乳酸乳球菌镉抗性菌株的鉴定及质粒消除的研究

为构建乳酸菌食品级载体/受体系统.从分离自内蒙古传统乳制品103株乳源性乳酸菌中筛选出7株高浓度镉抗性菌株.特异性16SrDNA PCR扩增产物的序列测定结果表明.其中两株为乳酸乳球菌.PCR扩增镉抗性基因部分序列证实了这两株乳酸乳球菌含有镉抗性基因,为镉抗性阳性菌株.通过物理和化学方法消除乳酸乳球菌内源质粒,确定了镉抗性质粒,并获得一系列衍生菌株,包括无质粒菌株.为进一步研究各种质粒的功能及基因表达提供了理想的宿主,也为乳酸菌食品级载体/受体系统的构建奠定了基础.     

益生乳杆菌质粒抗生素抗性基因与其耐药性的相关性探讨

采用K-B药敏纸片法检测了5株具有潜在益生乳杆菌的耐药性,通过质粒消除,分析了菌株质粒与耐药性之间的联系,应用PCR确定了质粒决定的耐药基因.5株乳杆菌对万古霉素、多粘菌素B以及链霉素等7种抗生素普遍表现出抗性,但主要对四环素敏感.采用SDS与SDS-高温两种方法消除戊糖乳杆菌CH8的质粒后,菌株CH8表现出头孢噻吩和氯霉素敏感性.设计β-内酰胺类抗性基因blr、ECP-1569和nps-1以及氯霉素抗性基因cmlA、cat和cmlA1的引物进行PCR,与目的产物测序比对表明,戊糖乳杆菌CH8的质粒上含有β-内酰胺类抗性基因blr,该基因与其头孢噻吩抗性有关.该研究为探讨乳酸菌的抗药基因转移性提供了前期基础,有助于益生乳杆菌安全性评价体系的建立与完善.     

四川泡菜中乳酸菌链霉素抗性与抗性基因的检测

目的 探明四川泡菜中链霉素抗性乳酸菌及抗性基因的种类。方法 利用含有8 μg/ml链霉素的MRS初步分离泡菜液中的抗性乳酸菌,通过16S rRNA分析确定抗性乳酸菌的分类地位后,测定同种不同菌株对链霉素的MIC,并与欧洲食品安全官方机构（EFSA）建议的最低临界值比较确定抗性菌株;通过PCR扩增链霉素抗性基因strA、strB, aadA、aadE、ant(6)、aac(6')-aph(2')和aph(3')-Ⅲa,确定抗性菌株的抗性基因。结果 分离到67株链霉素敏感性或抗性菌株,这些菌株分别属于Pediococcus ethanolidurans (36), Lactococcus garvieae (14), Lactobacillus buchneri (12), Lactobacillus acetotolerans (2), Lactococcus lactis (1)和Staphylococcus.spp (2)。其中Lactococcus garvieae、Lactobacillus acetotolerans、Lactococcus lactis和Staphylococcus.spp全部为抗性菌株,Pediococcus ethanolidurans中有抗性菌株20株、Lactobacillus buchneri 中有7株。在抗性基因检测中,除Lactobacillus acetotolerans抗性菌株没有检测到被检基因外,其他5个种的抗性菌株中均检测到部分或全部抗性基因。strA 和aph(3')-Ⅲa基因在除Lactobacillus acetotolerans外的被检菌株中均有检出,其检出率分别为50%-100%和21.4%-100%;strB基因在抗性菌株Pediococcus ethanolidurans, Lactobacillus buchneri, Lactococcus garvieae和Lactococcus lactis检测率分别为70%、42.9%、28.6%和100%;aac(6')-aph(2')基因仅在3株Pediococcus ethanolidurans、1株Lactobacillus buchneri、1株Lactococcus garvieae和Staphylococcus spp中检测到。aadA、aadE and ant (6)在所有抗性菌株中都没有检测到。总体而言,strA、strB和aph(3')-Ⅲa基因在链霉素抗性菌株中的检出率高于其他抗性基因。结论 当前的研究结果表明：四川泡菜中存在链霉素乳酸菌抗性菌株,这些抗性菌株对四川泡菜存在潜在安全风险。     

四川泡菜中乳酸菌链霉素抗性与抗性基因的检测（英文）

目的探明四川泡菜中链霉素抗性乳酸菌及抗性基因的种类。方法利用含有8μg/ml链霉素的MRS初步分离泡菜液中的抗性乳酸菌,通过16S r RNA分析确定抗性乳酸菌的分类地位后,测定同种不同菌株对链霉素的MIC,并与欧洲食品安全官方机构(EFSA)建议的最低临界值比较确定抗性菌株;通过PCR扩增链霉素抗性基因str A、str B,aad A、aad E、ant(6)、aac(6')-aph(2')和aph(3')-Ⅲa,确定抗性菌株的抗性基因。结果分离到67株链霉素敏感性或抗性菌株,这些菌株分别属于Pediococcus ethanolidurans(36),Lactococcus garvieae(14),Lactobacillus buchneri(12),Lactobacillus acetotolerans(2),Lactococcus lactis(1)和Staphylococcus.spp(2)。其中Lactococcus garvieae、Lactobacillus acetotolerans、Lactococcus lactis和Staphylococcus.spp全部为抗性菌株,Pediococcus ethanolidurans中有抗性菌株20株、Lactobacillus buchneri中有7株。在抗性基因检测中,除Lactobacillus acetotolerans抗性菌株没有检测到被检基因外,其他5个种的抗性菌株中均检测到部分或全部抗性基因。str A和aph(3')-Ⅲa基因在除Lactobacillus acetotolerans外的被检菌株中均有检出,其检出率分别为50%-100%和21.4%-100%;str B基因在抗性菌株Pediococcus ethanolidurans,Lactobacillus buchneri,Lactococcus garvieae和Lactococcus lactis检测率分别为70%、42.9%、28.6%和100%;aac(6')-aph(2')基因仅在3株Pediococcus ethanolidurans、1株Lactobacillus buchneri、1株Lactococcus garvieae和Staphylococcus spp中检测到。aad A、aad E and ant(6)在所有抗性菌株中都没有检测到。总体而言,str A、str B和aph(3')-Ⅲa基因在链霉素抗性菌株中的检出率高于其他抗性基因。结论当前的研究结果表明:四川泡菜中存在链霉素乳酸菌抗性菌株,这些抗性菌株对四川泡菜存在潜在安全风险。     

Nisin产生菌N-21的分离鉴定与选育

从新鲜牛奶中分离出21株产乳酸球菌,经抑菌试验选出抑菌能力最强菌株SN-21,经鉴定SN-21菌株为乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis).以SN-21为出发菌株,经硫酸二乙酯和紫外线诱变处理,获得了一株nisin高产菌株N21(1514.0 IU/mL).经发酵条件研究,在蔗糖1%,蛋白胨1%,牛肉膏0.35%,酵母膏0.35%,KH2PO4 1%,NaCl 0.2%,MgSO4.7H2O0.02%,pH 6.5的优化条件下N21的nisin效价达到了1862.0 IU/mL.     

细菌素Lcn972A产生菌的鉴定及其基因的克隆与序列分析

目的:从杏鲍菇子实体与海带中分离的63株乳酸菌中鉴定出产细菌素Lcn972A的菌株,并对细菌素编码基因进行克隆与基因序列分析。方法:采用生物信息学手段对已报道的细菌素Lcn972A编码基因进行分析比较,设计引物,分别以各乳酸菌基因组DNA为模板,利用PCR克隆技术克隆出细菌素Lcn972A的基因,利用生物信息学工具对其核酸序列和预测的蛋白序列进行分析。结果:在63株乳酸菌的基因组样品中有15组被克隆出目的条带,其中杏鲍菇乳酸菌A15与海带乳酸菌CX2样品PCR产物条带清晰稳定性好,经鉴定两样品的乳酸菌株为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。对克隆的细菌素Lcn972A基因测序结果表明该基因序列全长276 bp。生物信息学分析显示该基因编码91个氨基酸,分子量大小22843.3 u,等电点5.33,氨基酸序列为亲水性,二级结构主要由α-螺旋、无规卷曲和延伸链组成。结论:从分离自杏鲍菇子实体乳酸乳球菌A15与海带乳酸乳球菌株CX2的细菌素编码基因及氨基酸序列与报道的有所不同,可能是新的细菌素,该细菌素的抗菌特点有待进一步的研究。     

棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶的乳酸乳球菌表达

构建棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶食品级分泌表达载体并在乳酸乳球菌MG1363(L.lactis MG1363)中实现表达。通过PCR扩增L.lactis MG1363基因组中分泌信号肽Usp45、质粒pLEB590的乳链菌肽(Nisin)抗性基因NisI和质粒pPIC9k-Abgl的棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶基因Abgl,PCR方法连接后获得片段Usp45-Abgl-NisI,将其克隆到质粒pMD19中,CaCl2法转化到E.coli DH5α,测序鉴定后将该片段连接到大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒pMG36e中并转化到E.coli XL1-Blue,得重组子E.coli XL1-Blue/pMG36e-Usp45-Abgl-NisI。通过PCR方法敲除质粒pMG36e-Usp45-Abgl-NisI中红霉素抗性基因以构建食品级分泌载体pMG36N-Usp45-Abgl-NisI,将其电转到L.lactis MG1363中。转化子E.coli XL1-Blue/pMG36e-Usp45-Abgl-NisI能将β-葡萄糖苷酶分泌到胞外使七叶苷平板显色,L.lactis MG1363/pMG36N-Usp45-Abgl-NisI能在20 IU/mL Nisin上生长,经RT-PCR验证β-葡萄糖苷酶在乳酸乳球菌中实现表达。表明分泌型表达载体构建成功,为其在乳酸乳球菌中实现食品级活性表达奠定基础。     

南美白对虾肠道内乳酸菌的分离鉴定及其对抗生素的耐药性

以南美白对虾为研究对象,采用平板分离法从其肠道内筛得26株乳酸菌,通过16S rRNA测序鉴定可归为4种:乳酸乳球菌乳亚种L. lactis subsp. lactis、台湾乳球菌L. taiwanensis、格式乳球菌L. garvieae、乳酸乳球菌L. lactis。选取7株具有代表性的乳酸菌,用PCR的方法检测对虾中检出率较高的6类18种抗性基因(ARGs)在乳酸菌中的分布,辅以平板涂布的方法用抗生素选择性培养基研究乳酸菌对抗生素的耐药性。研究发现:7株乳酸菌具有相似的耐药谱,对四环素、磺胺吡啶、乙酰螺旋霉素表现出耐药性(抑菌率50.00%),对盐酸金霉、土霉素、硫酸庆大霉素、氯霉素、红霉素敏感(抑菌率100%);含有多重抗性基因,ARGs的检出率:磺胺类(92.86%)四环素类(53.06%)喹诺酮类(23.81%)氨基糖苷类(4.76%)氯霉素类=大环内酯类(0.00%),其ARGs基因型与菌株的抗生素表型并不能完全吻合。     

发酵乳球菌菌株的PCR鉴定

对9株发酵乳球菌标准菌株进行MRS固体平板培养基划线分离和镜检观察,采用特异性PCR对其进行鉴定,划线分离得到11株菌;依据各菌种代谢酶编码基因序列差异设计菌种特异性PCR引物,进行PCR扩增,将其在菌株水平上鉴定为9株菌(6株乳酸乳球菌、2株嗜热链球菌和1株无乳链球菌)。实验还获得了2个乳酸乳球菌的种特异性PCR引物LclamyLF-R和LclmapA2F-R、2个嗜热链球菌的种特异性PCR引物SttglgPF-R和SttamyLF-R以及可能是标准菌株AS1.1936的株特异性的PCR引物LclamyYF-R。     

基于16S rRNA基因与相关基因序列分析格氏乳球菌亲缘关系

通过PCR扩增7株分离自传统发酵乳制品中的格氏乳球菌的dnaA、rpoB、recA基因,将扩增产物测序,测得的序列构建系统发育树,进行分类鉴定.同时,比较了这三个基因位点与16S rRNA基因揭示的格氏乳球菌种内菌株间以及其与乳酸乳球菌种间的亲缘关系的远近.结果表明,dnaA、rpoB、recA基因能够有效的鉴定出格氏乳球菌,且比16S rRNA基因更清晰地揭示了格氏乳球菌菌株间以及其与乳酸乳球菌种间的亲缘关系,特别是将3个管家基因联合起来,亲缘关系更明确,验证了多个管家基因是研究细菌亲缘关系的有力工具.     

Nisin抗性嗜热链球菌的筛选

采用两倍稀释法在脱脂乳培养基和乳清培养基中测定了nisin对嗜热链球菌9的最小抑菌浓度(MIC)。在脱脂乳培养基中逐渐增加nisin的浓度，驯化嗜热链球菌9，直到其抗性达到300IU／ml。经生产性能鉴定和遗传性状实验，获得两株适宜做酸奶发酵剂的nisin抗性嗜热链球菌9.31和9．4。     

鲭鱼鱼肉中组胺产生菌的筛选与鉴定

根据产组胺能力,采用二步筛选法从鲭鱼肉中分离、筛选组胺产生菌(HPB),并通过生理生化实验结合16S rRNA序列同源性分析,对分离得到的HPB进行鉴定。结果表明：筛选出的5株组胺产生菌中,2株为革兰氏阴性菌、3株为革兰氏阳性菌,将5株菌接种到含2.0g/100mL组氨酸的培养基中,36℃条件下培养24h,培养液中组胺产量分别为210.5、823.0、130.5、229.0、217.0mg/L。根据生理生化特性与16S rRNA序列同源性分析,分离得到的HPB分别为蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)、溶酪大球菌(Macrococcus caseolyticus)以及松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)。     

烟区土壤高效氨化芽孢杆菌菌株的筛选鉴定及特性研究

为提高有机肥中有机氮的分解效率，满足烤烟生长前期氮素需求，利用氨化细菌培养基从贵州烟区土壤中分离、纯化获得了5株氨化细菌菌株，通过纳氏试剂比色法测定培养液中的氨氮浓度，5株菌株的氨氮产量在297~460 mg/L之间；筛选出氨化作用最强的2株菌株，通过形态、生理生化特征、16S rRNA基因测序及系统发育分析，鉴定AMM-2菌株为Bacillus toyonensis，AMM-5为Bacillus mobilis。氨化特性研究显示，在pH 7.0的氨化细菌培养基中，30℃条件下培养48 h，2株菌产生的NH₄⁺-N浓度分别可达514和505 mg/L，在pH 4.0~10.0和25~30℃温度范围内均表现较强的氨化能力，其中AMM-5菌株的温度适应性更广、耐盐性更高。研究获得了分解有机氮能力强的芽孢杆菌菌株，为提高有机肥的肥效提供了菌株资源。     

INHIBITION OF BEER-SPOILAGE LACTIC ACID BACTERIA BY NISIN

149 strains of bacteria, mostly brewery contaminants able to spoil wort or beer, and 12 brewing strains of yeast (8 ale and 4 lager strains) have been screened using a well-test assay for sensitivity to the food preservative, Nisin (E234), Nisin inhibited growth of 92% of the gram-positive strains, predominantly lactic acid bacteria of the genera Lactobacillus and Pediococcus. In contrast, all 32 gram-negative strains tested, except 3 Flavobacter strains, were Nisin-resistant; in addition none of the brewing yeasts showed Nisin-sensitivity. Therefore. Nisin has potential applications in preventing spoilage of worts or beers by lactic acid bacteria.     

酒曲中产凝乳酶微生物菌株的分离筛选及鉴定

针对酒曲中的微生物进行分离纯化,得到11株细菌和2株真菌,并采用酪蛋白平板法和Arima时间法筛选出了1株产凝乳酶的细菌菌株编号为LB-51。通过形态学观察、生理生化实验和16S rDNA序列分析鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌,将该产凝乳酶菌株命名为解淀粉芽孢杆菌GSBa-1。该菌株在液体LB培养基中发酵72 h产凝乳酶的凝乳活力为(431.53±15.89)SU/mL,蛋白水解活力为(5.05±0.59)U/mL,所产凝乳酶凝乳活力高而蛋白水解活力低,凝乳酶粗酶单位酶活力为1.54×10~5SU/g。解淀粉芽孢杆菌GSBa-1是分离筛选自酒曲中的一株高产凝乳酶细菌,因此其来源安全,可作为工业化候选菌株进一步研究开发。     

产共轭亚油酸鼠李糖乳杆菌的筛选与鉴定

从东北传统酸菜汁中筛选出具有产共轭亚油酸(CLA)能力的乳酸菌菌株15株,采用紫外分光度计法测定发酵液中共轭亚油酸产量,其中菌株A53.2的产量最高,在MRS培养基中添加0.4mg/mL亚油酸(LA),37℃发酵24h,CLA产量达14.91μg/mL。通过对菌体的形态特征和生化特性分析,并结合16SrDNA分子生物学以及系统发育分析鉴定菌株A53.2为鼠李糖乳杆菌。     

产几丁质降解酶菌株的筛选及其产酶条件

采用平板透明圈法从土壤中分离筛选到一株产几丁质降解酶菌株L12酶活力为0．63U／mL。通过产酶条件优化，初步确定了该菌株较适产酶培养基和摇瓶发酵条件。条件优化后酶活力提高约1．6倍，达到1．06U／mL。     

基于尿嘧啶磷酸核糖转移酶为负向筛选标记的生酮古龙酸杆菌基因组无痕修饰系统的构建

通过构建尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因(upp)敲除打靶质粒,采用同源重组的方法获得了生酮古龙酸杆菌(Ketogulonigenium vulgare)的upp基因缺失突变株K.vulgareΔupp,可作为基因组无痕修饰系统底盘细胞的upp基因表达载体,转化突变株K.vulgareΔupp,获得upp基因回补菌株PBB-upp,并验证了upp作为负向筛选标记的可行性。实验结果表明:突变株Δupp在1 mg/m L的5-氟尿嘧啶培养基上可生长,野生型和回补菌株PBB-upp不能生长,3株菌对5-氟尿嘧啶的抗性存在显著差异,说明可以将upp基因作为负向筛选标记,与正向筛选标记相结合,在upp基因缺失的底盘细胞基础上通过两次同源重组,实现基因组的无痕修饰与改造。     

EMA-PCR法快速检测啤酒中腐败短乳杆菌

将叠氮溴乙锭(ethidium bromide monoazide,EMA)与聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术相结合,以酒花耐受基因hor C为靶基因,用啤酒腐败短乳杆菌基因组DNA作为模板进行扩增。结果发现,在前处理过程中加入EMA,当终质量浓度小于20μg/m L时,对活的短乳杆菌中靶基因的扩增没有明显抑制作用;而当EMA终质量浓度为1.0μg/m L时可有效抑制10~5 CFU/m L短乳杆菌死细胞的扩增。本实验建立的EMA-PCR检测方法的灵敏度为10~4活细胞/m L酒液样品。验证实验结果表明,在13株乳酸菌中,建立的hor C特异性EMA-PCR能有效检测到其中的全部5株啤酒污染菌,同时可区分这5株菌的活/死细胞混合体系,降低检测过程中的假阳性。     

降胆固醇和耐酸耐胆盐益生菌的筛选研究

本研究通过含有胆固醇胶束的MRS-胆固醇液体培养基从五株益生菌中筛选出降胆固醇能力较强的益生菌,接着对筛选出的益生菌进行耐酸、耐胆盐试验。结果表明,五株益生菌都有降胆固醇的功能,其中干酪乳杆菌LCA-1、鼠李糖乳杆菌LR-D和植物乳杆菌LP-C的胆固醇去除率较高,分别为25.26%、22.18%和20.03%;LR-D能够短时耐受低p H值环境,在p H 2.5的发酵液中培养2h的存活率能够达到14.39%,但是耐胆盐能力较差;LP-C能够长时间耐受低p H值的环境,具有较强的胆盐耐受能力,在高胆盐环境(0.5%)中培养2 h的存活率高达133.75%,培养24 h的活菌数仍保持在1.13×105 cfu/m L,此时其余两株菌的活菌未检出,说明LP-C能够耐受高胆盐环境。植物乳杆菌LP-C具有较高的胆固醇去除率,能够耐受低p H值和高胆盐环境。因此,可用于进一步研究与开发。