人bcl-2基因反义cDNA探针的制备和地高辛标记

制备地高辛标记的人ｂｃｌ－２基因的反义链ｃＤＮＡ探针。方法：首先从Ｕ９３７细胞总ＲＮＡ经逆转录－聚合酶链反应得到ｂｃｌ－２特异的ｃＤＮＡ片段，然后以此为模板利用ＤＩＧ－１１－ｄＵＴＰ作另一轮非对称ＰＣＲ扩增。结果：合成了灵敏、特异的ＤＩＧ－标记的ｂｃｌ－２反义单链ｃＤＮＡ探针。结论：本文报道的方法是制备ＤＩＧ－标记的单链反义ｃＤＮＡ探针的一个有效手段。     

人bcl—2基因反义cDNA探针的制备和地高辛标记

目的：制备地高辛标记的ｂｃｌ－２基因的反义链ｃＤＮＡ探针。方法首先从Ｕ９３７细胞总ＲＮＡ经逆转录－聚合酶链反应得到ｂｃｌ－２特异的ｃＤＮＡ片段，然后以此模板利用ＤＩＧ－ｄＵＴＰ作另一轮非对称ＰＣＲ扩增。结果：合成了灵敏，特异的ＤＩＧ－标记的ｂｃｌ－２反义单链探针。结论：本文报道的方法是制备ＤＩＧ－标记的单链的ｃＤＮＡ探针的一个有效手段。     

地高辛标记核酸探针的应用

本工作中以肿瘤多药耐受基因ＭＤＲ－１的ｃＤＮＡ的限制片段（５Ａ）为模板ＤＮＡ，把模板ＤＮＡ用随机引物法标记上地高辛标记的脱氧尿苷三磷酸ＤＩＧ－ｄＵＴＰ。将此地高辛标记的核酸探针与变性的同源质粒及部分头颈肿瘤组织ＲＮＡ进行点杂交后，用抗地高辛－碱性磷酸酶及其底物进行酶联免疫分析，探讨了应用这种非放射性地高辛标记的ＤＮＡ探针及其检测系统的敏感性以及应用价值。     

地高辛标记核酸探针的应用

本工作中以肿瘤多药耐受基因ＭＤＲ－１的ｃＤＮＡ的限制片段（５Ａ）为模板ＤＮＡ，把模板ＤＮＡ用随机引物法标记上地高辛标记的脱氧尿苷三磷酸ＤＩＧ－ｄＵＴＰ。将此地高辛标记的核酸探针与变性的同源质粒及部分头颈肿瘤组织ＲＮＡ进行点杂交后，用抗地高辛－碱性磷酸酶及其底物进行酶联免疫分析，探讨了应用这种非放射性地高辛标记的ＤＮＡ探针及其检测系统的敏感性以及应用价值。     

人淋巴细胞免疫反应性生长激素mRNA的扩增与鉴定

用正常人淋巴细胞，总ＲＮＡ与人垂体生长激素特异性探针进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交，得到一条弱的杂交带，其位置与人垂体生长激素分泌瘤总ＲＮＡ的Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交带近乎一致。根据人垂体生长激素ｃＤＮＡ顺序设计合成寡核苷酸引物，用逆转录。聚合酶链反应相结合的方法，从正常人外周血淋巴细胞．总ＲＮＡ中扩增出的ｃＤ－ＮＡ与人垂体生长激素ｃＤＮＡ大小相似，证实正常人淋巴细胞有免疫反应性生长激素ｍＲＮＡ的表达。     

Northern杂交法分析转染的胞苷酶

目的：研究人胞苷转移酶（ＣＴ）ｃＤＮＡ在鼠巨噬细胞中的表达。方法：按照Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ等人的方法人转染的巨噬细胞中提取总ＲＮＡ，电泳分离ＲＮＡ，转移ＲＮＡ至尼龙膜并固定，制备３２ｐ标记的胞苷转移酶ＤＮＡ探针，杂交及放射性自显影。结果：对照组无表达，同类转染的细胞均有不同程度的表达。结论：制备探针前应用电泳法确定ＣＴｃＤＮＡ片段的浓度比紫外光吸收法更准确适用。Ｑｕｉｃｋｓｐｉｎ柱（Ｓｅｐｈａｄｅ     

人IL—3cDNA探针刺备及应用

采用多连反应扩增人ＩＬ－３ｃＤＮＡ片段,以地高辛为标记物,随机引物法标记ＩＬ－３ｃＤＮＡ探针。探针经斑点杂交和核酸原位杂交证明：用制备ＩＬ－３ｃＤＡＮ探针检测细胞ＩＬ－３ｍＲＮＡ表达具有特异性强,灵敏度高,使用简便,杂交结果直观,探针可较长时间保存和无放射性污染等优点。     

应用RNA探针检测流感病毒特异性RNA

插入流感病毒Ａ／Ａｉｃｈｉ（Ｈ３Ｎ２）ＮＰ ｃＤＮＡ的ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＳＫ＾＋质粒，分别经Ｘｃｍ Ｉ和ＢｓｐＭＩ线性化之后，以此为模板用Ｔ７和Ｔ３ＲＮＡ多聚酶合成了同位素标记的正链和负链ＲＮＡ探针。流感病毒在狗肾传代细胞（ＭＤＣＫ）生长良好，而在其变异株ＭＤＣＫ－Ｌ细胞生长受阻。为了分析比较两种细胞中流感病毒基因复制情况，作者应用上述ＲＮＡ探针，检测了接种流感病毒的两种细胞中病毒ＲＮＡ（ｖ     

生物素标记核酸探针检测白血病患者c—myc原癌基因的表达水平

用两种方法制备生物素ｃ－ｍｙｃ癌基因探针，通过ＲＮＡ－ＤＮＡ斑点杂交技术，检测了白血病３０例和２种白血病细胞株中ｃ－ｍｙｃ原癌基因的ＲＮＡ表达水平，结果显示，白血病细胞株，急性白血病和慢性粒细胞性白血病急性变患者的ｃ－ｍｙｃ的ＲＮＡ表达水平明显高于正常人和患其它血液病的患者，提示ｃ－ｍｙｃＲＮＡ水平的判定可提供一些有意义的临床信息，同时探讨了生物素和光敏生物素标记核酸探针的优越性。     

马立克病疱疹病毒致瘤株基因组IRL区Bam H I I2和L片段内一特异性cDNA的分离与鉴定

目的　了解马立克病疱疹病毒（ＭＤＶ）强毒ＧＡ株Ｂａｍ ＨＩＬ片段在ＭＤＶ致瘤毒株京－１株（中国特有的地方株）所诱导的淋巴肿瘤组织中转录状况。方法　从人工感染ＭＤＶ致瘤株京－１株发病鸡内脏淋巴肿瘤组织中分离ｍ ＲＮＡ,根据已发表的ＭＤＶ肿瘤候选基因ｍ ｅｑ 基因序列和我们已测定的强毒ＧＡ株Ｂａｍ ＨＩＬ片段序列,设计两段寡核苷酸引物,以此ｍ ＲＮＡ为模板经逆转录合成ｃＤＮＡ,应用ＰＣＲ法进行目的基因扩增。用非放射性Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ 分别标记ＧＡ株基因组Ｂａｍ ＨＩＩ２和ＬＤＮＡ片段,制成核酸探针,分别与ＰＣＲ产物作Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分子杂交鉴定。结果　逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增的ｃＤＮＡ大小约７３０ ｂｐ,该ｃＤＮＡ能同时与上述两探针发生免疫呈色反应。结论　①ＭＤＶ ｍ ｅｑ基因的转录可以延伸到其右侧的Ｂａｍ ＨＩＬ片段区;②Ｂａｍ ＨＩＬ区在ＭＤＶ致瘤株京－１株所诱导的淋巴肿瘤组织中可发生转录。     

RNA恒温扩增法在肺炎支原体检测中的应用

目的 探讨RNA恒温扩增法检测肺炎支原体的可行性及其应用价值.方法 采集2016年5~7月在我院住院治疗的200例患急性呼吸道感染儿童咽拭子,分别用RNA恒温扩增法和PCR荧光探针法进行肺炎支原体检测,分别计算两种检测方法的检出率,根据公式计算灵敏度和特异性,并进行统计学分析.结果 RNA恒温扩增法检出肺炎支原体17例,检出率为8.5%,PCR荧光探针法检出肺炎支原体18例,检出率为9.0%,两种方法的检出率比较差异无统计学意义(P>0.05);RNA恒温扩增法与PCR荧光探针法相比灵敏度为88.9%、特异度为99.5%.结论 RNA恒温扩增法与PCR荧光探针法检出率相当,具有较高的灵敏度和特异度,可以作为一种新的方法用于肺炎支原体临床检测.     

结核分枝杆菌双重实时RT-PCR检测方法的研究

目的建立检测结核分枝杆菌mRNA表达水平的双重实时RT-PCR反应体系,准确快速鉴定结核分枝杆菌。方法根据GenBank上已发表的结核分枝杆菌表达85B抗原的fbpB mRNA基因序列,进行对比分析,设计合成fbpB引物和探针,其中探针以CY5为报告基团,BHQ3为淬灭基团。根据WHO文献报道合成人类RNase P基因引物和探针,其中探针以FAM为报告基团,BHQ1为淬灭基团。经条件优化后,建立检测结核分枝杆菌mRNA双重实时RT-PCR方法,在同一体系内同时扩增结核分枝杆菌fbpB基因和人类RNase P基因,通过检测10份肺结核患者痰液和10份健康无症状人群痰液,检验方法的特异性、重复性和检测限性。结果肺结核患者痰液fbpB和RNase P基因均扩增阳性,健康无症状人群痰液fbpB均无扩展曲线,RNase P均扩增阳性。重复性检测显示fbpB基因重复检测的变异系数在1%以下,fbpB检测CT值与痰涂片抗酸染色分枝杆菌的数量呈良好的相关性。结论建立了一种快速双重实时RT-PCR方法能同时对结核分枝杆菌fbpB mRNA基因和人类RNase P基因进行检测,在检测fbpBmRNA基因的同时,通过检测RNase P基因监测RNA提取效果和PCR反应扩增效果。     

鼻咽癌p16、p130/Rb2、nm23-H1基因mRNA表达研究

目的检测鼻咽癌组织中抑癌基因p16、p130/Rb2、nm23-H1基因在mRNA水平上的表达,探讨其与鼻咽癌诊断及其生物学行为的关系。方法p16基因mRNA检测采用生物素标记RNA探针的原位杂交技术;p130/Rb2、nm23-H1基因先提取鼻咽癌及鼻咽慢性炎症患者鼻咽部活检组织的总RNA,采用实时荧光定量RT-PCR技术检测鼻咽癌组织中p130和nm23基因mRNA含量。结果30例NPC标本原位杂交阳性13例,p16mRNA阳性表达为43.3%,3个高发家系的NPC标本无阳性表达,20例对照(鼻咽炎患者的标本)全部有p16mRNA阳性表达。鼻咽癌组p130和nm23-H1基因mRNA含量显著地低于对照组,经秩和检验P值<0.05,p130和nm23-H1基因mRNA在癌组织中表达与慢性咽炎组织比较均有显著性差异;鼻咽癌有无转移者其表达也有显著性差异。结论表明p16、p130/Rb2、nm23-H1mRNA在鼻咽癌组织中均呈低表达,提示p16、p130/Rb2、nm23-H1基因的突变或缺失可能对鼻咽癌的发生发展及恶性行为有重要意义。     

鼻咽癌p16、p130/Rb2、nm23-H1基因mRNA表达研究

目的检测鼻咽癌组织中抑癌基因p16、p130/Rb2、nm23-H1基因在mRNA水平上的表达,探讨其与鼻咽癌诊断及其生物学行为的关系。方法p16基因mRNA检测采用生物素标记RNA探针的原位杂交技术;p130/Rb2、nm23-H1基因先提取鼻咽癌及鼻咽慢性炎症患者鼻咽部活检组织的总RNA,采用实时荧光定量RT-PCR技术检测鼻咽癌组织中p130和nm23基因mRNA含量。结果30例NPC标本原位杂交阳性13例,p16mRNA阳性表达为43.3%,3个高发家系的NPC标本无阳性表达,20例对照(鼻咽炎患者的标本)全部有p16mRNA阳性表达。鼻咽癌组p130和nm23-H1基因mRNA含量显著地低于对照组,经秩和检验P值<0.05,p130和nm23-H1基因mRNA在癌组织中表达与慢性咽炎组织比较均有显著性差异;鼻咽癌有无转移者其表达也有显著性差异。结论表明p16、p130/Rb2、nm23-H1mRNA在鼻咽癌组织中均呈低表达,提示p16、p130/Rb2、nm23-H1基因的突变或缺失可能对鼻咽癌的发生发展及恶性行为有重要意义。     

FasL mRNA在椎间盘细胞中表达的分布

目的 观察凋亡相关基因FasL mRNA在椎间盘细胞中表达的分布.方法 收集胎儿及成人病理腰椎间盘髓核标本,PHA-P激活单个核细胞诱导FasL表达,提取总RNA,RT-PCR制备FasL基因片段.定向克隆入质粒载体pSPT19多克隆位点构建重组质粒,体外转录制备Dig-FasL cRNA探针.cRNA探针原位杂交进行FasL mRNA表达分布的观察.结果 克隆化FasL序列经DNA测序准确无误,体外转录cRNA探针标记效果满意;胎儿腰椎间盘组织脊索细胞、软骨样细胞中可检测到FasL mRNA的较高杂交信号,成人突出椎间盘细胞中罕见正常细胞,未检出FasL mRNA信号.结论 FasL基因在胎儿期腰椎间盘细胞内表达,细胞凋亡发生早.成年时期,细胞数急剧减少,代谢功能低下,无法检出凋亡基因表达.     

BALB/c小鼠乳糖酶基因Lac的克隆及其cDNA探针的制备

目的 提取、克隆BALB／c小鼠乳糖酶基因Lac,了解其序列及所编码蛋白的属性,并制备Lac cDAN探针,为进一步研究乳糖不耐受奠定基础。方法 取4周龄BALB／c小鼠小肠组织,用Trizol试剂盒提取总RNA,经RT—PCR、梯度PCR获取Lac cDNA。测序鉴定后将序列提交NCBI GenBank,同时利用生物信息学,对其编码产物进行预测。探针的制备采用随机引物法以地高辛标记。结果 所获得的Lac cDNA编码区有912bp,编码303个氨基酸残基,在其二级结构中存在一个糖苷键水解酶基序,C-末端有一疏水螺旋区。标记后的探针经检测,灵敏度达到1pg／μl。结论 所获得的Lac基因经鉴定确为乳糖酶基因,由它编码的蛋白产物是乳糖酶。标记的探针灵敏度很高,可以用于原位杂交实验。     

人端粒酶RNA的cDNA探针制备及其对胃粘膜细胞端粒酶RNA表达的检测

目的 建立人端粒酶RNA表达的检测方法。方法 制备人端粒酶RNA，(human telomeraseRNA，hTR)的cDNA探针，分别应用RNA斑点杂交与端粒重复序列扩增法(TRAP)分析检测不同胃粘膜的端粒酶RNA的表达与端粒酶活性。结果 人端粒酶RNA的cDNA探针制备成功。18例活检胃癌组织及45例手术胃癌组织RNA斑点杂交检测的阳性率均为l00％，相应TRAP分析的阳性率分别为88．89％、86．67％，低于RNA斑点杂交(P＜0．05)。同时RNA斑点杂交结果提示在非癌胃组织中随着肠化程度增高人端粒酶RNA表达也增强。结论 RNA斑点杂交检测人端粒酶RNA，具有高度的敏感性和特异性，弥补了TRAP分析敏感性不足的缺点。     

利用寡核苷酸膜芯片检测SARS病毒

目的：建立寡核苷酸膜芯片技术检测SARS病毒。方法：以SARS冠状病毒RNA聚合酶基因(P基因)作为目的基因．参考WHO公布的特异性引物序列,将SARSRNA进行P基因克隆。以地高辛标记的引物,扩增质粒DNA,在P基因上设计11条寡核苷酸探针,点于尼龙膜,制备膜芯片,与地高辛标记的PCR产物杂交显色。结果：以此特异性引物成功地扩增出了440bp的基因片段;以T载体成功的克隆了此基因;克隆的P基因为靶序列,与膜芯片杂交显示,能与probe1,probe2,probe4,probe6,probe8,probe96条正义链特异性探针稳定杂交,其中Drobe1,probe4,probe9杂交效果最好,作为最后选择的探针。结论：膜芯片技术能快速敏感地鉴定出标本中的SARS病毒RNA。     

三氧化二砷诱导小鼠小脑组织细胞凋亡相关基因改变的芯片研究

[目的]利用基因芯片研究As2O3诱导小鼠小脑组织细胞凋亡信号转导相关基因表达的差异性,寻找关键基因,并分析其可能的作用机制。[方法]小鼠通过自然饮用含As2O3自来水方式进行砷暴露60 d后,对其小脑组织进行总RNA提取、纯化、体外转录合成cRNA探针、cRNA探针生物素标记、与Mouse Genome 430 2.0 Araay基因芯片杂交、扫描杂交信号、最后进行芯片数据处理和生物学信息分析。[结果]与对照组比较,Mdfic、Pycard、Igh-6在染毒组表达上调,Igf1r、Mapk8ip1、Prdx2、Frag8、Spred2在染毒组表达下调,但其在低剂量组与高剂量组表达水平相同;与对照组比较,Arhgdig、Aldh1a1、Nudt2、Il18在染毒组表达上调,Mapk8、Bcl2l1表达下调,且差异表达程度呈剂量反应关系;与对照组和低剂量组比较,高剂量组的Cartpt、Map4k2表达上调,Rock1、Cacna1α、Hipks、Sod1、Arh-gap5、Srgap2表达下调。[结论]As2O3诱导小脑组织细胞凋亡的可能机制主要与Caspase途径及JNK途径的活化和细胞内钙离子浓度的增高有关,所涉及的主要相关基因有：Rock1、Pycard、Cacna1α、Cartpt和Mdfic。     

大鼠肌肉挫伤组织中SLClAlmRNA表达与损伤时间的关系

目的应用实时定量PCR技术检测大鼠肌肉挫伤组织中SLC1AlmRNA时序性表达规律,分析其与损伤时间的关系。方法78只大鼠分为对照组和损伤组,制备大鼠肌肉挫伤模型,损伤组于伤后4,8,12,16,20,24,28,32,36,40,44,48h取材（每组6只）,对照组不作处理直接取材,一步法提取总RNA,检测其完整性和浓度,按照0．4μg总RNA量逆转录合成第一链eDNA,以Rlpl3为内参基因进行探针法荧光定量检测,采用△△Ct法比较其与正常肌肉组织SLClAlmRNA表达的倍数关系。结果肌肉组织中SLClAlmRNA挫伤后4h即升高,8h达到峰值,最高为正常对照组的19倍,随后逐渐降低,直至48h降低为接近正常对照组水平。结论大鼠肌肉挫伤组织中SLClAlmRNA的表达随损伤时间呈规律性变化,可望用于早期损伤时间推断。