刺五加化学成分及自由基清除活性研究

目的研究长白山区植物刺五加的化学成分及其自由基清除活性。方法采用硅胶柱色谱、ODS柱色谱、半制备HPLC等色谱方法进行分离纯化,通过波谱技术鉴定其结构,并对化合物进行自由基清除活性测定。结果从刺五加中分离得到了11个化合物,分别鉴定为邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(1)、邻苯二甲酸二异丁酯(2)、落叶松脂醇(3)、tripterygiol(4)、8,8′-bisdihydrosiringenin(5)、异嗪皮啶(6)、丁香脂素(7)、蛇菰宁(8)、3,3′-dimethoxy-4,8′-oxyneoligna-9,4′,7′,9′-tetraol(9)、1-(4′-hydroxy-3′-methoxyphenyl)-2-[4″-(3-hydroxypropyl)-2″,6″-dimethoxyphenoxy]propane-1,3-diol(10),芝麻脂素(11)。结论化合物1～5和8～11为首次从刺五加中得到,且发现化合物3、4、6和7具有较好的自由基清除活性,其对DPPH清除作用的IC50值分别为0.01、0.01、0.01和0.66μg/mL,可为发现抗氧化和抗衰老药物先导化合物提供参考。     

南方灵芝子实体化学成分研究

采用多种柱色谱技术和半制备高效液相色谱等方法对南方灵芝子实体乙醇提取物乙酸乙酯萃取部分中化合物进行分离纯化,通过波谱数据鉴定其结构,并检测化合物α-糖苷酶抑制活性和DPPH自由基清除活性。结果分离得到8个化合物,分别鉴定为6-methoxyl-cyclo-(Phe-Ile)(1)、applanoxidic acid A methyl ester(2)、麦角甾-7,22E-二烯-3β-醇(3)、肉桂酸(4)、5α,8α-过氧桥麦角甾-6, 22E-二烯-3β-醇(5)、3,4-二羟基苯乙酮(6)、水杨酸(7)、苯甲酸(8)。其中化合物1为1个新的环二肽化合物,化合物2为1个羊毛甾新天然产物,化合物4,6,7和8首次从南方灵芝中分离得到。活性测定结果表明化合物4和8对α-糖苷酶具有抑制活性,其抑制率分别为36.8%,34.7%,化合物4,7和8具有一定的DPPH自由基清除活性,其IC_(50)分别为0.168, 0.458, 0.170 g·L~(-1),化合物1的DPPH自由基清除率为41.1%。     

番石榴叶黄酮类化学成分及其抗氧化活性研究

利用硅胶、D-101大孔树脂、Sephadex LH-20、ODS等柱色谱方法从番石榴叶乙醇浸提液的乙酸乙酯和正丁醇萃取部位中分离得到6个黄酮类化合物,分别鉴定为槲皮素(1)、槲皮素-3-O-α-D-阿拉伯糖苷(2)、槲皮素-3-O-α-D-核糖苷(3)、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷(4)、槲皮素-3-O-α-D-葡萄糖苷(5)、槲皮素-3-O-α-D-木糖苷(6)。通过DPPH自由基清除能力、O-2自由基清除能力、ABTS阳离子自由基清除能力、Fe3+还原能力、总抗氧化能力检测评价了6个化合物的抗氧化活性,维生素C为阳性对照。结果表明6个黄酮类化合物均具有显著抗氧化活性。     

白木乌桕中1个新的木脂素葡萄糖苷

目的研究白木乌桕Neoshirakiajaponica醋酸乙酯提取物中木脂素类化学成分及其抗神经炎症和DPPH自由基清除活性。方法利用多种色谱手段(硅胶、SephadexLH-20、ODS和制备型HPLC等)对醋酸乙酯提取物的化学成分进行分离纯化,再借助现代波谱手段(紫外、红外、核磁、质谱、圆二色谱)和化学方法对其进行结构鉴定,采用脂多糖(LPS)刺激的BV-2小胶质细胞释放NO模型分析化合物对NO产生的抑制作用,评价其潜在的抗神经炎症活性;另外以维生素C(Vc)作为阳性对照分析化合物对DPPH自由基的清除能力。结果首次从白木乌桕醋酸乙酯提取物中分离得到2个木脂素葡萄糖苷类化合物,分别鉴定为(-)-松脂醇4-O-[6-O-(E)-咖啡酰基]-β-D-吡喃葡萄糖苷(1)和(+)-松脂醇4-O-[6-O-(E)-咖啡酰基]-β-D-吡喃葡萄糖苷(2);DPPH自由基清除活性实验结果显示,化合物2对DPPH自由基清除的半数抑制浓度(IC_(50))为38.1μmol/L。结论化合物1为新化合物,命名为白木乌桕糖苷A。与阳性对照Vc相比,化合物2对DPPH自由基有一定的清除能力。     

尖齿臭茉莉的化学成分及其自由基清除活性研究

目的研究尖齿臭茉莉Clerodendrum lindleyi根和茎的化学成分及其体外自由基清除活性。方法采用多种柱色谱技术进行分离纯化,根据化合物的理化性质和波谱数据进行结构鉴定;并采用DPPH法对分得的化合物进行体外自由基清除活性测试。结果从尖齿臭茉莉中分离得到13个化合物,分别鉴定为白桦脂酸(1)、单乙酰马蒂罗苷(2)、4″-O-乙酰马蒂罗苷(3)、赪桐苷A(4)、3″,4″-O-乙酰马蒂罗苷(5)、洋丁香苷(6)、木栓酮(7)、粘霉烯醇(8)、蒲公英萜醇(9)、钩大青酮(10)、海通酮E(11)、(24S)-乙基胆甾-5,22,25-三烯-3β-醇(12)、hedyotol C 4″-O-β-D-glucopyranoside(13)。化合物1～6从根中分离得到,7～13从茎中分离得到。化合物1～12显示了不同程度的DPPH清除活性。结论化合物1～13均为首次从该植物中分离得到,化合物13为首次从该属植物中分离得到。分离得到的苯乙醇苷类、萜类及甾醇类成分均具有一定的DPPH清除作用,其中苯乙醇苷类成分4″-O-乙酰马蒂罗苷、单乙酰马蒂罗苷和洋丁香苷活性最为显著。     

鼠曲草化学成分及其抗氧化活性研究

目的研究鼠曲草Gnaphalium affine的化学成分及其抗氧化活性。方法采用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱等方法分离纯化,根据理化性质和波谱数据进行结构鉴定。测定了化合物1、3~11、16对DPPH自由基的清除活性。结果从鼠曲草95%乙醇部位分离得到了17个化合物,分别鉴定为芹菜素(1)、二氢芹菜素(2)、木犀草素(3)、白杨素(4)、汉黄芩素(5)、豆甾醇(6)、β-谷甾醇(7)、熊果酸(8)、齐墩果酸(9)、19α-羟基熊果酸(10)、2α,3α,19α-trihydroxy-28-norurs-12-ene(11)、α-香树酯醇乙酸酯(12)、β-香树酯醇乙酸酯(13)、patriscabratine(14)、aurantiamide acetate(15)、4′-hydroxydehydrokawain(16)、异香草醛(17)。化合物1和3~5有显著的抗氧化活性。结论化合物2、4、5、11~15、17为首次从该植物中分离得到。     

花椒化学成分及其抗氧化活性

目的研究花椒Zanthoxylum bungeanum正丁醇部位化学成分及其抗氧化活性。方法采用多种柱色谱和高效液相色谱(HPLC)等进行分离纯化,利用NMR等多种波谱技术鉴定化合物结构;运用ABTS+和DPPH自由基清除法对所得化合物进行抗氧化活性评价。结果从花椒正丁醇部位分离得到1个新化合物和13个已知化合物,分别鉴定为4-O-(3′,4′-亚甲二氧基肉桂酰基)-肉桂酸甲酯(1)、苔黑酚(2)、1-甲氧基-7R,8S-二羟基苯丙醇(3)、咖啡酸甲酯(4)、没食子甲酯(5)、3-甲基2-烯丁醇-1-葡萄糖苷(6)、腺苷(7)、紫花前胡苷(8)、blumenol C glucoside(9)、(6R,9S)-3-氧-α-紫罗兰醇-β-D-吡喃葡萄糖苷(10)、长寿花糖苷(11)、丁香树脂酚-4′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(12)、(+)-南烛木树脂酚(13)、异落叶松脂素(14)。ABTS+和DPPH自由基清除实验表明,化合物2、4、5和12～14具有抗氧化活性,其中化合物13和14的ABTS+自由基清除活性半数抑制浓度(IC50)分别为5.7和11.0μmol/L,与阳性对照维生素C(Vc)的IC50(6.4μmol/L)相当。化合物4、5和13的DPPH自由基清除活性IC50分别为61.2、19.8和101.0μmol/L,与阳性对照Vc的IC50(53.0μmol/L)相当。结论化合物1为1个新化合物,命名为花椒酚A;其中化合物1～5、7～10和14首次从花椒属植物中分离得到,化合物12首次从花椒中分离得到。化合物2、4、5和12～14具有一定的抗氧化活性。     

海洋真菌Aspergillus sp.SCS-KFD66的次级代谢产物研究

目的对海洋真菌Aspergillus sp. SCS-KFD66发酵液中次级代谢产物进行分离鉴定,并测定其生物活性。方法采用硅胶柱色谱、SephadexLH-20凝胶柱色谱和高效液相色谱等技术对化合物进行分离纯化;运用多种波谱方法对分离所得化合物进行结构鉴定;分别采用DPPH法、Ellman比色法和PNPG法对化合物的自由基清除能力、乙酰胆碱酯酶抑制活性及α-葡萄糖苷酶抑制活性进行测试;采用96孔板微量法测定所得化合物对大肠杆菌Escherichiacoli、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、单增李斯特菌Listeriamonocytogenes的抑制活性及最小抑菌浓度。结果从海洋真菌Aspergillus sp. SCS-KFD66发酵液中分离得到13个化合物,分别鉴定为3-epi-trans-4-hydroxylinalool-3,6-oxide(1)、trans-4-hydroxylinalool-3,6-oxide(2)、芦荟大黄素(3)、大黄素(4)、6-羟基芦荟大黄素(5)、原儿茶醛(6)、2,5-二羟基苯甲醛(7)、对羟基苯乙酸甲酯(8)、对羟基苯甲酸(9)、对羟基苯乙酸(10)、2-(4-羟苯基)乙醇(11)、对羟基反式肉桂酸(12)、反式阿魏酸(13)。活性测试结果表明化合物1、6、7、9～13都具有清除自由基活性,化合物4和6具有乙酰胆碱酯酶抑制活性,化合物6和7具有α-葡萄糖苷酶抑制活性;化合物4具有金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌抑制活性,MIC值分别为16、64μg/m L;化合物6具有抑制大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和单增李斯特菌活性,MIC值分别为64、128和128μg/m L。结论分离得到12个已知化合物和1个新化合物,其中化合物1为新化合物,命名为曲霉呋喃醇。     

黄边灵芝麦角甾类化学成分及其细胞毒活性研究

目的:研究黄边灵芝的麦角甾类化学成分,并对分离得到的化学成分进行细胞毒活性筛选。方法:采用硅胶柱层析、Sephadex LH-20柱色谱和制备薄层色谱、半制备高效液相色谱等方法对黄边灵芝的化学成分进行分离纯化,采用NMR、MS等波谱学手段对分离得到的化合物进行结构鉴定,运用MTT法筛选所得成分对小鼠结肠癌细胞CT26的细胞毒活性进行研究。结果:从黄边灵芝中分离得到了7个麦角甾类化合物,分别鉴定为:5α,8α-过氧麦角甾-6,22-二烯-3β-醇(1)、5α,8α-过氧麦角甾-6,9(11),22-三烯-3β-醇(2)、麦角甾醇(3)、麦角甾-7,22-二烯-3β-醇(4)、麦角甾-7,22-二烯-3-酮(5)、calvasterol A(6)和volemolide(7)。化合物1~5抑制CT26细胞增殖的IC50值分别为76.93、37.19、13.02、48.19和1.25μmol/L。结论:所有化合物均为首次从黄边灵芝中分离得到,其中,化合物6、7为首次从灵芝属真菌中分离得到,且化合物1~5对CT26细胞表现出了显著的细胞毒活性。     

窄叶芍药的化学成分及其抗氧化活性

目的:研究窄叶芍药的化学成分,并对分离得到的化合物进行抗氧化活性评价。方法:采用反复硅胶柱色谱法和Sephadex LH-20柱色谱法等进行分离纯化,并通过理化常数测定和光谱分析鉴定其化学结构;并采用1,1-二苯基-2-硝基苯肼自由基清除法(DPPH)和2,2-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸-6)二铵盐自由基清除法(ABTS)对化合物的体外活性进行评价。结果:从窄叶芍药中分离得到5个化合物,并鉴定为没食子酸乙酯(1),没食子酸甲酯(2),齐墩果酸(3),丁香酸(4),β-谷甾醇(5);对化合物1~4进行抗氧化活性测试,结果表明:阳性药(维生素C,VC)及化合物1和2对DPPH自由基的半数清除率(IC50)分别达到(35.13±0.28),(44.64±0.37)μmol·L-1,均低于阳性对照抗坏血酸IC50(60.17±0.98)μmol·L-1;阳性药及化合物1和2对ABTS自由基的IC50分别达到(25.13±0.68),(35.76±1.48)μmol·L-1,均低于阳性对照抗坏血酸IC50(38.55±0.78)μmol·L-1。结论:化合物3,4首次从该植物中分离得到,并且化合物1和化合物2具有很强的抗氧化活性,其余化合物的抗氧化活性较弱。     

刺五加GPS基因克隆及表达特征与皂苷含量相关性研究

目的克隆刺五加香叶基焦磷酸合成酶(geranyl pyrophosphate synthase,GPS)基因的cDNA序列并分析基因序列特征、不同器官中基因表达水平及其与皂苷含量的相关性。方法提取刺五加的RNA,逆转录为cDNA。根据转录组测序结果中编码GPS的unigene(c37362.graph_c0),设计特异性引物,经过PCR扩增GPS基因的cDNA全长。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析GPS基因在不同器官中的表达水平,并通过分光光度法检测刺五加总皂苷含量。结果克隆得到长1260bp、编码419个氨基酸的刺五加GPS基因cDNA。GPS蛋白定位于线粒体内且不存在跨膜区域。GPS基因在各个器官中均有表达,在叶片中的表达量最高,是根中表达量的5.26倍。GPS基因的相对表达量与皂苷量呈现出同升同降的变化趋势,表现为显著正相关关系(r=0.851,P0.05)。结论首次克隆获得刺五加GPS基因的cDNA全长序列,明确了刺五加GPS基因的表达量与皂苷含量之间存在正相关关系。     

刺五加GAPDH基因组DNA的克隆与分析

目的克隆刺五加GAPDH基因的DNA及启动子序列,并进行生物信息学分析。方法以刺五加的基因组DNA为模板,采用PCR和TAIL-PCR技术克隆GAPDH基因的全长DNA序列及5’端上游启动子序列,并对其进行生物信息学分析。结果克隆到长4 103 bp的刺五加GAPDH基因全长DNA及启动子序列。该基因共包含12个外显子和11个内含子,其剪切均符合GT-AG原则。刺五加GAPDH的启动子片段长1 304 bp,转录起始位点A位于起始密码子ATG上游61 bp处。启动子除含有TATA-box、CAAT-box等基本元件外,还有诸多与激素应答、光响应和胁迫信号等有关的顺式作用调控元件。结论首次克隆到刺五加GAPDH基因的全长DNA及启动子序列,为深入研究GAPDH基因结构特征与功能奠定基础。     

刺五加转录组和差异性表达分析

目的获得刺五加Eleutherococcus senticosus转录组数据库和差异表达基因。方法采用皂苷高含量组和低含量组2个样本作为受试材料,采用二代测序方法中的Illumina Hi Seq 4000进行转录组测序,并进行系统的生物信息学分析。结果共获得8.34 Gb数据,拼接得到77 087条Unigenes,与5个基因数据库进行比对,可归类于55个Geneontology(GO)分类中,涉及到116个KEGG标准代谢通路。通过差异性分析发现,差异性表达基因共530条,其中上调基因占42.08%,下调基因占57.92%,相差较大。进行GO和Pathway富集,得到408个GO注释和40个代谢通路。结论对刺五加转录组进行拼接、组装和功能注释,得到大量转录本信息,为刺五加分子生物学研究提供了宝贵的基因组数据库资源。     

刺五加MDD基因启动子的克隆与生物信息学分析

目的克隆并分析刺五加甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(mevalonate diphosphate decarboxylase,MDD)基因的启动子序列。方法根据刺五加MDD基因的c DNA序列,采用PCR扩增和热不对称交错PCR(TAIL-PCR)技术,克隆MDD基因5’端的DNA序列及启动子序列。利用Plant CARE等软件对其进行生物信息学分析。结果克隆得到长1 423 bp的刺五加MDD基因启动子序列及长1 024 bp的5’端DNA序列。该启动子序列含有49个TATA-box、25个CAAT-box。还含有脱落酸响应元件、茉莉酸甲酯响应元件、胚乳表达必须顺式作用元件、干旱胁迫响应元件、光响应元件等多种顺式作用元件,以及2个MYBHv1与2个MBY结合位点。结论首次克隆并分析了刺五加MDD基因的启动子序列,为该基因的表达调控奠定了基础。     

刺五加液泡膜内在蛋白基因的克隆与表达分析

目的克隆刺五加的液泡膜内在蛋白(tonoplast intrinsic proteins,TIP)基因,并对其进行生物信息学和表达分析。方法采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆刺五加TIP基因cDNA的全长序列。以GAPDH为内参照基因,通过RT-PCR法检测TIP基因在不同生长发育时期和器官中的表达情况。结果刺五加TIP基因cDNA的全长1 080 bp,开放阅读框长756 bp,编码251个氨基酸的蛋白,该蛋白包含TIP家族的标志性序列。刺五加的TIP蛋白具有6个跨膜螺旋,定位于液泡膜。表达分析结果显示,刺五加TIP基因在不同生长发育时期和不同器官中均有表达,但表达量具有显著差异(P<0.05)。其中盛花期的表达量最高,是最低量果实快速生长期的2.07倍;各器官中,叶片的表达量最高,是最低量根的1.73倍。结论首次分离到刺五加TIP基因的cDNA全长序列,并证实其在盛花期的叶中表达量最高,为进一步研究TIP基因对刺五加水分代谢的影响奠定基础。     

栝楼化学成分的研究及其α-菠菜甾醇的含量测定(Ⅰ)

目的：研究栝楼了Trichosanthes kirilowii Maxim。的化学成分并建立栝楼中α－菠菜甾醇的含量测定方法。方法：采用反复硅胶柱层析分离纯化，通过理化常数测定和光谱分析鉴定其化学结构。采用双波长薄层扫描法研究栝楼中α－菠菜甾醇的含量测定方法。结果：从栝楼中分离得到12个化合物，已鉴定其中10个化合物：正三十四烷酸（tetratriacontanoic acid,I),2-甲基－3，5－二羟基四氢吡喃－4－酮（5－oxymaltol,Ⅱ），α－菠菜甾醇－β-D-葡萄糖苷（β-D-glucopyranosyl-α-spinasterol,Ⅲ），葡萄糖（glucose,Ⅳ），富马酸（fumaric acid,V)，琥珀酸（succinic acid,Ⅵ），尿嘧啶（uracil,Ⅶ），正三十四烷（tetratriacontane,Ⅸ），α－菠菜甾醇（α-spinasterol,X),栝楼仁二醇（karounidiol,Ⅺ）。化合物Ⅷ和Ⅶ正在鉴定中。测定栝楼中α－菠菜甾醇的含量为0．0171％。结论：化合物I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅶ、Ⅸ均首次从该植物中分离得到。而且该含量测定方法灵敏性高，稳定性和重现性较好，可作为栝楼生药的检测方法。     

刺五加肌动蛋白基因的克隆和表达稳定性分析

目的 克隆刺五加Eleutherococcus senticosus的肌动蛋白(actin,ACT)基因并使其成为可用的内参基因.方法 运用RT-PCR法克隆ACT基因的部分序列,并以其为内参基因进行半定量PCR和real-time PCR分析.结果 克隆了长度为1 031bp的刺五加ACT基因,推测其编码343个氨基酸,与光皮桦Betula luminifera、陆地棉Gossypium hirsutum、茶树Camellia sinensis的ACT氨基酸序列同源性分别为99.42％、98.83％、98.54％.刺五加ACT基因在不同器官和不同生长发育时期的表达量基本恒定,以其为内参基因的半定量PCR和real-time PCR均具有良好的扩增效果和重现性.结论 首次分离并报道了刺五加ACT的cDNA克隆,证实该序列可以作为基因表达分析的内参基因,建立了其real-time PCR反应体系.     

土知母药材及其混淆品HPLC指纹图谱研究

目的：研究并建立土知母药材的指纹图谱。方法：采用高效液相色谱法,Diamonsil C₁₈柱（4.6 mm×200 mm,5 μm）,乙腈-0.2磷酸溶液进行梯度洗脱,检测波长275 nm,柱温30 ℃,对19个不同来源的药材进行了检测。结果：建立了土知母药材HPLC指纹图谱共有模式,15个共有峰被标定,对19批土知母及混淆品进行了相似度比较。12批土知母药材的相似度均>0.90,7批混淆品均<0.65。结论：HPLC指纹图谱鉴别土知母及混淆品具有重复性好、特征性强、方法简便等特点,可作为土知母药材鉴别方法。     

淫羊藿化学成分分离鉴定

[目的]研究淫羊藿叶的化学成分。[方法]综合运用溶剂法提取、萃取、正相硅胶、Sephadex LH-20、反相ODS以及制备高效液相色谱等分离纯化方法,对淫羊藿叶化学成分进行分离,通过质谱、核磁共振波谱等方法鉴定各单体化合物结构。[结果]从淫羊藿干燥叶的95%乙醇提取物(V/V)中共分离鉴定7个化合物,分别为2,3,4,6,7-五甲氧基-菲(1)、4,5,-二羟基-2,3,6-三甲氧基-9,10-二氢菲(2)、5,7,4′-三甲氧基-4-苯基香豆素(3)、3,5,7,4′-四甲氧基黄酮(4)、4-羟基-3-异戊二烯基-苯甲酸(5)、4-羟基肉桂酸甲酯(6)、4-羟基-(2E)-2-壬烯酸(7)。[结论]化合物1~7均为首次从淫羊藿属分离得到化合物。     

苦皮藤组织培养与植株再生

目的 研究药用植物苦皮藤组织培养技术，为工厂化育苗及工业化获取苦皮藤次生代谢产物提供行之有效的途径。方法以苦皮藤子叶和胚轴为外植体，采用MS培养基，附加不同的植物激素进行实验。结果MS 2，4-D2mg／L培养基适合愈伤组织诱导；MS 6-BA2mg／L NAA0．2mg／L培养基适合芽的分化,MS 6-BA1mg／L NAA0．2mg／L培养基适合芽的增殖；将芽转至MS MET0．7mg／L IBA0．5mg／L培养基暗培养10d后，转入1／2MS培养基光下培养形成根;试管苗移栽成活率为85％。结论通过诱导愈伤组织途径可以达到快速繁殖的目的;较高浓度的2，4-D对苦皮藤愈伤组织的诱导有利；6-BA对愈伤组织的生长有明显促进作用;多效唑、暗培养对根的分化是必需的。