳定分泌抗ASNS mAb的杂交瘤细胞株。间接ELISA和Western blot方法对抗ASNS mAb效价、特异性及亲和力进行鉴定。IHC技术检测ASNS在肿瘤细胞株及肿瘤组织中的表达。结果:获得2株能高效分泌特异性抗ASNS mAb的杂交瘤细胞株F4-15、F4-16,亚类均为IgG2a。间接ELISA结果表明制备的抗体有很好的特异性,抗体效价均达到1∶5×105。Western blot鉴定抗ASNS mAb能特异性识别肿瘤细胞株中的ASNS。IHC技术检测天然ASNS在胃癌细胞株SGC-7901和肝癌细胞株SMMC-7721、BEL-7402、HepG2及肺癌、食管癌组织中均为胞质表达。结论:制备的抗ASNSmAb特异性强,可检测ASNS在多种肿瘤中的表达,为进一步研究ASNS在特定肿瘤如中线鼻/鼻型NK/T细胞淋巴瘤中的表达奠定了基础。     

抗鸡γ-干扰素单克隆抗体的研制及初步鉴定

目的:制备抗鸡γ-干扰素单克隆抗体(mAb)。方法:应用淋巴细胞杂交瘤技术,以重组菌BL21(DE3)(pET-ChIFN-γ)表达产物的包涵体作为抗原免疫BALB/c鼠,以纯化的GST-ChIFN-γ作为检测抗原,制备抗鸡γ-干扰素mAb;采用ELISA、Dot-ELISA和Westernblot鉴定mAb的特异性。结果:获得2株可稳定分泌抗鸡γ-干扰素mAb的杂交瘤细胞株1G5、5E3,其Ig亚类均为IgG2a,腹水mAb1G5、5E3的ELISA效价分别为1∶1600000,1∶120000。在Dot-ELISA试验中,这2株mAb均只与表达His-ChIFN-γ及GST-ChIFN-γ的重组大肠杆菌反应,与未表达这2种IFN-γ的其他8种菌株均不发生反应。在蛋白质印迹试验中,2株mAb均能与融合蛋白GST-ChIFN-γ、His-ChIFN-γ发生反应,出现特异性条带。结果表明,mAb1G5、5E3是针对鸡γ-干扰素的特异性mAb。结论:成功地制备抗鸡γ-干扰素的mAb,它们在免疫检测、免疫细胞功能分析和免疫调节研究等方面有应用价值。     

抗果蝇ECP蛋白单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的:制备抗果蝇ECP蛋白的单克隆抗体(mAb)并进行特性鉴定。方法:用大肠杆菌表达并纯化的GST-ECP融合蛋白,免疫6~8wk的雌性BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA筛选和克隆化培养制备杂交瘤细胞系。用间接ELISA及Western blot等方法对mAb的Ig亚类(型)、腹水效价及特异性进行鉴定。结果:获得1株杂交瘤细胞株,命名为8G9。Ig亚类(型)鉴定表明,此株mAb为IgG1(κ型)。腹水mAb的效价为1∶1×105。Western blot分析表明,该株mAb可与果蝇的幼虫、蛹及成虫组织中表达的ECP特异性结合,可特异性的识别ECP抗原的231~300aa区段。结论:获得1株能稳定分泌抗ECP mAb的细胞株,为进一步研究ECP的功能奠定了基础。     

鼠抗人CD20单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备CD20融合蛋白及制备CD20的单克隆抗体(mAb),并对其进行特性鉴定.方法:以人单核细胞cDNA文库为模板,构建重组表达质粒pGEX- 4T-1-CD20 (即CD20-GST) 和pET-32a-CD20(即CD20-His).以融合蛋白CD20-GST为免疫源免疫BALB/c雌性小鼠制备(mAb),用间接ELISA法测定抗体的效价,Western blot、免疫荧光鉴定其特异性及免疫组化染色法对mAb相应的抗原进行组织定位.结果:CD20-GST 和CD20-His蛋白在大肠杆菌中可高效表达,经纯化后可获得高纯度的CD20蛋白,经细胞融合得到1株稳定分泌CD20抗体的杂交瘤细胞株,Western blot和免疫组化显示抗CD20 mAb与CD20蛋白具有良好的反应性.结论:成功制备高纯度CD20蛋白并以此为抗原制备了1株能够稳定分泌抗人CD20的鼠mAb的杂交瘤细胞株BD11F4,为进一步研究CD20对非霍奇金淋巴瘤的诊断治疗提供基础.     

小鼠肝炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

[目的]制备并鉴定小鼠肝炎病毒(MHV)N蛋白的单克隆抗体(mAb).[方法]以Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达的重组N蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠,应用常规杂交瘤技术将免疫小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤进行融合,用间接ELISA方法筛选分泌N蛋白mAb的杂交瘤细胞系.并用Western blot和IFA方法对所获得的mAb进行鉴定.[结果]共获得4株稳定分泌抗N蛋白mAb的杂交瘤细胞系,其亚类鉴定2株为IgG2a,1株为IgG2b,1株为IgG1,轻链均为k型.经鉴定4株mAb均能与重组N蛋白发生特异性反应.[结论]成功获得了特异性抗MHV N蛋白的mAb,为进一步研究N蛋白的结构功能及建立诊断学方法奠定了基础.     

缺失PRD的人FOXP3单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备抗脯氨酸富含区缺失的人FOXP3(△PRD-hFOXP3)的单克隆抗体(mAb),为进一步研究人FOXP3各片段功能奠定基础。方法:以纯化的△PRD-hFOXP3重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞Sp2/0进行常规融合,经筛选及克隆化建立2株分泌抗△PRD-hFOXP3的mAb杂交瘤细胞株;利用核型分析、间接ELISA及Western blot分别鉴定了杂交瘤的细胞核型、抗体的效价与特异性。结果:筛选到2株可稳定分泌抗△PRD-hFOXP3的mAb的细胞株,分别命名为1A2和3A11;2株抗体均为IgG1,腹水经ELISA方法测定效价均可达1∶105;Western blot显示这2株杂交瘤分泌的mAb均可与△PRD-hFOXP3蛋白特异性地结合。结论:成功获得2株能稳定分泌特异性抗△PRD-hFOXP3的mAb的杂交瘤细胞株,可用于人FOXP3的进一步研究及相关试剂的研发等。     

抗流感嗜血杆菌外膜蛋白P6单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗流感嗜血杆菌外膜蛋白P6的单克隆抗体(mAb)并进行鉴定。方法以重组P6蛋白腹腔免疫BALB/c小鼠,常规细胞融合技术制备杂交瘤细胞株;间接ELISA筛选阳性细胞克隆并检测染色体数目;测定细胞培养上清的mAb效价及特异性,鉴定mAb的免疫球蛋白类、亚类及抗原结合表位。结果获得2株抗流感嗜血杆菌外膜蛋白P6的杂交瘤细胞株α2G3和γ2C4,染色体众数分别为103与95;间接ELISA结果证明细胞培养上清最高效价分别为1∶256和1∶512,未出现与其他种类细菌的交叉反应;α2G3为IgG2b、γ2C4为IgM,均为κ型;两者可能识别P6蛋白不同表位。结论成功制备了抗流感嗜血杆菌外膜蛋白P6的mAb。     

具有中和活性抗人类腺病毒单克隆抗体的制备、鉴定及应用

目的:制备具有中和活性抗人类腺病毒(HAdv)单克隆抗体(mAb),并进行鉴定与应用.方法:以活的人类腺病毒3型(HAdv-3)滴鼻免疫BALB/c鼠,用细胞融合技术制备抗HAdv 的mAb细胞株,采用中期分裂相秋水仙素阻抑法对mAb细胞株染色体进行分析;使用鼠mAb亚型鉴定试剂盒进行抗体亚型鉴定,通过ELISA、Western blot和间接免疫荧光技术进行特异性鉴定.建立HAdv-3感染动物模型,用获得的HAdv-3 mAb进行保护性研究.结果:细胞融合率为86%,抗HAdv抗体阳性孔率为51.4%.鉴定1株杂交瘤细胞(1A4),染色体数为98条,抗体亚类属IgG2a/κ,抗体腹水ELISA效价达10~(-5).ELISA、Western blot和间接免疫荧光证实该mAb特异性好.该mAb对HAdv-3感染动物有保护性作用.结论:成功地制备具有中和活性的抗HAdv mAb.该mAb识别的是HAdv六邻体蛋白,对HAdv-3感染动物有保护作用.     

抗肠出血性大肠杆菌O157:H7 EspA单克隆抗体的制备及其特性鉴定

目的:制备抗肠出血性大肠杆菌O157:H7EspA单克隆抗体(mAb)。方法:以重组EspA蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术并且联合间接ELISA筛选只针对EspA的杂交瘤细胞株。以Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定mAb的Ig亚类,ELISA、Western blot及免疫荧光技术鉴定抗体的免疫学特性。结果:获得3株稳定分泌抗EspA杂交瘤细胞的mAb,Ig亚型分别为IgG1κ型、IgG2aκ型、IgG2bκ型。Western blot和免疫荧光分析表明,3株杂交瘤细胞制备的mAb腹水都能特异地结合重组EspA蛋白和识别O157:H7的EspA成分。结论:成功地制备了抗肠出血性大肠杆菌O157:H7EspA的mAb,并证明了该mAb的生物学活性,为深入研究肠出血性大肠杆菌O157:H7的致病机制提供新的手段。     

抗人ILT-4单克隆抗体制备及初步鉴定

目的: 制备抗人ILT4分子单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定.方法: 应用淋巴细胞杂交瘤技术, 制备小鼠源性抗人ILT4 mAb.用间接ELISA法测定腹水mAb的效价.以Western blot测定mAb的抗原结合活性.通过流式细胞术(FCM)对mAb结合转染细胞表面及天然细胞表面ILT4分子的活性进行鉴定.结果: 获得7株分泌抗ILT4 mAb的杂交瘤细胞株.ELISA法测定腹水mAb的效价均达1×10-6, 7株mAb均为IgG1(κ).Western blot结果显示, 3株mAb与人ILT4有良好的结合活性.用转染细胞及U937细胞做FCM分析发现另外4株mAb可结合真核表达的及天然的ILT4分子.结论: 获得7株能特异性识别ILT4分子的mAb, 为研究ILT4分子的组织分布和功能研究提供了可靠的实验手段.     

诺如病毒表达衣壳蛋白单克隆抗体的制备、鉴定和初步应用

目的:建立能稳定分泌抗诺如病毒(Norovirus)N蛋白的单克隆抗体(mAb)细胞株, 制备抗诺如病毒核衣壳蛋白的mAb, 为诺如病毒的早期快速检测及致病机制的研究提供实验材料.方法:用E.coli表达的GⅡ组广州株NVgz01(DQ369797)Norovirus-N蛋白免疫BALB/c小鼠, 通过PEG使小鼠脾细胞和Sp2/0细胞融合, 使用HAT选择性培养基培养融合细胞, 用间接ELISA和Western blot测定mAb的效价、免疫球蛋白亚型和mAb的特异性, 并将各mAb之间进行配对.结果:通过细胞融合和克隆化, 共筛选出4株分泌抗Norovirus-N蛋白抗体的杂交瘤细胞株N2C3、 N7C2、 N4B1、 N8A9.间接ELISA和Western blot检测结果表明, 这4株mAb都可以与E.coli表达的GⅡ组广州株Norovirus-N蛋白产生特异性反应, 并且能与天然粪便标本中的GⅡ组Norovirus产生特异性反应.配对结果显示N2C3和N7C2之间配对, 对表达蛋白和天然病毒都具有较强的检测灵敏度.结论:获得了诺如病毒GⅡ组特异性mAb, 为制备免疫诊断试剂盒及致病机制的研究奠定了基础.     

抗小鼠SHP-1、SHP-2和SHIP三种蛋白酪氨酸磷酸酶单克隆抗体的制备及鉴定

为了制备抗小鼠蛋白酪氨酸磷酸酶的单克隆抗体(mAb),分别以SHP-1、SHP-2和SHIP重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,通过B淋巴细胞杂交瘤技术制备抗相应磷酸酶的mAb。用Western blot检测mAb对重组蛋白和细胞中天然磷酸酶的反应性。共获得12株可稳定分泌抗磷酸酶mAb的杂交瘤细胞株。其中6株可分泌抗SHP-1 mAb(LX-SHP1.1~LX-SHP1.6),3株可分泌抗SHP-2 mAb(LX-SHP2.1~LX-SHP2.3),3株分泌抗SHIP mAb(LX-SHIP1~LX-SHIP3)。LX-SHP1.2~LX-SHP1.6,LX-SHP2.1和LX-SHP2.3,以及LX-SHIP2和LX-SHIP3可应用于相应重组蛋白的Westernblot检测。LX-SHP1.5,LX-SHP2.3,以及LX-SHIP2在EL-4细胞及原代T细胞相应天然磷酸酶分子的Western blot检测中有较好的实验效果。     

抗人乳腺癌候选抑制蛋白1单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备抗人乳腺癌候选抑制蛋白1(BCSC-1)蛋白单克隆抗体(mAb),并对其特异性进行鉴定。方法:构建原核表达载体pET-30a-BCSC-1,在原核表达系统E.coliBL21(DE3)中表达重组人BCSC-1蛋白。超声洗涤纯化重组蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和同系小鼠的骨髓瘤细胞Sp2/0进行常规融合,通过有限稀释法进行克隆和间接ELISA筛选,获得分泌小鼠抗人BCSC-1蛋白mAb的杂交瘤细胞株,通过ELISA、Western blot等方法检测其特异性。将真核重组表达载体pcDNA3.1/v5-HisB-BCSC-1转染入乳腺癌MCF-7细胞,通过免疫组化确定了人BCSC-1蛋白的表达。结果:成功构建了原核表达载体pET-30a-BCSC-1,经IPTG诱导表达出了重组人BCSC-1蛋白,主要以包涵体的形式存在沉淀中。用纯化的重组BCSC-1蛋白免疫小鼠后经融合筛选得到1株稳定分泌抗BCSC-1的mAb杂交瘤细胞株。通过ELISA、Western blot、免疫组化等方法鉴定,抗BC-SC-1的mAb能与BCSC-1蛋白特异性结合。结论:成功制备了小鼠抗人BCSC-1的mAb。