靶向Pokemon基因shRNA重组质粒的构建及其对HepG2细胞生长的影响

目的:观察携带shRNA的重组质粒对肝癌细胞HepG2增殖及凋亡的影响,并初步探讨其分子机制.方法:设计3对针对Pokcmon基因不同位点的shRNA片段的真核表达载体,脂质体介导转染肝癌细胞株HepG2细胞.RT-PCR及Western blot检测转染前后Pokemon mRNA及蛋白质的 表达,MTT和流式细胞仪分析转染后细胞增殖及凋亡的变化,RT-PCR检测其可能的下游因子β-catenin及H-ras的表达.结果:成功构建含shRNA片段的重组质粒,依次命名为pshRNA1、2、3.转染HepG2细胞后,Pokemon基因的mRNA及蛋白质表达水平明显下调,以pshRNA2最强,抑制率分别为75.2%(RNA水平)和72.6l%(蛋白质水平).MTT显示pshRNA2可明显抑制细胞增殖;流式细胞仪测定转染后细胞凋亡增加;RT-PCR显示下游因子H-ras的表达明显降低(P＜0.05),而β-catenin的表达没有变化(P＞0.05).结论:采用RNAi技术可以特异性阻断Pokemon 基因的表达;Pokemon基因有促进肝癌细胞株增殖及抑制其凋亡的作用,该效应可能与下调其下游因子H-ras的表达有关.     

核心蛋白聚糖在HepG2细胞中的表达及作用

目的 构建分泌型核心蛋白聚糖(DCN)真核表达载体,并观察其在肝癌细胞HepG2中的表达和抗肿瘤作用.方法 应用PCR技术扩增DCN全长基因eDNA片段,与pcDNA3.1载体连接,并转化到大肠杆菌中扩增获得重组载体,应用双酶切、PCR以及测序鉴定此重组载体,脂质体介导转染HepG2,经G418筛选建立稳定转染细胞株,采用RT-PCR、免疫组化检测其表达.MTT检测细胞增殖活力,流式细胞仪分析细胞周期.结果 RT-PCR可见转染组细胞mRNA表达明显增多,免疫组化可见转染组细胞DCN蛋白表达明显增高.细胞生长曲线显示转染组细胞生长缓慢,G,期细胞显著增多.结论 本方法可成功建立稳定转染DCN的HepG:细胞株,并证实DCN能够抑制HepG:细胞株的生长.     

靶向cyclinE小干扰RNA对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响

目的:以cyclinE基因编码区为靶位,构建表达小干扰RNA(siRNA)的质粒载体,观察转染后对HepG2细胞的影响.方法:针对cyclinE基因序列构建表达siRNA的真核表达载体pSilencer3.1-H1hygro,利用脂质体Metafectene转染CyclinE基因高表达的肝癌细胞株HepG2.流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率,MTT法检测细胞增殖活性,RT-PCR和Western blot法观察转染后细胞cyclinE基因表达.结果:成功构建了表达siRNA的真核质粒载体,转染后cyclinE基因mRNA及蛋白表达水平分别下降了79%和65%.结论:靶向cyclinE基因的siRNA可有效沉默HepG2细胞高表达的cyclinE基因,从而抑制肝癌细胞的增殖并促进凋亡.     

肺癌肿瘤抑制物1转染HepG2肝癌细胞及对细胞周期、细胞凋亡及caspase-3的影响

目的 将已构建完成的携带增强绿色荧光蛋白基因的TSLC1真核表达载体转染到HepG2细胞中,观察其对HepG2肝癌细胞的作用.方法 脂质体Lipofectamine 2000介导重组载体转染到HepG2肝癌细胞中,经G418筛选建立稳定转染细胞株,分别采用RT-PCR、免疫组化法和Western印迹法检测其表达;同时检测细胞周期、凋亡及caspase-3酶活性.结果 与对照组比较,RT-PCR方法可见转染组细胞TSLC1 mRNA表达明显增多(P＜0.05),免疫组化和Western印迹法可见转染组细胞TSLC1蛋白表达明显增高(P＜0.05);流式细胞仪检测发现转染组G_0/G_1期细胞显著增多,而S期细胞明显降低(P＜0.05),转染组细胞凋亡比例明显比对照组多(P＜0.05);caspase-3酶活性显著增多(P﹤0.05).结论 本实验成功建立了稳定转染TSLC1的HepG2细胞株,并证实TSLC1能够阻滞细胞周期,促进凋亡及提高caspase-3酶活性.     

siRNA对脂多糖诱导下HepG2细胞caspase-8基因的干扰及对凋亡的影响

目的:研究针对人caspase-8基因mRNA的siRNA(small interfering RNA)表达载体,观察其转染人肝癌细胞HepG2后,细胞caspase-8基因表达的变化,及其对细胞凋亡的影响。方法:采用针对人caspase-8基因mRNA的siRNA表达质粒,由脂质体介导瞬时转染HepG2细胞株,并采用脂多糖(LPS)诱导HepG2细胞凋亡,RT-PCR、Westernblot测定caspase-8表达。结果:针对人caspase-8基因mRNA的siRNA表达质粒能抑制caspase-8mRNA和蛋白表达;转染后HepG2细胞体外生长明显受到抑制。结论:siRNA表达质粒能有效地抑制HepG2细胞中caspase-8的表达,抑制细胞凋亡并促进生长。为进一步探究肝衰竭基因治疗提供了实验依据。     

pEGFP-prohibitin真核表达重组质粒的构建及其在人肝癌细胞系HepG2中的表达

目的构建pEGFP-prohibitin真核表达质粒,并鉴定其在pEGFP-prohibitin转染的人肝癌细胞系HepG2中的表达。方法采用高保真PCR扩增获得prohibitin的全长编码序列,构建真核表达载体pEGFP-prohibitin,并通过基因测序和BLAST比对鉴定重组质粒;提取pEGFP-prohibitin和pEGFP-N1质粒,并通过TurboFect转染试剂转染HepG2细胞;采用实时PCR和Western印迹方法分别在mRNA水平和蛋白质水平检测prohibitin蛋白在转染后HepG2细胞中的表达。结果成功构建pEGFP-prohibitin真核表达重组质粒,并将其成功转染HepG2细胞;pEGFP-prohibitin转染组细胞prohibitin的表达量比空载转染组和未转染组细胞明显增加。结论成功构建真核表达载体pEGFP-prohibitin,并证明抗增殖蛋白prohibitin在pEGFP-prohibitin转染人肝癌细胞系HepG2中高表达。     

重组核心蛋白聚糖转染对HepG2细胞周期、凋亡以及P21表达的影响

目的将已构建完成的分泌型核心蛋白聚糖（DCN）真核表达载体转染到HepG2中并检测其表达同时研究其抗肿瘤作用的机制。方法脂质体介导分泌型DCN真核表达载体转染HepG2细胞，经G418筛选建立稳定转染的细胞株，采用RT-PCR、免疫组化检测其表达。MTT检测细胞增殖活力，流式细胞仪分析细胞周期，RT-PCR方法检测P21^WAF1/CIP1mRNA表达情况。结果RT-PCR可见转染组细胞DCNmRNA表达明显增多，免疫组化可见转染组细胞DCN蛋白表达明显增高。细胞生长曲线显示转染组细胞生长缓慢；G1期细胞显著增多；P21^WAF1/CIP1mRNA表达增高。结论本研究成功建立稳定转染DCN的HepG2细胞株，证实DCN通过阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡和提高P21^WAF1/CIP1蛋白抑制HepG2的生长。     

携带融合基因穿梭质粒的构建及在人肝癌细胞中的表达

构建携带胸苷激酶(tk)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因穿梭质粒,并观察其在肝癌细胞系HepG2细胞中的表达。应用基因重组技术,构建EGFP与tk的融合表达穿梭质粒载体,经限制酶切鉴定和测序分析,脂质体转染将其导入HepG2中,48h后用荧光显微镜观察荧光的表达,RT-PCR法检测融合蛋白tk和EGFP的mRNA表达,四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验检测转染融合蛋白载体后不同浓度的更昔洛韦(GCV)对HepG2细胞的细胞毒作用。酶切鉴定和测序分析证实重组质粒中插入融合目的基因片断及载体DNA大小、方向和插入位点正确,在转染此穿梭质粒的HepG2细胞中检测到绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR检测到融合蛋白tk和EGFP的mRNA表达;GCV对转染了携带tk与EGFP融合基因穿梭质粒载体有明显的细胞毒作用。成功构建携带tk与EGFP融合基因穿梭质粒载体,转染人肝癌细胞株HepG2中tk和EGFP的独立表达没有受到影响,该载体可利用绿色荧光蛋白作为报告基因监测tk的表达并可用于肝癌的自杀基因治疗。     

RNA介导survivin基因沉默对肝癌细胞HepG2细胞株凋亡及增殖的影响

目的观察靶向封闭survivin基因对肝癌细胞株HepG2增殖和凋亡的影响,探讨survivin基因在肝癌的发生、发展中的作用。方法设计1对survivin-siRNA,体外转录制备siRNA。应用脂质体转染技术将survivin-siRNA转染肝癌细胞株HepG2,应用有荧光标记的非特异性小分子siRNA检测转染效率;RT-PCR检测survivin-mRNA水平;SABC免疫组化染色技术检测survivin蛋白表达情况;MTT法检测细胞生长情况;流式细胞仪分析细胞凋亡。结果转染survivin-siRNA可使HepG2细胞survivin-mRNA水平下降53.8%,并可使survivin蛋白表达明显减少;转染survivin-siRNA对细胞增殖及细胞凋亡无明显影响(P>0.05)。结论抑制survivin表达对肝癌细胞株HePG2凋亡及增殖无明显影响。提示survivin在肝癌细胞增殖与调亡调控中所起的作用可能并非是关键性的。     

重组腺病毒载体介导HOSM基因对肝癌细胞体外增殖的抑制作用

目的:构建含人抑瘤素M(human oncostatin M,HOSM)基因的复制缺陷型重组腺病毒载体AD-HOSM,观察其对人肝癌细胞株HepG2在体外生长抑制情况.方法:通过同源重组方法构建含HOSM基因的缺陷型重组腺病毒载体AD-HOSM,用报告基因AD-GFP检测腺病毒的对人肝癌细胞系的转染效率:人肝癌细胞株HepG2转染含HOSM基因的缺陷型腺病毒载体AD-HOSM后,用RT-PCR法检测外源HOSM基因在其中的表达;台盼蓝染色、细胞计数法检测AD-HOSM对HepG2的体外增殖抑制情况.结果:成功构建了重组腺病毒载体AD-HOSM,AD-HOSM对肝癌细胞HepG2有较高的转染效率,并且转染效率与病毒的剂量呈正相关.AD-HOSM感染HepG2细胞48h,HOSM基因在转染细胞能有效的表达.体外试验示,AD-HOSM转染的细胞的增殖却受到明显的抑制.结论:重组腺病毒介导HOSM表达能有效抑制HepG2在体外的增殖,提示重组腺病毒介导的HOSM基因治疗可能成为肝癌治疗的候选方案.     

pCMV-tag2B—HBX质粒的构建和表达

目的构建乙型肝炎病毒X基因（HBX）的真核表达质粒，诱导并鉴定其表达。方法将克隆获得的HBX全长cDNA片段插入带有报告基因的真核表达质粒pCMV-tag2B，构建HBX的重组表达载体pCMV-tag2B—HBX，经DNA测序证明HBX的cDNA片段的插入方向和其全长cDNA的碱基顺序，将重组质粒转染HepG2细胞系，诱导其表达，用Western Blot进行鉴定。结果构建的重组表达载体pCMV-tag2B-HBX经双酶切表明有相应大小的DNA片断，序列分析证实为正确的有完整读码框的X基因，用脂质体转染法可将pC-MV-tag2B-HBX导入HepG2细胞并成功表达，目的蛋白经Western Blot鉴定具有生物学活性。结论成功构建了HBX真核表达质粒pC-MV-tag2B-HBX，重组质粒能表达具有生物学活性的HBX蛋白，为研究HBX的功能打下了基础。     

短发夹状RNA对人肝癌细胞环氧合酶-2的抑制作用

目的:构建针对人环氧合酶-2(COX-2)基因编码区的短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体质粒,观察其在不同时间点对人不同肝癌细胞株COX-2表达的影响.方法:以人COX-2mRNA编码区作为RNA干扰靶点,构建shRNA真核表达载体质粒WBH1和WBH2,应用阳离子脂质体分别转染人肝癌细胞株HepG2和Bel7402,利用逆转录聚合酶链反应和Westernblot法分别观察两株细胞转染后24,48,72,和96hCOX-2mRNA和蛋白的表达变化,检测抑制效果.结果:质粒在HepG2细胞和Bel7402细胞中的转染率分别约为60%和54%.WBH1导入细胞24,48,72和96h后,逆转录聚合酶链反应检测COX-2mRNA表达抑制率,HepG2细胞分别为18.5%,88.6%,52.8%和42.4%(P<0.01).Bel7402细胞分别为9%,45.1%,70.1%和56.3%(P<0.01).Westernblot法检测蛋白表达抑制率,HepG2细胞分别为10.3%,80.5%,45.3%和39.0%(P<0.01);Bel7402细胞分别为8.3%,40.2%,66.4%和35.6%(P<0.01).质粒WBH2对COX-2的表达无影响(P>0.05).结论:针对人COX-2的shRNA能高效特异的抑制不同肝癌细胞株的COX-2表达.HepG2细胞和Bel7402细胞分别以48h和72h抑制效果最明显.56.3%(P<0.01).Westernblot法检测蛋白表达抑制率,HepG2细胞分别为10.3%,80.5%,45.3%和39.0%(P<0.01);Bel7402细胞分别为8.3%,40.2%,66.4%和35.6%(P<0.01).质粒WBH2对COX-2的表达无影响(P>0.05).结论:针对人COX-2的shRNA能高效特异的抑制不同肝癌细胞株的COX-2表达.HepG2细胞和Bel7402细胞分别以48h和72h抑制效果最明显.     

凋亡素基因质粒载体对人肝癌细胞的影响

目的探讨凋亡素基因表达对人肝癌细胞的影响。方法将凋亡素基因克隆入真核表达载体pEGFP-C2,构建成pEGFP-VP3 为了使EGFP和EGFP-VP3在人肝癌细胞中表达,用非脂质体脂质转染法将pEGFP-C2和pEGFP-VP3分别转染人类肝癌细胞系(HepG2),通过荧光显微镜观察EGFP和EGFP-VP3在HepG2中的定位、表达、细胞生长及凋亡,用Annexin V-藻红素(PE)检测细胞凋亡。结果在HepG2/EGFP组细胞中,EGFP均匀分布于细胞浆和细胞核,细胞形态无变化。与非转染细胞的自然凋亡相比,转染细胞中细胞凋亡没有增加。在HepG2/EGFP-VP3组细胞中,EGFP-VP3以荧光颗粒形式集中在细胞核,细胞核中EGFP-VP3颗粒逐渐变粗,细胞变得小而圆,最后成为碎片,Annexin V-PE染色显示细胞凋亡;HepG2/EGFP-VP3组的细胞凋亡率明显高于HepG2/EGFP组和HepG2组(P<0.01)。结论 pEGFP-VP3转染人肝癌细胞后,凋亡素基因表达并导致癌细胞凋亡。     

戊型肝炎病毒与ING5相互作用的研究

目的 构建ING5基因真核表达载体和ING5荧光素酶载体,将pMIR-Report-ING5荧光素酶质粒与PUC-HEV质粒共转染293T细胞后,验证HEV与ING5之间相互关系。方法 通过提取293T细胞总RNA,RT-PCR法扩增ING5基因序列,并克隆到真核表达载体PGC3.1 (+)上。利用脂质体转染法将PGC-ING5真核表达质粒转染HepG2细胞后,通过 Western Blot法检测ING5表达情况;将pMIR-Report-ING5荧光素酶质粒和PUC-HEV质粒共转染293T细胞进一步探究ING5与HEV之间相互作用关系。结果 经双酶切和测序鉴定真核表达质粒PGC-ING5构建成功,ING5基因在HepG2细胞中成功表达;将pMIR-Report-ING5荧光素酶质粒与PUC-HEV质粒共转染293T细胞后,发现HEV明显抑制239T细胞中pMIR-Report-ING5荧光素酶的活性。结论 成功构建了PGC-ING5真核表达载体和pMIR-Report-ING5荧光素酶载体,并且证明HEV与ING5之间具有相互作用。     

hAFP增强子调控的肝癌特异性基因治疗载体的构建及活性测定

目的:构建新型AFP顺式作用元件调控的基因表达载体,检测该调控元件的特异性和活性表达.方法:设计含有特定酶切位点的引物,采用PCR法从HepG2细胞中克隆AFP启动子及增强子基因亚区片段.启动子与增强子长、短片段分别与含有报告基因荧光素酶基因的载体pGL-3的多克隆位点连接,构建不同长度hAFP增强子调控的肝癌特异性Luciferase表达载体APSE-Luc/APLE-Luc.经测序,PCR及酶切鉴定各重组体.用脂质体法将表达载体转染表达或不表达AFP的肿瘤细胞系进行荧光强度及特异性表达测定.结果:成功地将AFP基因启动子、增强子克隆到报告基因载体pGL-3的多克隆位点,构建成为不同长度hAFP增强子调控的肝癌特异性Luciferase表达载体APSE-Luc/APLE-Luc,酶切鉴定和DNA序列分析无误.转染APLE-Luc质粒的细胞中Luciferase表达量明显高于转染APSE-Luc质粒的细胞,其在HepG2细胞中的表达明显高于SMMC7721细胞及Hela细胞.结论:成功构建AFP启动子与增强子联合调控载体APSE-Luc/APLE-Luc.AFP增强子能够特异性地增强目的基因在AFP阳性细胞中表达,并且不同的亚区活性不同,长片段的活性明显高于短片段.     

丙型肝炎病毒核心区蛋白对 HepG2细胞周期、细胞凋亡和细胞端粒酶活性的影响

目的　研究丙型肝炎病毒核心区 (HCV C)蛋白对肝癌细胞HepG2细胞周期、细胞凋亡和细胞端粒酶活性的影响。方法　首先运用基因重组技术构建含有HCV C基因的真核表达质粒pcDNA3.1( ) ,然后利用脂质体介导将重组真核表达质粒转染HepG2 ,经G4 18筛选获得稳定转染HepG2细胞 (HCV C转染HepG2细胞 ) ,经逆转录 聚合酶链反应技术 (RT PCR)和间接免疫荧光法证实其中有HCV C蛋白表达。然后进行如下实验 :( 1)利用四甲基偶氮唑蓝比色 (MTT)法检测HCV C转染HepG2细胞、空白质粒转染HepG2细胞和未转染HepG2细胞的生长增殖率 ;经流式细胞术(FACS)检测 3组细胞的细胞周期 ;( 2 )经流式细胞术检测细胞凋亡率 ;( 3)经端粒重复扩增 酶联免疫吸附试验 (TRAP ELISA)法检测上述 3组细胞端粒酶活性表达情况。结果　 ( 1)HCV C转染HepG2细胞增殖率显著高于空白质粒转染HepG2和未转染HepG2细胞增殖率 ;HCV C转染HepG2细胞S期所占百分率高于未转染HepG2细胞S期所占百分率 ;( 2 )HCV C转染HepG2细胞凋亡率显著低于无HCV C转染细胞凋亡率 ;( 3)上述 3组细胞端粒酶活性之间差异无显著性。结论　 ( 1)HCV C蛋白具有抑制细胞凋亡的作用 ;( 2 )HCV C蛋白促进HepG2从G0 /1期进入S期 ,从而可能促进细胞生长增殖 ,抑制细胞凋亡 ;( 3)HCV     

抑癌基因Smad4对HepG2生长的影响及其机制探讨

目的研究抑癌基因Smad4对人肝癌细胞株HepG2．生长的影响，并探讨其作用机制。方法采用脂质体瞬时转染法转染PFTX-5Smad4质粒至人肝癌细胞株HepG2（实验组），以转染空质粒PFTX-5的HepG2细胞为对照组，野生型HepG2细胞为空白组，利用免疫印迹（Westernblot）和逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测Smad4及血管内皮生长因子（VEGF）表达的变化；用MTT法检测细胞增殖及用FITC—AnnexinV、碘化吡啶（propidiumiodide，PI）双染后流式细胞仪（FCM）检测细胞周期和凋亡情况，Westernblot检测细胞周期素D1（CyclinD1）表达差异。结果PFTX-5Smad4瞬时转染到肝癌细胞后，实验组与对照组和空白组相比，Smad4mRNA和蛋白表达明显上升（P〈0．05），而VEGFmRNA和蛋白的表达显著降低（P〈0．05）。实验组细胞CyclinD1表达明显下降（P〈0．05），细胞周期时相分布出现合成前期（G。／G．期）阻滞。实验组细胞凋亡率明显升高（P〈0．01），增殖受到明显抑制。结论Smad4高表达可能通过降低肝癌细胞中VEGF的表达，抑制eyclinD1转录合成，并诱导强烈的G1期阻滞和细胞凋亡，对细胞的增殖有明显的抑制作用，为进-步研究肝癌生长增殖机制提供了实验基础。     

人剪切修复基因着色性干皮病基因D对人脐静脉内皮细胞的促凋亡作用

目的探讨人剪切修复基因着色性干皮病基因D(XPD)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的促凋亡作用。方法用脂质体转染法瞬时转染HUVEC,转染重组质粒pEGFP-N2/XPD和空载质粒pEGFP-N2,并用未转染的与重组质粒pEGFP-N2/XPD和空载质粒pEGFP-N2具有相同遗传背景和代数的HUVEC作为空白对照。实验分为3组:正常对照组、pEGFP-N2组和pEGFP-N2/XPD组。用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白报告基因表达情况,用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,用RT-PCR和Western Blot检测XPD、Bcl-2、Bax和wt-p53表达量的变化,用MTT法观察细胞增殖活力。结果在荧光显微镜下,可在转染了重组质粒pEGFP-N2/XPD或空载质粒pEGFP-N2的细胞中观察到绿色荧光,即转染成功;流式细胞仪结果显示,重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染引起细胞凋亡增加(P<0.05或P<0.01);RT-PCR和Western Blot检测发现,重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染使得XPD表达增高(P<0.05),同时使得Bcl-2表达降低,Bax和wt-p53表达增高(P<0.05或P<0.01);MTT结果显示,重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染抑制细胞增殖活力(P<0.05)。结论 XPD能促进HUVEC凋亡,下调XPD的表达,有望成为治疗动脉粥样硬化的一个新靶点。     

含日本血吸虫脂肪酸结合蛋白(SjFABPc)基因DNA重组质粒pCD-SjFABPc在哺乳动物细胞中的表达

目的　观察裸DNA重组质粒pCD -SjFABPc在体外转染HepG2细胞以及质粒DNA免疫鼠肌组织中的表达 ,为进一步应用该质粒进行DNA免疫实验奠定基础。方法　用脂质体介导DNA转染法将pCD -SjFABPc转染贴壁细胞HepG2 ,G418加压筛选获得阳性克隆细胞并传代培养 ,SDS -PAGE及Western -blot鉴定目的基因在HepG2细胞中的表达 ;将pCD -SjFABPc质粒肌注免疫BALB/c小鼠 ,于 6 5d后取注射部位的肌组织约 0 3cm3 大小 ,经固定、包埋、切片 ,免疫酶组织化学染色 ,显微照相记录。结果　在被转染的HepG2细胞裂解样品中 ,呈现一分子量约 14kDa大小且能被感染兔血清特异识别的条带 ;免疫组化结果显示免疫组切片标本中有特异性阳性反应。结论　pCD -SjFABPc质粒能在HepG2细胞及小鼠肌细胞中表达目的蛋白