运用高灵敏度COLD-PCR法检测胰腺癌和结直肠癌患者KRAS基因突变

目的 评价COLD-PCR法检测胰腺癌和结直肠癌患者KRAS基因突变的价值.方法 采用COLD-PCR/Sanger测序法与普通PCR/Sanger测序法检测KRAS基因野生型结直肠癌细胞系SW116中混有的KRAS基因突变型和结直肠癌细胞系SW480中的KR4S基因突变,确定两种方法 的灵敏度,并采用两种方法 分别检测20例胰腺癌和39例结直肠癌患者石蜡包埋组织的KRAS基因突变,并评价两种方法 的符合率.结果 细胞系检测结果 显示,普通PCR/Sanger测序法和COLD-PCR/Sanger测序法检测KRAS基因突变的灵敏度分别为1∶20和1∶100(突变型:野生型).COLD-PCR/Sanger法检测20例胰腺癌患者KRAS基因突变率[75%(15/20)]高于普通PCR/Sanger测序法[40%(8/20),x2=5.013,P<0.05];COLD-PCR/Sanger测序法检测39例结直肠癌患者的KRAS基因突变率[44%(17/39)]高于普通PCR/Sanger测序法[31%(12/39),x2=1. 372,P=0.174)].两种方法 检测胰腺癌标本的符合率为65%,但一致性较差(Kappa=0.364,P<0.05);而两种方法 检测结直肠癌标本的符合率为87%,且一致性较好(Kappa=0.730,P<0.05).结论 COLD-PCR/Sanger测序法是一种高灵敏性检测胰腺癌和结直肠癌患者KRAS基因突变的方法 .     

结直肠癌患者应用ARMS法检测KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因突变分析

目的探讨结直肠癌(CRC)患者应用扩增阻碍突变系统(Amplification Refractory Mutation System,ARMS)法检测KRAS、NRAS、PIK3CA及BRAF基因突变情况并分析其与临床病理特征的关系。方法收集中国医科大学附属盛京医院60例结直肠癌患者手术切除组织,采用ARMS法检测KRAS、NRAS、PIK3CA及BRAF基因突变情况。结果 KRAS基因突变23例,突变率为38.3%;NRAS基因突变1例,突变率为1.7%;PIK3CA基因突变4例,突变率为6.7%;BRAF基因突变3例,突变率为5%。检出双突变2例,分别为PIK3CA与KRAS突变,PIK3CA与BRAF突变。有淋巴结转移患者KRAS基因突变率显著高于无淋巴结转移患者(P=0.031)。KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因突变之间无明显相关性。结论在结直肠癌患者中,KRAS基因突变率最高,且多发生于有淋巴结转移患者,NRAS、PIK3CA、BRAF基因突变率较低。对结直肠癌患者进行KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因联合检测,为临床个体化靶向治疗提供更准确的理论依据。     

非小细胞肺癌838例EGFR、KRAS基因突变状态及临床意义

目的探讨非小细胞肺癌(NSCKC)中EGFR、KRAS基因突变与患者临床病理特征的相关性。方法采用ARMS法和Sanger测序法检测838例NSCLC样本中EGFR和KRAS基因的突变情况,同时收集患者的临床病理资料,并分析之间的相关性。结果 EGFR、KRAS突变率分别为42.24%、10.98%。EGFR突变以21外显子L858R和19外显子Del突变为主,占所有突变的87.85%; EGFR突变在女性患者中的突变率明显高于男性(P0.01),在腺癌中的突变率明显高于非腺癌(P0.01),在不吸烟患者中的突变率明显高于吸烟患者(P0.01)。KRAS突变以外显子2突变为主,占所有突变的92.39%,其中12密码子突变占86.96%; KRAS突变在男性患者中的突变率明显高于女性(P0.01),在腺癌中的突变率明显高于非腺癌(P0.01),在吸烟患者中的突变率明显高于不吸烟者(P0.01)。EGFR、KRAS突变与患者年龄、有无淋巴结转移无相关性(P0.05)。结论潍坊地区NSCLC患者中EGFR突变以21外显子L858R和19外显子Del突变为主; KRAS突变以外显子2第12密码子突变为主; EGFR和KRAS基因突变与患者性别、组织学类型及吸烟密切相关。     

HRM法检测结直肠癌组织KRAS基因密码子12和13点突变

目的 建立HRM法检测大肠癌患者肿瘤组织KRAS(v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog)基因突变的方法 .方法 采用HRM法对含不同比例KRAS基因突变型质粒的系列混合样本进行检测,以评价其灵敏度.应用HRM法检测60份大肠癌患者新鲜肿瘤组织KRAS基因密码子12和13的突变状况,并与直接测序法的结果 进行比较分析.结果 HRM法只需在PCR结束后直接运行高分辨熔解,即可获得检测结果 .HRM法可检出系列混合样本中突变型质粒比例为10%的突变,其检测灵敏度达10%.HRM法从60份大肠癌患者组织标本中,检出17份KRAS基因密码子12或13突变(28.3%);直接测序法检出15份(25.0%)突变,2份未检出KRAS基因突变.HRM法检测的敏感度为100%(15/15),特异度为96%(43/45).结论 HRM法在筛选大肠癌标本的KRAS基因突变类型时,具有操作简便、快速、灵敏,单管避免污染等优点,完全符合临床个体化治疗的要求,值得推广.     

以测序法为准比较HRM法、ADx-ARMS法和TaqMan探针法检测肺腺癌EGFR基因突变的敏感性

目的采用高分辨率熔解曲线法(HRM法)、Adx-ARMS法、Taq Man探针法和直接测序法检测肺腺癌组织中表皮生长因子受体基因(EGFR)的突变情况,并比较各方法的检测效率和敏感性。方法收集20例肺腺癌石蜡包埋肿瘤组织,其中18例为手术切除标本,2例为穿刺小标本,应用HRM法、ARMS法和Taq Man探针法分别检测EGFR基因突变,对检测结果不一致的样本采用测序法加以验证。结果 20例肺腺癌组织样本中,HRM法、ARMS法和Taq Man法分别在13例、10例和8例组织中检测到EGFR基因突变,差异不显著(P0.05)。差异标本经测序验证后发现,HRM法可检测未知突变,而ARMS法和Taq Man探针法只能检测已知突变。对于2例穿刺小标本,HRM法和ARMS法均检测到突变,而Taq Man探针法未检测出突变,HRM法和ARMs法的检测敏感性高于Taq Man探针法。结论 HRM法、ARMS法、Taq Man探针法和测序法各有优缺点,HRM法敏感性最高,且能检测到少见突变与未知突变,因此HRM法结合测序法能更全面的检测出各种突变类型。     

ARMS法检测肺腺癌EGFR基因突变及临床意义

目的 探讨扩增阻滞突变系统(ARMS)法在肺腺癌中表皮生长因子受体(EGFR)基因突变检测的应用及其临床意义。方法 收集2015年1月～2016年8月西安交通大学第一附属医院病理科的肺腺癌标本566例作为研究对象。其中,胸腔积液细胞块标本34例,肺活检标本401例,手术切除标本131例,采用ARMS法进行石蜡标本EGFR基因突变检测,分析EGFR基因突变与肺腺癌患者临床资料的相关性。结果 肺腺癌标本566例中,吸烟腺癌患者239例,非吸烟腺癌患者327例。吸烟患者中,EGFR突变率与患者年龄、性别、手术方式等无明显关联(P>0.05),而与肺癌原发部位关系密切(P<0.05); 非吸烟患者中,EGFR突变率与性别、年龄、标本类型及肺癌原发病灶部位无明显相关性(P>0.05)。结论 ARMS法可有效应用于肺腺癌临床病理石蜡标本中EGFR基因突变检测。吸烟是EGFR突变率的重要影响因子,且对左、右肺均有影响,但是对右肺的影响较大。     

非小细胞肺癌患者胸腔积液中EGFR基因突变的检测及临床意义

目的:探讨采用非小细胞肺癌患者胸腔积液标本肿瘤细胞进行表皮生长因子(epidermal growth factor receptor,EGF R)基因突变检测的可行性及其临床意义。方法:采用Sanger测序法检测17例非小细胞肺癌患者胸腔积液及对应的17例手术或肺部穿刺组织标本EGFR基因18~21外显子基因突变,并进行统计分析。结果:胸腔积液标本17例共检出5例突变,检出率29.41%。手术或穿刺组织标本17例共检出7例突变,检出率41.18%。胸腔积液标本EGFR基因突变检出率略低于手术或穿刺组织标本。结论:采用Sanger测序法进行非小细胞肺癌患者胸腔积液中EGFR基因突变的检测,方法可行,尤其适用于无法获取手术或肺部穿刺组织标本的患者。     

早期结直肠癌患者的静脉血KRAS基因突变检测

目的检测早期结直肠癌患者的静脉血鼠类肉瘤病毒癌基因(KRAS)突变情况。方法将肠镜留取的患者结直肠癌组织标本进行病理学诊断,将病理学诊断为腺瘤伴高级别癌变的24例患者作为试验组,诊断为正常的12例患者纳入对照组。采用艾德-扩增阻滞突变系统(ARMS)检测标本的19种KRAS基因突变。结果试验组24例腺瘤伴高级别癌变患者肿瘤发生部位和组织学类型比较,差异无统计学意义(P0.05)。试验组24例静脉血和对照组12例静脉血标本中KRAS基因均未检出突变。结论早期结直肠癌(和癌前)患者的血液中KRAS基因突变量较低,需要提高检测方法的灵敏度。     

结直肠癌组织中MMR蛋白表达、MSI、RAS和BRAF 基因突变与临床病理特征的关系

目的 探讨结直肠癌患者癌组织中错配修复(MMR)蛋白表达、微卫星不稳定性(MSI)、大鼠肉瘤(RAS)基因和致癌同源体B1(BRAF)基因突变与临床病理特征的关系。方法 选取该院2022年1-12月接受根治手术治疗的352例结直肠癌患者的肿瘤组织和血液标本、42例非肠癌患者的实体瘤组织和血液标本，采用免疫组化法检测MMR蛋白表达，一代测序片段分析法检测MSI,实时荧光定量聚合酶链反应检测KRAS、NRAS和BRAF基因突变状态，分析MMR蛋白表达、MSI和3种基因突变状态与结直肠癌临床病理特征的关系。结果 352例CRC患者肿瘤组织中检出MMR缺陷(dMMR)29例(8.2%),高度微卫星不稳定(MSI-H)26例(7.4%),KRAS基因突变161例(45.7%),NRAS基因突变13例(3.7%),BRAF基因突变11例(3.1%)。与dMMR有关因素为低龄、黏液腺癌、原发于右半结肠癌(P<0.05);与MSI-H相关因素包括低龄、肿瘤家族史、原发于右半结肠癌(P<0.05);KRAS和NRAS基因高突变率分别与黏液腺癌和淋巴结转移有关(P<0.05);BRAF基...     

HRM法检测结直肠癌患者循环DNA中KRAS和EGFR基因突变

摘要:目的：探讨高分辨率熔解曲线(HRM) 法检测结直肠癌患者循环DNA中KRAS和EGFR基因突变的可行性。 方法：用HRM法检测70例结直肠癌患者KRAS基因2号和3号外显子以及EGFR基因19和21号外显子的突变情况,用直接测序法验证结果的准确性。 结果：70 例结直肠癌患者血液标本经HRM法、直接测序法分别检测到18例(25.7%)和17例(24.3%)KRAS基因2号外显子突变;均检测到3例EGFR基因19号外显子突变(4.3%);两法均未检测到3号外显子和21号外显子突变。HRM检测与直接测序法结果符合率为99.6% (279/280)。 结论：HRM法检测结直肠癌患者血样本KRAS和EGFR基因突变,具有准确度高、操作简单、检测成本低等优点,适合在临床推广应用。     

高分辨率熔解曲线分析法检测非小细胞肺癌KRAS和BRAF基因突变

目的探讨高分辨率熔解曲线分析(HRM)法检测非小细胞肺癌(NSCLC)中KRAS和BRAF基因突变用于临床检测的可行性。方法用HRM法检测64例NSCLC患者KRAS基因第2外显子和BRAF基因第15外显子的突变情况,用直接测序法对结果进行验证。结果 HRM法检测结果表明有9例NSCLC患者发生KRAS基因突变(14.06%)、4例发生BRAF基因突变(6.25%),直接测序法证实两法的结果完全一致;共检测出4种KRAS基因突变类型,G12C(GGT>TGT)的突变率最高(44.4%),BRAF基因突变型均为V600E。结论用HRM法检测临床样本KRAS和BRAF基因突变,具有操作简便、结果准确、成本低的优点,适用于临床检测。     

一种KRAS基因突变检测方法的建立及初步应用

目的建立一种KRAS基因实时荧光定量PCR-Sanger测序突变检测方法,并初步探讨其临床应用价值。方法以KRAS基因热点突变区域12、13密码子为研究位点设计特异性扩增、测序引物,利用已知野生型、突变型样品以TA克隆技术构建相应质粒作为标准品,建立KRAS基因实时荧光定量PCR—Sanger测序突变检测方法,并进行方法学和应用评估。结果成功构建了KRAS基因12、13密码子野生型、突变型质粒。建立了KRAS基因实时荧光定量PCR—Sanger测序突变检测方法,该方法灵敏度高（9．39×10^1copies／uL）,重复性好（实时荧光定量PCR部分批内、批间变异系数分别为1．60％、2．54％）。该法与传统Sanger测序法同时检测40例临床样品,结果符合率为100％。结论本研究成功建立了可用于临床样品检测的KRAS基因实时荧光定量PCR—Sanger测序突变检测方法。     

结直肠癌组织基因突变与临床病理及MMR蛋白表达的相关性分析

目的分析结直肠癌组织KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA基因突变与临床病理因素及MMR蛋白表达的相关性。方法采用扩增阻碍突变系统(ARMS)和免疫组化法对122例结直肠癌石蜡组织进行回顾性分析。结果 122例结直肠癌组织中KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA基因突变率分别为48.4%(59/122)、4.1%(5/122)、5.7%(7/122)和5.7%(7/122)。检出KRAS与PIK3CA双突变病例3例,BRAF与PIK3CA双突变1例,未发现BRAF与KRAS或NRAS基因同时突变病例。女性患者KRAS突变率高于男性患者(P0.05),低分化腺癌KRAS突变率高于高、中分化腺癌(P0.001)。女性患者、有淋巴结转移者和MLH1蛋白表达缺失者与男性患者、无淋巴结转移和MLH1表达者比(P0.05),PMS2蛋白表达缺失者比表达者的BRAF突变率更高。黏液腺癌PIK3CA突变率较其他肿瘤组织学类型高(P0.05)。结论该4种基因在结直肠癌的突变率依次为KRAS、 BRAF、PIK3CA、NRAS,不存在4种基因全突变及3种基因突变。BRAF与KRAS、NRAS基因突变存在相互排斥现象。KRAS、BRAF、PIK3CA基因突变与结直肠癌临床病理特征存在相关性。     

焦磷酸测序法检测结直肠癌患者K-ras基因外显子2第12和13密码子点突变

目的 探讨焦磷酸测序法检测结直肠癌患者肿瘤组织K-ras基因外显子2第12和13密码子点突变方法的临床应用价值.方法 以已知K-ras基因突变的结直肠癌细胞株SW480、DLD-1和野生型细胞株HT-29 DNA作为测序模板检验焦磷酸测序法的准确性.对含不同比例(2％、3％、5％、10％、20％、30％和50％)结直肠癌细胞株K-ras基因的DNA混合样本采用焦磷酸测序法进行基因突变率检测,并与Sanger测序结果平行进行Fisher精确检验比较,评价其灵敏度.同时用焦磷酸测序法检测分析30份临床结直肠癌患者石蜡包埋组织中K-ras基因第12和13密码子突变.结果 当混合已知突变类型的结直肠癌细胞株K-ras基因的DNA样本突变DNA比例在5％和10％浓度时,Sanger测序法检出K-ras基因突变率分别为33.3％ (4/12)和58.3％ (7/12),焦磷酸测序法分别为91.7％(11/12)和100％( 12/12),且2种方法检出K-ras基因突变率的差异有统计学意义(P＜0.05).此外,用焦磷酸测序法从30例结直肠癌患者石蜡包埋组织标本中检出K-ras基因外显子2第12和13密码子突变10例,均为杂合型突变,突变率为33.3％ (10/30).最常见的突变类型为G＞A转换[50％(5/1O)]和G＞T颠换[(30％(3/10)].结论 焦磷酸测序法检测结直肠癌K-ras基因外显子2第12和13密码子突变具有敏感、准确的优点,可用于临床个体化治疗中肿瘤基因突变检测.     

焦磷酸测序法快速检测胰腺癌K-ras基因点突变

目的 建立基于焦磷酸测序技术的胰腺癌K-ras基因点突变的检测方法,并与Sanger测序法作一比较.方法 用焦磷酸测序法(Pyrosequencing)和Sanger测序法(Sanger sequencing)分别在10名正常胰腺组织、49例胰腺癌、11例慢性胰腺炎、18例胰腺良性囊肿、7例胰岛素癌、9例壶腹癌、7例胆管癌及7例十二指肠乳头癌石蜡包埋组织的DNA中检测K-rag基因12密码子点突变.结果 采用上述两种方法在所有正常胰腺组织、慢性胰腺炎、胰腺良性囊肿、胰岛素癌、壶腹癌、胆管癌及十二指肠乳头癌均未见K-ras基因点突变,而采用焦磷酸测序法发现胰腺癌石蜡包埋组织K-ras基因点突变率为71.4%(35/49),显著高于采用Sanger测序法发现胰腺癌石蜡包埋组织K-rag基因点突变率(61.2%,30/49).结论 焦磷酸测序法较Sanger测序法更为敏感,且焦磷酸测序法准确、快速、高通量,适合临床标本的批量测定.     

某地区结直肠癌患者KRAS基因及BRAF基因突变状态的检测分析

目的 检测某地区结直肠癌患者KRAS基因和BRAF基因的突变状态及其与年龄、性别的关系.方法 由某地区30例结直肠癌患者石蜡组织中提取DNA,通过直接测序法及荧光定量PCR法检测KRAS基因及BRAF基因突变状态.结果 KRAS基因突变率为43.3%,共发现6种突变类型,主要位于12、13密码子,其中以c.38G>A突变率最高(38.5%).单因素及多因素分析均提示KRAS突变与年龄或性别无相关性.BRAF基因突变率为0.结论 某地区结直肠癌患者KRAS基因突变率高,靶向治疗前进行突变状态检测具有重要临床价值.     

KRAS基因在非小细胞肺癌患者外周血和肿瘤组织中的突变研究

目的 KRAS基因突变可能导致非小细胞肺癌(NSCLC)表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)治疗的耐药。本研究旨在探讨外周血检测KRAS基因的可行性,以及对EGFR-TKIs治疗的疗效预测价值。方法应用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)法检测120例NSCLC患者外周血标本和97例肿瘤组织标本KRAS基因突变情况,其中70例外周血标本和肿瘤组织相匹配。全组共55例接受EGFR-TKIs治疗,52例可评价疗效。比较外周血和组织标本突变一致性,分析KRAS基因突变和患者临床特征相关性。结果外周血标本中检测出14例突变(11.7%),组织中11例(11.3%),两种标本一致性为75.0%。接受EGFR-TKIs治疗患者中,外周血标本35例,其中检测KRAS突变者2例,疗效评价均为疾病进展(PD);未突变者33例,客观缓解率(ORR)27.3%,疾病控制率(DCR)57.6%。组织标本45例,其中检测KRAS突变者4例,疗效评价均为PD;未突变者41例,ORR26.8%,DCR56.1%。结论 NSCLC患者外周血和肿瘤组织中KRAS基因突变一致性较高,组织中检测KRAS基因突变和EGFR-TKIs...     

急性髓系白血病患儿FLT3-ITD、CEBPA、NPM1、DNMT3A、RAS基因突变特征及临床意义

目的探讨急性髓系白血病(AML)患儿FLT3、CEBPA、NPM1、DNMT3A、NRAS和KRAS基因突变特征及其临床预后意义。方法收集217例初诊AML患儿骨髓标本,采用PCR扩增产物Sanger测序法检测FLT3、CEBPA、NPM1、DNMT3A、NRAS和KRAS基因突变情况,收集临床资料,探究各基因突变的临床特征及预后意义。结果本研究中突变率最高的是NRAS(11.9%),其他依次为CEBPA(10.0%)、FLT3-ITD(5.7%)、KRAS(3.0%)、NPM1(1.4%),未检测出DNMT3A突变。KRAS突变均发生于M5型,NPM1突变均发生于M2型。FLT3-ITD突变组外周血白细胞计数(×109/L)较非突变组明显升高[104.0(19.8,201.0)vs 11.4(3.8,38.7),Z=-3.061,P=0.002];KRAS突变组年龄明显低于非突变组[2.0(1.0,3.3)岁vs 7.0(3.0,10.0)岁,Z=-2.282,P=0.005]。FLT3-ITD突变组患儿总生存率较非突变组明显降低(25.0%vs 52.5%,χ2=4.993,P=0.026);无病生存率呈减低趋势(33.3%vs 60.6%,χ2=3.750,P=0.053)。RAS突变组与非突变组预后差异无统计学意义。结论 FLT3-ITD突变是AML患儿患者的不良预后指标。     

3D数字PCR检测NSCLC患者血浆EGFR T790M基因突变的临床意义

目的探讨一种新的3D数字聚合酶链反应(PCR)在非小细胞肺癌(NSCLC)患者血浆表皮生长因子受体(EGFR)T790M基因突变检测中的临床意义。方法采集70例初代表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)耐药的NSCLC患者血浆标本。采用扩增阻滞突变系统(ARMS)和3D数字PCR进行EGFR T790M基因突变检测,如检测结果不同,则取同期组织蜡块标本采用ARMS进行验证。结果 70例NSCLC患者血浆标本中,ARMS检出EGFR T790M突变30例,3D数字PCR检出EGFRT790M突变34例,其中4例3D数字PCR检测为EGFRT790M阳性,而ARMS显示为野生型。Kappa一致性检验和配对χ2检验结果显示,2种检测方法诊断结果存在较好的一致性(Kappa值为0.885,P0.001)。结论 3D数字PCR适用于检测NSCLC患者血浆EGFR T790M基因突变,并且能检测出ARMS漏检的病例。     

396例非小细胞肺癌EGFR,KRAS,ALK和BRAF基因突变状态及其临床病理特征

目的:探讨非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者表皮生长因子受体(EGFR)基因、Kirsten鼠肉瘤基因(KR AS)、间变性淋巴瘤激酶(ALK)基因和鼠类肉瘤病毒癌基因同源物B1(BR AF)基因的表达及其临床病理特征。方法:收集郑州大学第一附属医院病理确诊NSCLC患者396例临床病理资料,采用高通量二代测序(next-generation sequencing,NGS)检测肿瘤组织中EGFR,KRAS,A L K和B R A F基因的突变状态,分析基因的突变率及其与临床病理特征的关系。结果:EG F R基因突变阳性率为49.24%(195/396例),女性、腺癌、非吸烟患者中突变率较高(P0.05);KRAS基因突变阳性率为8.59%(34/396例),男性、腺癌、大于60岁老年吸烟患者中突变率较高(P0.05);ALK基因突变阳性率为6.06%(24/396例),60岁以下年轻患者中突变率较高;BRAF基因突变阳性率为3.28%(13/396例)。其中EGFR合并ALK突变共存1例,EGFR合并BR AF突变共存2例,KRAS合并ALK突变共存1例,ALK合并BRAF突变共存1例,KRAS合并BRAF突变共存1例,EGFR,KRAS合并BRAF三基因突变共存1例。结论:NSCLC患者EGFR,KRAS,ALK和BRAF基因突变阳性率与国内外报道相仿,与患者临床病理特征存在相关性,存在2个及以上基因突变共存,共存突变患者的临床治疗方案仍有待进一步研究提供循证依据。