Edg4基因小分子干扰RNA载体的构建及其对卵巢上皮性癌细胞的沉默效应

目的构建针对Edg4基因的小分子干扰RNA（siRNA）载体，初步观察其对卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞的沉默效应。方法利用软件分析、设计针对人Edg4 mRNA的siRNA靶序列，合成发夹样DNA序列；退火成双链，克隆至真核表达载体pRNAT—U6．1质粒上，经PCR技术鉴定及DNA双向测序证实其序列无误后，用脂质体包裹并转染卵巢癌细胞系SKOV3细胞，用荧光显微镜初步观察其在SKOV3细胞中的转染率。采用实时荧光定量荧光定量PCR技术检测转染前后SKOV3细胞中Edg4 mRNA的表达，生化法测定转染前后SKOV3细胞上清液中溶血磷脂酸（LPA）含量的变化，流式细胞术检测转染后SKOV3细胞的凋亡率。结果经PCR技术鉴定及DNA双向测序证实重组真核表达载体的序列无误，并将此命名为pRNAT—U6．1—siEdg4。荧光显微镜下观察，转染后SKOV3细胞内有明显绿色荧光信号，转染率为64％；实时荧光定量PCR技术检测显示，转染后SKOV3细胞的Edg4 mRNA表达水平（0．05±0．01）明显低于转染前（0．29±0．04，P〈0．05）；SKOV3细胞上清液中LPA的含量，转染后明显低于转染前[分别为（3．0±1．0）、（7．5±2．2）μmol／L；P〈0．05]；流式细胞仪检测显示，转染后SKOV3细胞的凋亡率明显高于转染前（分别为53．38％、0．51％；P〈0．05）。结论本研究成功构建了针对人Edg4基因的siRNA真核表达载体，并能较高效转染SKOV3细胞，转染后能明显抑制SKOV3细胞中Edg4 mRNA的表达，诱导卵巢癌细胞凋亡。     

可用于卵巢癌诊断和术前治疗的核酸嵌合体的构建

目的:构建一种可用于卵巢癌诊断和术前治疗的核酸嵌合体。方法:设计一种癌抗原125（CA125）-Plk1嵌合体,培养OVCAR-3卵巢癌细胞,平均分成嵌合体组（加入1μl的CA125-Plk1嵌合体）、抗体组（加入1μl的CA125抗体）、对照组（加入1μl的0.9%氯化钠液）。流式细胞仪检测3组结合卵巢癌细胞能力;噻唑蓝（MTT）增殖实验检测3组卵巢癌细胞增殖的情况;Tunel染色检测嵌合体组和对照组卵巢癌细胞凋亡的情况。结果:流式细胞检测结果示,嵌合体组中CA125-Plk1嵌合体结合卵巢癌细胞的比例（83.67%）高于抗体组中CA125抗体与卵巢癌细胞结合比例（65.12%）和对照组与卵巢癌细胞结合比例（30.74%）,差异有统计学意义（P<0.05）;MTT检测结果显示,嵌合体组卵巢癌细胞的增殖率（32.60%）低于对照组（62.24%）和抗体组（57.99%）,差异均有统计学意义（P<0.05）;Tunel染色结果显示,嵌合体组卵巢癌细胞中可以见到SiRNA荧光表达,与对照组比较,嵌合体组卵巢癌细胞凋亡比例明显上升[（78.46±6.33）%vs（19.73±4.27）%],差异有统计学意义（P<0.05）。结论:CA125-Plk1嵌合体能特异性地结合卵巢癌细胞,通过抑制增殖和促凋亡,达到一个潜在的诊断和术前治疗作用。     

尖锐湿疣和假性湿疣病理组织学及人乳头瘤病毒DNA研究

应用免疫组化、核酸原位杂交和聚合酶链的（ＰＣＲ）等方法，对２７４例尖锐湿疣和假性湿疣病例的活检组织石蜡包埋标本，进行病理组织学和人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）６ｂ，１１ＤＮＡ及核壳抗原（ＨＰＶ－Ａｇ）的检测，结果：尖锐湿疣和假性湿疣表面上皮呈乳头状结构，尖锐湿疣有明显的基底细胞增生，上皮增厚，典型的挖空细胞，假性湿疣则无上述改变。尖锐湿疣组织中ＨＰＶ６ｂ，１１ＤＮＡ检测阳性率分别为：核酸原位杂交法８２．５     

妊娠肝内胆汁淤积症患者MDR3基因突变的研究

妊娠肝内胆汁淤积症（intrahepatic cholestasis of pregnancy, ICP）是妊娠期特发性疾病,患者可出现全身瘙痒、肝功能异常,部分伴有黄疸、血清总胆汁酸（TBA）水平升高.尽管ICP患者预后良好，但可发生胎儿早产、胎心率异常、羊水粪染、围产儿死亡率增加。近年来的研究证实，MDR3基因存在多个位点突变。且与ICP的发病有关。本研究采用PCR-单链构象多态性分析（PCR-SSCP）技术，检测ICP患者MDR3基因外显子的突变情况。现报道如下。     

穴位注射乙型肝炎免疫球蛋白阻断乙型肝炎病毒母婴传播的临床研究

目的探计乙型肝炎病毒（HBV）阳性孕妇孕期足三里穴位注射乙型肝炎免疫球蛋白（HBIG）预防HBV宫内感染的效果。方法2001年11月至2003年10月烟台毓璜顶医院将190例乙型肝炎表面抗原（HBsAg）阳性孕妇随机分为两组：足三里穴位注射组92例，于孕20、24、28、32、36周足三里穴位注射HBIG共5次，每次200IU。肌肉注射组98例，同剂量、同时间应用HBIG。采用酶联免疫法，检测用药前后孕妇血清及新生儿脐血清HBsAg、HBeAg及HBsAb，采用核酸扩增（PCR）荧光定量检测HBV-DNA含量。结果92例足三里穴位注射者，新生儿HBV官内感染8倒，宫内感染率为8．7％，低于肌肉注射组（P〈0．01）。穴位注射组新生儿脐血清HBsAb检出率显著高于肌肉注射组（P〈0.05）。穴位注射组临产前血清中HBV—DNA显著低于肌肉注射组（P〈0.05）．结论通过孕妇足三里穴位注射HBIG，可更有效地减少HBV的宫内感染，未发现任何副反应。     

FISH技术检测宫颈组织TERC基因扩增

目的应用荧光原位杂交技术（FISH）检测子宫颈病变组织中人端粒酶RNA（TERC）基因异常扩增的临床意义。方法应用双色荧光原位杂交技术（FISH）检测195例宫颈组织TERC基因的异常扩增。结果①195例各类宫颈病变中,慢性宫颈炎33例,ClN134例,CIN2/3（包括原位癌）37例,宫颈鳞状细胞癌30例,宫颈腺癌61例,用FISH检测TERC基因的阳性表达率分别是3.03%（1/33）、29.41%（10/34）、72.97%（27/37）、100%（30/30）、91.80%（56/61）,子宫颈鳞癌与腺癌TERC基因的表达较宫颈上皮内瘤变各组差异有统计学意义（P〈0.05）。TERC基因的扩增阳性率随着宫颈病变程度增加呈逐渐上升趋势,且TERC扩增在子宫颈鳞癌与腺癌患者中无明显差异性;②TERC基因异常扩增与高危型HPV感染呈正相关。结论应用FISH技术检测TERC基因的异常扩增可以作为组织学诊断困难的病变确诊、病变预测及治疗后风险评估的手段。     

MDR1及MDR3基因沉默逆转卵巢上皮性癌细胞对紫杉醇耐药的实验研究

目的 研究多药耐药基因——MDR1及MDR3基因沉默逆转卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞A2780／taxol对紫杉醇耐药的作用。方法 用真核质粒介导的针对MDR 1及MDR3基因的短发夹状RNA（shRNA）转染A2780／taxol细胞（分别为MDR1组、MDR3组），空质粒转染作为对照（空载体组）。流式细胞仪分别检测细胞早期凋亡、罗丹明123（Rh123）积聚情况，末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸标记法（TUNEL）检测细胞晚期凋亡情况，四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测细胞对紫杉醇的半数抑制浓度（IC50），RT-PCR技术检测MDR1及MDR3mRNA的表达，蛋白印迹法（western blot）检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）蛋白的表达。结果转染后，MDR1组及MDR3组A2780／taxol细胞的早期凋亡率分别达（20．21±0．56）％和（10．87±1．24）％。MDR1、MDR3组A2780／taxol细胞内的Rh123平均荧光强度分别为116．6±8．1、98．4±3．8，显著高于空载体组的40．2±1．6，差异有统计学意义（P〈0．05）。TUNEL检测显示细胞发生了晚期凋亡。MDR1、MDR3组A2780／taxol细胞对紫杉醇的IC50明显下降，分别与空载体组比较，差异均有统计学意义（P〈0．05）。转染48h后，A2780／taxol细胞中MDR1和MDR3mRNA的表达水平分别下降了（73．3±0．8）％和（51．6±0．4）％；MDR1、MDR3组细胞caspase-3的表达量分别为（80．8±2．6）％、（72．0±4．7）％，均较空载体组增加。结论 MDR1及MDR3基因沉默能恢复A2780／taxol细胞对紫杉醇的敏感性并诱导细胞凋亡，从而逆转A2780／taxol细胞对紫杉醇的耐药性。     

实时荧光定量PCR检测细菌方法的建立及其临床应用

目的 探索快速可靠的新生儿败血症和化脓性脑膜炎诊断的新方法及其临床运用。方法 用自行设计的细菌16S rRNA基因高度保守区的引物和探针，对19种标准菌株、3种病毒株、新型隐球菌及白色念珠菌、人基因组DNA，以及疑似败血症的临床血标本、脑脊液共195份进行荧光定量检测，并同时进行血或脑脊液培养的对照。结果 细菌荧光定量PCR具有较好的敏感性和特异性，最低能检测到10个拷贝的16S rRNA基因，即相当于1～2个细菌，与人基因组DNA、真菌及病毒等无交叉阳性反应；荧光定量PCR的细菌DNA检出率为12．8％（25／195），明显高于血培养的阳性率7．1％（15／195，P〈0．01）。结论 应用通用引物和探针的荧光定量PCR扩增诊断败血症的方法检测快速、敏感性和特异性高，具有较大的推广及应用价值。     

中国子宫颈癌筛查指南（一）

结合我国子宫颈上皮内病变和子宫颈癌发病情况,以及全球筛查策略,为实现消除子宫颈癌的目标,我国七个学（协）会专家共同制定了子宫颈癌筛查指南。本指南推荐高危型HPV核酸检测作为子宫颈癌的初筛方法,并采用经国内外权威机构认可、经临床验证可用于初筛的HPV核酸检测方法和试剂。子宫颈细胞学筛查用于不具备HPV核酸检测条件的地区,当条件成熟后,采用基于HPV核酸检测的筛查方法。联合筛查用于医疗卫生资源充足地区、机会性筛查人群以及部分特殊人群女性的子宫颈癌筛查。25岁女性为筛查起始年龄,25～64岁女性,采用每5年一次的HPV核酸单独检测/联合筛查;或每3年一次细胞学检查。65岁以上女性,如既往有充分的阴性筛查记录,可终止筛查。对不同特殊人群提出相应的筛查方案。     

多色荧光原位杂交技术的临床检验的应用

目的：探讨多色荧光原位杂交技术在来源不明的额外标记染色体或者衍生染色体中的检测应用;方法：采用多色荧光原位杂交技术、NOR技术以及G显带技术对来源不明的额外标记染色体病例1例以及衍生染色体病例2进行检测;结果：经过检测病例1的染色体片段来源于15号染色体,核型为47,XY,der（5）t（4,5）（q26;q33）,病例2核型为46,XY,inv（7）（p11q14）,＋SMC（15）;结论：多色荧光原位杂交技术与细胞遗传学核型分析相结合,能够有效的对来源不明的标记染色体和衍生染色体进行检测。     

核酸探针斑点杂交法检测沙眼衣原体

核酸探针斑点杂交法检测沙眼衣原体朱全胜，刘新琼，丘钜世，梅卓贤，邓明会非淋菌性尿道炎（ＮＧＵ）的病原体，据国外报道，沙眼衣原体占５０％［１］，国内尚缺乏大宗流行病学资料。本研究采用地高辛标记的沙眼衣原体ＤＮＡ探针进行斑点杂交试验（斑点杂交法），以细胞...     

儿童急性呼吸道感染病毒感染特点分析

摘要：目的　分析儿童急性呼吸道感染患儿腺病毒（AdV）感染特点。方法　2009年5月至2009年6月北京儿童医院门诊急性呼吸道感染患儿共492例,入选患儿在就诊当日采集咽拭子标本1份,采用逆转录（RT）-PCR方法进行常见呼吸道病毒核酸检测,包括呼吸道合胞病毒（RSV）,鼻病毒（RV）,副流感病毒（PIV）1-4型,流感病毒甲型及乙型（IFA、IFB）,腺病毒（AdV）,肠道病毒（EV）,人冠状病毒（HCoV）,人偏肺病毒（HMPV）及人博卡病毒（HBoV）。AdV核酸扩增阳性片段进行克隆测序,对序列进行Blast和进化分析以对AdV进行分型。结果　492例急性呼吸道感染患儿的咽拭子标本中,165例检出至少1种病毒,总阳性检出率为33.5％。其中53份检出AdV,检出率为10.8％,在所有检出病毒中阳性率最高。53份AdV阳性标本中共检出3个亚组,7个血清型,以3型（23/53）为主,其次是7（8/53）型和1型（7/53）。结论　2009年春季北京地区AdV有多个血清型流行,以3型为主。AdV仍然是儿童呼吸道感染的重要病原。     

儿童过敏性哮喘尘螨特异性免疫治疗中干扰素-γ白介素4 T-bet和GATA-3 mRNA表达变化的研究

目的　探讨在过敏性哮喘尘螨特异性免疫治疗（SIT）过程中，与TH1/TH2细胞分化相关的干扰素-γ（IFN-γ）、白介素4（IL-4）、T-bet和GATA-3 mRNA 在外周血单个核细胞（PBMCs）中表达的变化。方法 根据进行抗原特异性免疫治疗（SIT）的时间，采集郑州大学第一附属医院儿科门诊2007年11月至2008年9月 收治的过敏性哮喘患儿36例，对其SIT治疗前、治疗16周后和治疗1年后的外周静脉血分离外周血单个核细胞，提取总RNA，逆转录成cDNA，利用SYBR GreenⅠ荧光 定量PCR的方法检测每组中IFN-γ、IL-4、T-bet和GATA-3 mRNA表达情况。同时，观察患儿治疗前后的临床疗效。结果 随着SIT治疗的进行，患儿临床症状明显 减轻，外周血中在mRNA表达水平IFN-γ/IL-4和T-bet/GATA-3的比值逐渐升高。结论 哮喘患儿特异性免疫治疗有效；治疗后TH1/TH2细胞的失衡得到一定的纠正 ；T-bet和GATA-3转录因子在哮喘的发生和SIT治疗中起重要作用。     

宫颈病变中HPV16感染状况、微卫星不稳定性及错配修复基因表达的研究

目的通过检测HPV16、微卫星不稳定性（microsatellitein stability,MSI）和错配修复基因（hMLH1、hMSH2）的表达,探讨三者在宫颈病变进展中的作用及意义。方法将宫颈病变组织分为宫颈炎、宫颈上皮内瘤变（cervicalintraepithelialneoplasia,CIN）CIN1、CIN2～CIN3、宫颈癌4组。用PCR方法检测HPV16感染状况,用聚合酶链-单链构象多态性分析方法检测宫颈组织中MSI的表达,采用免疫组织化学SP法来检测宫颈组织中的hMLH1和hMSH2的表达,并分析三者的相关性。结果CIN120例中25.0%（5/20）检测到HPV16,CIN2～CIN331中54.8%（17/31）检测到HPV16,二者比较χ2=4.413,P=0.034;宫颈癌中各期HPV16感染比较,差异均无统计学意义。选取的三个微卫星位点D3S2832E、RH91127和SHGC-56838均在宫颈炎中未检测到MSI,在CIN和宫颈癌中均检测到MSI的存在。但总体的表达率较低,最高只有46.7%。错配修复基因的低表达检测结果和MSI的检测结果一致,唯一不同的是前者的总体表达率较高,最高的低表达率为80%;宫颈病变中MSI与错配修复基因（本文即hMLH1、hMSH2）蛋白低表达及HPV16为正相关。结论HPV16的感染导致错配修复基因的低表达,进一步引起微卫星不稳定性,可能是宫颈癌发生、发展的重要机制,HPV16、微卫星不稳定性和错配修复基因有望作为宫颈癌高危人群的检测指标。     

人卵巢癌p53基因5—8外显子的突变及其临床意义

目的：检测人卵巢癌Ｐ５３基因突变并探讨其临床病理特征的关系。方法：用非同位素的聚合酶链反应方法－单链构象多态（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）银染技术，检测４１例原发性卵巢癌Ｐ５３基因外显子５－８的突变。结果：检出突变１７例（４１．５％）；突变是年龄、病理分期、组织学类型无关，与分化程度、淋巴结转移有关。结论：卵巢癌Ｐ５３基因突变率较高。Ｐ５３基因突谈卵巢癌发生过程中的早期事件，可作为早期诊断和判断预后的检测指     

慢病毒转染自杀基因后联合更昔洛韦治疗卵巢上皮性癌的实验研究

目的：探讨以抗Ⅰ型粘蛋白单链抗体（anti-MUC1)为靶向的慢病毒高效转染自杀基因后联合更昔洛韦（GCV）对Ⅰ型粘蛋白阳性（MUC1^ ）卵 巢上皮性癌细胞的靶向性基因治疗。方法：包装以anti-MUC1为靶向的慢病毒,介导单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV－tk)基因转染卵巢上皮性癌细胞株SKOV3（MUC1^ ）及正常戊纤维细胞GF（MUC1^-）,荧光显微镜下观察转染效果,聚合酶链反应（PCR）、逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）技术鉴定HSF－tk基因在靶细胞（SKOV3及GF）中的整合转录结果。学显微镜观察GCV作用后细胞形态变化,用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定GCV的体外杀伤效应。结果：荧光显微镜下观察到以anti-MUC1为靶向的慢病毒可有效转染SKOV3细胞,PCR、RT－PCR均证明HSF－tk基因已有靶细胞SKOV3中整合且转录表达;而在GF细胞中未见HSF－tk基因的整合及转录表达,光学显微镜下观察到HSF－tk基因康后的细胞在GCV作用后出现明显形态变化;MTT法显示GCV对转染HSF－tk基因后的SKOV3细胞有显著杀伤的作用,其半数抑制浓度为0．10mg/L.结论：以anti-MUC1为靶向的慢病毒可将HSF－tk基因高效、靶向性转染MUC1^ 卵巢上皮性癌细胞,联合应用GVC可高效、靶向性杀伤MUC1^ 卵巢上皮性癌细胞。     

Turner综合征Y染色体物质嵌合分子遗传学研究

摘要：目的　分析Turner综合征（TS）患儿Y染色体物质及衍生物嵌合发生的情况，为TS患儿诊断后的监测提供科学建议，改善国内TS监测和保健管理的现状。方法　选取2006年2月至2007年8月在重庆医科大学附属儿童医院诊断为TS患儿30例，进行基因组DNA 的Y编码睾丸特异性蛋白基因（TSPY）、 Y染色体中心着丝粒DYZ3重复序列（DYZ3 ）和Y性别决定区域（SRY）3个Y染色体特异序列多聚酶链反应（PCR）检测，反应结果阳性的病例补充SRY探针原位荧光杂交（FISH）分析。结果　基因组DNA 的PCR结果显示，3例患儿的TSPY、 DYZ3扩增均为阳性（10.00%），其中只有1例 SRY 扩增阳性（3.33%）；3例Y染色体物质阳性病例进一步进行FISH研究，结果显示3例SRY杂交信号均为阳性。结论　运用3个Y染色体特异序列的分子遗传学研究，证实Y染色体物质嵌合在TS不少见，每一个TS患儿都应在诊断后进行Y染色体物质的分子遗传学监测。     

定量检测孕妇血浆中胎儿DNA在产前诊断的应用

目的探讨应用荧光定量PCR技术检测孕妇血浆中胎儿DNA量，了解胎儿DNA和母体DNA随孕周增长的变化，为将来应用于非创性产前诊断做临床前期研究。方法选择妊娠7～42周，B超确诊为单胎的孕妇58例，使用DNA试剂盒提取孕妇血浆中的胎儿DNA，用荧光定量PCR（FQ-PCR）技术测定血浆中β-actin基因和SRY基因的量。结果58例正常孕妇，有37例男性胎儿，检出率为100％。胎儿DNA的量在早孕组为9．08拷贝／ml（3．5～12．8），中孕组为45．41拷贝／ml（14．38～76．5），晚孕组为300．95拷贝／ml（84～840）。21例女性胎儿均未检出SRY基因。结论胎儿DNA随着孕周的增加而增长，母体血浆是进行无创性产前诊断的非常有价值的底物。     

RNA干扰对雄激素合成关键酶17α-羟化酶/17，20裂解酶作用

目的：探讨细胞色素P45017α-羟化酶/17，20裂解酶（CYP17）小干扰RNA（siRNA）对CYP17基因表达和多囊卵巢综合征（PCOS）卵泡膜细胞雄激素合成的抑制效果。方法：合成4条靶向CYP17基因的特异性siRNA和非特异性siRNA。将0．4μg携带报告基因增强型绿色荧光蛋白和CYP17基因的质粒和siRNA共转染入HeIJa细胞，荧光显微镜观察及流式细胞术检测绿色荧光蛋白的表达反映对CYP17表达的影响，筛选抑制效果最佳的siRNA。卵泡膜细胞取自PCOS患者和非PCOS妇女各5例，将筛选出的最佳CYP17siRNA以最佳浓度转染人卵泡膜细胞，荧光定量实时逆转录多聚酶链反应检测CYP17mRNA的表达，并且检测培养液中CYP17作用产物雄烯二酮和前体孕酮水平。结果：siRNA1221处理后。HeLa细胞中外源性CYP17的表达显著降低，抑制率达50％,卵泡膜细胞中CYP17mRNA水平和雄烯二酮产生降低．但与对照组比较，统计学上无显著差异。结论：RNA干扰技术可能提供一种PCOS高雄激素基因治疗的新方法。     

人类胚胎活检和着床前遗传学诊断

1978年首例试管婴儿（IVF）的诞生标志着人类助孕技术新纪元的开端。传统IVF主要适合于输卵管阻塞性不孕症，近年，受人推崇的显微授精技术使男性不育的治疗有了突破性进展[1，2]。在此基础上，胚胎活检和分子生物学技术的结合，又开拓了着床前遗传学诊断（preim－plantationgeneticdiagnosis，PGD）的崭新领域[3]。欲从1～2个细胞中获得准确的信息，必须采用高灵敏度和特异性的检测方法。多聚酶链反应（polyrnerasechainreaction，PCR）和荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization，FISH）能基本满足此要求[4]。PCR主要用于…